經(jīng)典藏藥如意珍寶片多次給藥的藥代動力學(xué)研究

侯紅平 王彩霞 彭 博 李 冰 劉榮霞 陳騰飛 李 峰 車向宜 宋 玲 高云航 楊 慶 羅 倩 葉祖光 張廣平

(1 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所,北京,100029; 2 煙臺賽普特檢測服務(wù)有限公司,煙臺,264005;3 山東煙臺大學(xué),煙臺,264005; 4 甘肅奇正藏藥有限公司,北京,100102)

根植于高原的藏族醫(yī)藥(以下簡稱為藏醫(yī)藥)學(xué)是世界傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)寶庫的重要組成部分,是世界上最古老的傳統(tǒng)醫(yī)藥體系之一,源于西藏,關(guān)于其文字記載始于1 300多年前。現(xiàn)代藏藥應(yīng)用的地域除西藏自治區(qū)外,還包括青海、內(nèi)蒙古、四川、云南等地所屬的一些自治區(qū)和縣。傳統(tǒng)藏醫(yī)藥在腦卒中、阿爾茨海默病、癲癇、血管神經(jīng)性頭痛等疾病中構(gòu)建了對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的整體認識及辨證用藥規(guī)律[1-3],在現(xiàn)代藏醫(yī)臨床診療中具有較高的使用頻率。采用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)方法和手段,解析經(jīng)典藏醫(yī)藥的特色和優(yōu)勢,不僅能夠展現(xiàn)其在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的臨床價值,而且補充現(xiàn)代醫(yī)療的不足。

珍寶類復(fù)方是藏醫(yī)家以名貴、珍稀藏藥材進行調(diào)配組合的經(jīng)典且獨特的配方形式。其中,如意珍寶片處方初見于13世紀藏醫(yī)藥學(xué)家仁青堅贊所著的《秘訣珍珠串》,收錄于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·藏藥》,也是藏醫(yī)中名貴的珍寶藥物之一,由珍珠母、紅花、人工麝香、決明子、肉豆蔻、訶子、余甘子、沉香等30味藥材組成;具有清熱醒腦、舒經(jīng)通絡(luò)、活血化瘀、促進血液循環(huán)的作用,主要用于治療藏醫(yī)中的白脈病,同時能夠改善癱瘓、口眼斜、通風(fēng)、關(guān)節(jié)不利等癥狀[4-5],廣泛應(yīng)用于臨床。

目前,基于藏醫(yī)理論的研究基礎(chǔ)較為薄弱,未形成精準臨床定位并形成合理用藥規(guī)范。本研究以如意珍寶片范例,采用現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)和高效液相色譜技術(shù)的聯(lián)合分析,探討如意珍寶片多次給藥的藥代動力學(xué)特征和組織分布,尋找其藥物代謝的規(guī)律和特點,為藏醫(yī)藥的精準定位和臨床的合理用藥提供依據(jù),對藏醫(yī)藥的發(fā)展具有重要的作用。

1 材料

1.1 動物 斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠,體質(zhì)量150～170 g,5～6周齡,購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,SCXK(京)2016-0011。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所實驗動物屏障環(huán)境(SPF級)中,SYXK(京)2019-0003。飼養(yǎng)條件：屏障環(huán)境溫度20～24 ℃,相對濕度45%～65%,12 h/12 h光照與黑暗交替進行。所有實驗操作均獲得中藥研究所動物倫理委員會的許可(倫理審批號：2020B134)。

1.2 藥物 如意珍寶片(奇正藏藥股份有限公司,批號：2004007)。

1.3 試劑與儀器 沉香四醇(成都普思生物科技股份有限公司,批號：PU0295-0025,純度99.7%),胡椒堿(大連美侖生物技術(shù)有限公司,批號：A0528AS,純度99.0%),異甘草素(上海麥克林生化科技有限公司,批號：C10987045,純度99.2%),阿魏酸(上海麥克林生化科技有限公司,批號：C11347527,純度99.2%),伏立諾他(上海麥克林生化科技有限公司,批號：C11120592,純度98.7%)等。超高效液相色譜系統(tǒng)(Waters公司,美國,型號：ACQUITY UPLC H-CLASS),質(zhì)譜系統(tǒng)(SCIEX公司,美國,型號：6500+),分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司,瑞士,型號：METTLER TOLEDO XPE205),離心機(艾本德股份公司,德國,型號：5427R),渦旋混合儀(IKA公司,德國,型號：VORTEX2)。

2 方法

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18,2.1×100 mm I.D.,1.7 μm粒徑。預(yù)柱：ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard Pre-column,130 ?,1.7 μm,2.1 mm×5 mm。流動相A(Mobile PhaseA：MPA)：5 mmol/L甲酸銨水溶液(含0.1%甲酸)。流動相B(Mobile PhaseB：MPB)：甲醇。柱溫箱溫度(Column Temperature)：40 ℃。流速(Flow Rate)：0.300 mL/min。自動進樣器溫度：4 ℃。進樣體積(Injection Volume)：5.00 μL[6]。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子化(Electrospray Ionization,ESI)。離子化模式(Ionization Mode)：正/負(Positive/Negative)離子模式。監(jiān)測模式(Mode)：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。電噴霧電壓(Ion Spray Voltage)：5 500 V/-4 500 V。離子噴霧溫度(Ion Spray Temp)：450 ℃。氣簾氣種類(Curtain Gas Type)：氮氣設(shè)置(Nitrogen Setting),35.0 psi。霧化氣種類(Nebulizing Gas,Gas1)：Nitrogen Setting,50.0 psi。輔助氣種類(Auxiliary Gas,Gas 2)：Nitrogen Setting,50.0 psi。數(shù)據(jù)采集時間(Acquisition Time)：10.0 min[6]。

表1 不同分析物的分析條件

2.2 標準曲線制備 取空白大鼠血漿45.0 μL于2.0 mL離心管中,加入標準系列溶液或質(zhì)控溶液5.00 μL,渦旋10 s混合均勻,使血漿中的胡椒堿和異甘草素濃度分別相當于0.100、0.500、1.00、4.00、10.0、40.0、100、200 ng/mL,沉香四醇、阿魏酸濃度相當于0.500、2.50、5.00、20.0、50.0、200、500、1 000 ng/mL或異甘草素、胡椒堿濃度相當于0.300、1.50、15.0、150 ng/mL;沉香四醇、阿魏酸濃度相當于1.50、7.50、75.0、750 ng/mL,按上述操作,經(jīng)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(High Performance Liquid Chromatography-tandem mass Spectrometry,HPLC-MS/MS)分析。

2.3 線性關(guān)系考察 按照上述方法制備校正標樣。

2.4 精密度試驗 按照上述方法配制高濃度質(zhì)控樣品(High-concentration Quality Control,HQC)、中濃度質(zhì)控樣品(Middle-concentration Quality Control,MQC)、低濃度質(zhì)控樣品(Low-concentration Quality Control,LQC)及定量下限(Lower Limit of Quantitative,LLOQ)4個濃度的血漿樣品,進行準確度和精密度實驗(n=6)。批間精密度實驗時,3 d內(nèi)進行上述實驗3批次,計算n=18的精密度。

2.5 穩(wěn)定性試驗 考察大鼠血漿樣品室溫放置6 h、樣品經(jīng)處理后自動進樣器放置24 h、3次冷凍-解凍循環(huán)(-80 ℃,12 h)、在-80 ℃下4個月后待測物的穩(wěn)定性以及對照品儲備液2～8 ℃ 2個月內(nèi)穩(wěn)定性。

2.6 血漿樣品處理 取大鼠血漿樣品50.0 μL于2.0 mL離心管中,加入含有內(nèi)標的甲醇溶液(80.0 ng/mL)150 μL,渦旋1 min,離心15 min(12 700 r/min,4 ℃,離心半徑：20 cm),取上清100 μL于2.0 mL離心管中,加水50.0 μL稀釋,渦旋1 min,取上清100 μL于進樣小瓶中,經(jīng)LC-MS/MS分析。

2.7 給藥方法與血樣采集 SD大鼠12只,雌雄各半,按體質(zhì)量隨機分層方法,分為2組,對照組和觀察組(最大給藥劑量,6.00 g/kg),連續(xù)給藥7 d,在最后一次給藥前0 min及給藥開始后0.25、0.5、0.75、1、2、4、8、24、48 h眼眶采血,肝素抗凝,4 ℃,10 000 r/mim(離心半徑：20 cm)離心2 min,分裝血漿,-80 ℃凍存。

2.8 數(shù)據(jù)處理及分析 數(shù)據(jù)-圖譜積分方法：分析物和內(nèi)標的色譜圖采集由軟件Analyst 1.6.3完成,色譜峰積分由分析軟件MultiQuant 3.0.3(AB Sciex)進行處理,在優(yōu)化積分參數(shù)后,對目標色譜峰自動積分,不允許對色譜峰進行單獨積分或手動積分。分析物濃度計算：由分析軟件MultiQuant 3.0.3完成積分后,采用加權(quán)(W=1/x2)最小二乘法以血漿中分析物濃度(X)與峰面積比(Y)進行線性回歸,所得的回歸方程(Y=a+bX)即為標準曲線。根據(jù)分析批的標準曲線計算大鼠血漿中分析物的濃度,單位為ng/mL。應(yīng)用Phoenix WinNonlin(版本8.1.0.3530)的非房室模型模塊進行藥代參數(shù)計算[7]。統(tǒng)計分析基于主要藥動學(xué)參數(shù)(Cmax和AUC0-t)對數(shù)轉(zhuǎn)換后服從正態(tài)分布假設(shè),對轉(zhuǎn)換后的參數(shù)采用LEVENE檢驗進行方差齊性檢驗,當方差齊性(P>0.05),性別差異采用Student-t檢驗,劑量差異采用單因素方差分析,當方差不齊性(P≤0.05),性別差異采用Mann-WhitneyU檢驗(M-W法),劑量差異采用Kruskal-WallisH秩和檢驗進行統(tǒng)計分析,對于不服從正態(tài)分布的其他藥動學(xué)參數(shù),性別差異采用Mann-WhitneyU檢驗(M-W法),劑量差異采用Kruskal-WallisH秩和檢驗進行統(tǒng)計分析。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)評價

3.1.1 線性關(guān)系考察 胡椒堿和異甘草素在0.100～200 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2≥0.997),沉香四醇在0.500～1 000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2≥0.999),阿魏酸在2.50～1 000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2≥0.998)。至少75%的校正標樣(含最少6個有效濃度)的回算濃度在標示值的±13%以內(nèi),定量下限在±4%以內(nèi),方法靈敏度高、線性范圍寬,結(jié)果符合生物分析相關(guān)要求[6]。

3.1.2 精密度 分析結(jié)果表明方法準確度高、精密度好,結(jié)果符合生物分析相關(guān)要求[6]。

3.1.3 穩(wěn)定性 樣品室溫6 h內(nèi)穩(wěn)定,樣品經(jīng)處理后在自動進樣器放置24 h穩(wěn)定,樣品3次凍融循環(huán)穩(wěn)定,樣品-80 ℃ 4個月內(nèi)穩(wěn)定,對照品儲備液2～8 ℃ 2個月內(nèi)穩(wěn)定。

3.2 藥代動力學(xué)

3.2.1 4種成分的藥時曲線 大鼠連續(xù)7天灌胃給予如意珍寶片6.00 g/kg的體內(nèi)血漿中沉香四醇、異甘草素、胡椒堿、阿魏酸的平均藥時曲線。見圖1。

圖1 4種成分的藥時曲線

3.2.2 性別導(dǎo)致體內(nèi)藥代動力學(xué)參數(shù)的差異比較 經(jīng)統(tǒng)計分析,結(jié)果表明性別差異不會對沉香四醇、異甘草素和胡椒堿的藥動學(xué)參數(shù)產(chǎn)生影響(P>0.05)。而性別差異會對阿魏酸的Cmax、AUC0-t產(chǎn)生影響(P<0.01或P<0.001),不會對Tmax產(chǎn)生影響(P>0.05)。見表2。

表2 性別導(dǎo)致體內(nèi)藥代動力學(xué)參數(shù)的差異比較

4 討論

如意珍寶丸,又名“桑培奴布日布”,是藏醫(yī)名貴珍寶藥物之一,由珍珠母、沉香、金礞石、紅花等30味藏藥材組成,具有清熱、醒腦開竅、舒筋活絡(luò)等功效,主要用于治療溫?zé)岵?、陳舊熱證、白脈病、偏癱、口眼斜等病癥[8-10]?，F(xiàn)代藥理研究表明,如意珍寶片能顯著提高血管性癡呆模型大鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平[11],可顯著改變硝酸甘油致偏頭痛模型大鼠腦電圖的異常頻段波,對偏頭痛的治療效果較好[12-13],同時可明顯降低急性血瘀模型大鼠血液中切變率黏度值、血漿黏度值、紅細胞聚集指數(shù)等[14]。

本研究根據(jù)如意珍寶片的藥材組成及前期進行的入血成分研究,選取來自于如意珍寶片的藥材中可能的活性成分[15-16],選取了沉香中的沉香四醇(C17H18O6),蓽茇中的胡椒堿(C17H19NO3)、降香中的異甘草素(C15H12O4)和甘草膏中的阿魏酸(C10H10O4)作為目標化合物,建立了4種化合物在血漿和組織中的含量檢測方法。

大鼠給予7 d連續(xù)灌胃如意珍寶片后,血漿中沉香四醇達峰時間大部分在1～8 h之間。阿魏酸血藥濃度在給藥間隔時間內(nèi)在體內(nèi)血藥濃度呈波動狀態(tài),推測主要的原因是食源性影響,大鼠在給藥同時食用可能含有阿魏酸的谷物飼料,導(dǎo)致阿魏酸在體內(nèi)血藥濃度呈波動狀態(tài)[17-20]。經(jīng)t檢驗和秩和檢驗分析,沉香四醇、異甘草素和胡椒堿在大鼠體內(nèi)主要藥動學(xué)參數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),阿魏酸在大鼠體內(nèi)主要藥動學(xué)參數(shù)(Cmax、AUC0-t)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

本研究通過前期方法學(xué)的建立和驗證,對經(jīng)典藏藥如意珍寶片的多次藥代動力學(xué)特征進行了解析,為藏藥藥代動力學(xué)方法的探索和建立提供了示范,不但對臨床應(yīng)用有一定的指導(dǎo)作用,同時加快對藏藥理論和藥物的研究歷程,具有重要的價值和意義。

利益沖突聲明：無。