氮氧化SODm/COm的設(shè)計與合成及其體外活性

宋明 王維 李智慧 康祎璠 黃文歡

文章編號：2096-398X2024）03-0106-06

（陜西科技大學 化學與化工學院， 陜西 西安 710021）

摘 要：基于對天然Cun-SOD酶的分析，本文選取功能氮氧化異煙酸HINO）配體與過渡金屬CuII）通過混合溶劑熱法合成了一例兼具雙酶活性的配合物1，［Cu4Hino）4OH）2SO4H2O）4］n.通過單晶X-射線衍射儀SC-XRD）、粉末X-射線衍射儀PXRD）和傅里葉紅外光譜儀FTIR）等對其進行系統(tǒng)的表征.NBT光還原法（NBT，氯化硝基四氮唑藍）測試顯示，配合物1的IC50值為0.43 μmol/L，表明其具有優(yōu)良的抗氧化性能.同時，體外兒茶酚酶模擬測試，配合物1的kcat值為3.166×103 h-1，可作為中等強度的酶催化劑.

關(guān)鍵詞：氮氧化物； 配位聚合物； SOD； 兒茶酚酶活性

中圖分類號：O614.24+1??? 文獻標志碼： A

Design and synthesis of N-oxide SODm/COm and its vitro activity

SONG Ming， WANG Wei， LI hi-hui， ANG Yi-fan， HUANG Wen-huan*

College of Chemistry and Chemical Engineering， Shaanxi University of Science & Techology， Xi′an 710021， China）

Abstract：Based on the analysis of the natural Cun-SOD enzyme，a double enzyme complex 1，［Cu4Hino）4OH）2SO4H2O）4］n，was synthesized by mixing the Hino ligand with the transition metal CuII）.It was systematically characterized by SC-XRD，PXRD and FTIR.NBT photoreduction assay NBT） showed that the IC50 value of complex 1 was 0.43μmol/L，indicating that complex 1 had excellent antioxidant properties.In vitro simulation of catecholase，the kcat value of complex 1 was 3.166×103 h-1，which can be used as a medium strength enzyme catalyst.

Key words：nitrogen oxides; coordination polymer; superoxide dismutase; catecholase activity

0 引言

在需氧生命體的新陳代謝過程中，大約有5%以上吸入的氧在生命體內(nèi)通過單電子還原產(chǎn)生化學性質(zhì)活潑的物質(zhì)——活性氧（Reactive oxygen species，ROS）［1，2］.ROS具有高度的活性與極強的氧化反應(yīng)能力，適量的ROS可作為細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達調(diào)控分子，調(diào)控細胞的生長、生存和凋亡；但過多的ROS就會有破壞作用，大量的自由基通過氧化作用來攻擊所遇到的任何分子，使機體內(nèi)大分子物質(zhì)產(chǎn)生過氧化變性、交聯(lián)或斷裂，從而引起細胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，導(dǎo)致機體組織損害的器官退行性變化（衰老）或者癌變［3-5］.在生命系統(tǒng)中，SOD可以專一地清除耗氧過程中產(chǎn)生的超氧離子自由基，同時也協(xié)同谷胱甘肽過氧化物酶或過氧化氫酶一起徹底清除超氧離子自由基和H2O2等有害物種，因此在生命活動中扮演著極其重要的角色，常用于癌癥、炎癥、自身免疫性疾病及心肌缺血與缺血再灌注綜合癥等多種疾病的臨床治療［6-8］.因此，SOD被醫(yī)學界譽為“人體清道夫”.

近幾十年，SOD一直是國內(nèi)外學者研究的熱點.但其研究大多集中于從動物血液或臟器中提取SOD，易受原料來源、產(chǎn)品得率、穩(wěn)定性及安全性等方面的限制.同時天然SOD因相對分子質(zhì)量大，穩(wěn)定性差，在血液中半衰期短，且長期注射使用可誘發(fā)免疫和過敏反應(yīng)等問題，在臨床應(yīng)用上受到極大的限制［9，10］.因此，人工合成的活性小分子模擬天然SOD的催化功能及相關(guān)改性研究具有非常重要的研究意義.結(jié)合配位聚合物的特點，通過大量文獻的調(diào)研分析，我們發(fā)現(xiàn)通過活性基團的引入來產(chǎn)生特殊的相互作用等方法合成具有優(yōu)異SOD活性的功能化配合聚合物是非常有效的一種做法.在本文中，作者利用氮氧化功能有機配體異煙酸成功合成出了一例銅基模擬酶，并探究了其在體外的超氧化物歧化酶活性和兒茶酚酶活性.

1 實驗部分

1.1 儀器和材料

1.1.1 主要材料

異煙酸，分析純，上海麥克林生化科技有限公司；核黃素，分析純，上海藍季科技發(fā)展有限公司；氯化硝基四氮唑藍NBT），分析純，上海易恩化學技術(shù)有限公司；DL-甲硫氨酸，分析純，上海新鉑化學技術(shù)有限公司；3，5-二叔丁基鄰苯二酚3，5-DTBC），分析純，上海笛柏生物科技有限公司；磷酸二氫鈉，分析純，磷酸二氫鈉，分析純，甲醇，分析純，冰醋酸，分析純，天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠.

1.1.2 主要儀器

單晶X-射線衍射儀（Bruker D8 Quest），傅里葉紅外光譜儀（VECTOR-22），德國Bruker公司；粉末X-射線衍射儀（Rigaku RU 200），日本Rigaku公司；熱重分析儀（BETSCH STA449C），德國Netzsch公司；紫外可見分光光度計（Cary100 UV-Vis），美國Agilent公司；手提式紫外分析儀（F-5），上海力辰邦西儀器科技有限公司.

1.2 配合物1 ［Cu4Hino）4OH）2SO4H2O）4］n的制備

在25 mL聚四氟乙烯反應(yīng)釜中加入五水合硫酸銅0.074 9 g，0.3 mmol）和氮氧化異煙酸配體0.041 7 g，0.3 mmol），加入甲醇∶水=2∶1的混合溶劑，調(diào)節(jié)混合溶劑pH值為7～8.室溫攪拌30 min后，將反應(yīng)釜在100 ℃條件下反應(yīng)24 h，自然冷卻至室溫，得到綠色塊狀晶體，產(chǎn)率：44 %（基于HINO）.分子式為C24H26Cu4N4O22S11 008.72），元素分析%），理論計算值：C：28.58; H：2.60; N：5.55;實測值：C：28.94; H，2.88; N：5.21.

1.3 配合物1的晶體結(jié)構(gòu)測定

將所合成的晶體挑選出大小適中、表面無裂紋的單晶置于Bruker D8 Quest單晶X-射線衍射儀上，以ω-2θ掃描方式，收集衍射數(shù)據(jù)，全部強度數(shù)據(jù)經(jīng)Lp校正和吸收校正SADABS）.配合物的晶體結(jié)構(gòu)采用程序SHELXL-14由直接法解得.全部非氫原子經(jīng)Fourier合成及差值電子密度函數(shù)修正，全部氫原子坐標從差值電子密度函數(shù)并結(jié)合幾何分析獲得.全部非氫原子坐標以及各向異性溫度因子和氫原子坐標以及各向同性溫度因子經(jīng)最小二乘法修正至收斂.全部解析均采用SHELXS-14和SHELXL-14解析程序包完成.配合物的晶體學數(shù)據(jù)如表1所示.

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物1的晶體結(jié)構(gòu)

通過X-射線單晶衍射分析可知，該配合物為單斜晶系，屬于C2/c空間群.配合物1的分子堆積如圖1所示，單體四核結(jié)構(gòu)單元為船式結(jié)構(gòu)，其頂部是硫酸鹽基團，兩側(cè)是吡啶環(huán).所有銅原子均呈現(xiàn)出金字塔形的四方錐構(gòu)型，Cul與氮氧化異煙酸羧基氧O2和O5以及在基底平面上μ3-OH氧配位，鍵長范圍為1.92～1.99 ，軸向Cul-O8鍵長為1.98 ，基底平面上Cul-O1的鍵長為2.15 .Cu2的配位構(gòu)型中含有μ3-OH中的O1，羧基氧O6和O3和兩個參與配位的水分子O10和O11，鍵長范圍為1.94～1.99 ，與基底平面上的Cul-O鍵長相對應(yīng).兩個μ3-OH基團以特殊的橋連方式將結(jié)構(gòu)單元中的兩個未配位的半部結(jié)構(gòu)連接在一起.Cu-μ3-OH的鍵長范圍為1.94～1.99 ，Cul-O1-CulB鍵角為92.2 °，Cu2-O1-Cul鍵角為117.1 °.在結(jié)構(gòu)單元的分子中心有一個Cu-O組成的四元環(huán).OlB-Cul-O1和CulB-O1-Cul的鍵角分別為82.3 °和92.2 °.該環(huán)被折疊，使O1在Cul，O5和O2的最小二乘平面下方為0.53 ，Cul-Cu1B距離較短，鍵長為2.86［11-13］.

氮氧化異煙酸充當橋連配體，通過羧基氧原子O5和O6雙齒配位分別橋接兩個銅原子Cul和Cu2.N-O基團中的O原子不參與CuII）原子配位，但和參與配位的水分子形成氫鍵.硫酸基團中的S原子位于空間結(jié)構(gòu)的特殊位置，在銅原子Cul和CulB之間起雙齒橋的作用.四個五配位的銅原子通過四個HINO的羧基、兩個μ3-OH和一個橋連的雙齒硫酸基團連接在一起，在結(jié)構(gòu)單元的中心可以看到Cu2O4S組成的籠狀結(jié)構(gòu).

2.2 配合物1的P-XRD分析

在2θ為5 °～50 °范圍內(nèi)，配合物的PXRD圖譜與單晶結(jié)構(gòu)模擬的圖譜如圖2所示.兩者的主要出峰位置和強度基本吻合，說明所合成配位物均為純相，可以滿足后續(xù)的性質(zhì)表征及SOD活性測試.

2.3 配合物1的熱穩(wěn)定性分析

配合物在N2條件、10 ℃/min升溫速率下的熱重曲線如圖3所示.從室溫到126 ℃的質(zhì)量損失為1.60 %，與1個溶劑水分子的理論損失1.75 %相對應(yīng).從126 ℃到200 ℃的質(zhì)量損失為3.16 %與2個配位水分子的理論損失3.51%相對應(yīng).該配合物穩(wěn)定在220 ℃，隨著溫度的繼續(xù)上升，配體分解，配合物骨架坍塌.

2.4 配合物1的紅外光譜分析

以Br為基質(zhì)，在4 000～500 cm-1范圍內(nèi)測定了配合物的FTIR光譜，如圖4所示.配合物紅外光譜的主要數(shù)據(jù)為：3 320w），3 100w），1 626vs），1 554w），1 408vs），1 225s），1 075m），870w），780w），653m）.其中，在3 320和3 100 cm-1處的吸收峰為配位水分子中O-H的伸縮振動；在1 626 cm-1處的吸收峰為羧基中C=O的伸縮振動；在1 554 cm-1和1 408 cm-1處的吸收峰為吡啶環(huán)上C=C和C=N伸縮振動；在1 225 cm-1處的吸收峰為N→O基團的伸縮振動；在1 075 cm-1處的吸收峰為為μ3-OH上O-H的伸縮振動；在870 cm-1、780 cm-1和653 cm-1處的吸收峰為吡啶環(huán)上C-H的伸縮振動.

2.5 配合物1的紫外光譜分析

室溫下，配合物溶液的UV-Vis光譜如圖5所示.配合物溶液的紫外吸收波長范圍為278～330 nm，不同溶解時間下的紫外吸收強度基本一致，表明該配合物在溶液中具有較好的穩(wěn)定性.

2.6 配合物1作為SODm的活性研究

本文通過NBT光還原法對配合物1作為超氧化物歧化酶模擬物的抗氧化活性進行研究.用NaH2PO4·2H2O-Na2HPO4·12H2O配置pH=7.8、0.05 mol/L緩沖溶液.用緩沖液分別配制濃度為3.4×10-6 mol/L的核黃素溶液，0.01 mol/L的MET和4.7×10-5 mol/L的NBT溶液及含不同濃度的O·-2清除劑溶液.測試時，依次取3 mL溶液于恒定光強度下光照，測定在560 nm處不同光照時間后溶液的吸光度值A(chǔ)bs560 nm光照時間為20 s），每組測量100 s.用相同的方法測定不同濃度下配合物溶液的吸光度值A(chǔ)bs560 nm，每組讀數(shù)3次，取平均值.

用不同光照時間下配合物溶液的吸光度值A(chǔ)bs560 nm對光照時間t作圖，如圖6所示.直線的斜率=ΔAbs/Δt，表示配合物的濃度對NBT還原的抑制作用.0=0.009 05，1=0.005 14，2=0.004 15，3=0.003 34，4=0.002 28，5=0.001 6，6=0.001 05，其中，0為空白對照組.隨著配合物濃度的增加，直線的斜率逐漸變小，對NBT還原的抑制作用增強.

根據(jù)公式η=1-k/k0）*100%，η表示配合物溶液的濃度對NBT還原的抑制率.以配合物溶液的濃度作為橫坐標，抑制率作為縱坐標作圖，如圖7所示.其NBT還原的抑制率為50%的配合物溶液濃度為0.43 μmol/L.

模擬物對NBT還原的抑制率為50%的濃度（IC50值）代表了SOD模擬物抗氧化活性的強弱，IC50值的數(shù)值越小，表明SOD模擬物的抗氧化活性越好.配合物1與目前已報道的具有SOD活性的配合物相比，比顯出較好的抗氧化性能［14-17］.我們推測主要原因是配合物1中CuII）的配位構(gòu)型與天然Cun-SOD中CuII）的配位構(gòu)型相一致，均為五配位的四方錐構(gòu)型.同時，天然Cun-SOD酶一個結(jié)構(gòu)單元（亞基）中只含有1個CuII）配位構(gòu)型，配合物1一個結(jié)構(gòu)單元中同時含有四個CuII）配位構(gòu)型，能夠更快速地清除O·-2，更大程度地抑制O·-2對NBT的還原.其次，配體氮氧化異煙酸中N-O基團雖未參與CuII）配位，但N-O基團中的負電荷O-在O·-2的清除過程中通過電荷作用促進質(zhì)子H+與O·-2的反應(yīng)，增強配合物對O·-2的清除作用.

2.7 配合物1作為COm的活性研究

由于3，5-二叔丁基鄰苯二酚（3，5-DTBC）的苯環(huán)上連接了兩個叔丁基取代基，導(dǎo)致苯醌還原成鄰苯二酚的電位較低［18］.因此，很容易被氧化成性質(zhì)非常穩(wěn)定的鄰醌，即3，5-二叔丁基鄰苯二醌（3，5-DTBQ）.因此，以3，5-DTBC為底物，將1×10-4 mol L-1的配合物1加入到不同濃度的3，5-DTBC溶液中，在甲醇和水v/v=1∶1）均勻混合的介質(zhì)中評價了配合物1的類兒茶酚酶活性，并用紫外分光光度計監(jiān)測反應(yīng)的過程.

固定模擬物1的濃度為1×10-4 M，改變3，5-DTBC的濃度后的紫外光譜圖如圖8所示.從圖8（a）～（c）可以看出，隨著3，5-DTBC的濃度的提高，400 nm處的醌帶隨即增加，紫外吸收強度呈現(xiàn)濃度的依賴性.然而，從圖8（c）～（f）得到，3，5-DTBC的濃度的提高，對400 nm處的醌帶漲幅不大，說明3，5-DTBC的濃度高于4×10-3 M后，吸收強度幾乎不受濃度得影響.

3，5-DTBC和配合物混合后，從圖9中可以看到400 nm處的醌帶增加，紫外吸收強度呈現(xiàn)時間依賴式增強，直到它們的強度達到飽和，并且無色溶液逐漸變成深棕色，表明模擬物1催化3，5-DTBC轉(zhuǎn)化為3，5-DTBQ.由Lineweaver-Burk圖10計算可得配合物1的kcat值為：3.166×103 h-1，與文獻已報道的配合物相比，屬于中等效率的催化劑［19-22］.

3 結(jié)論

本文基于天然Cun-SOD模型，選取氮氧化功能有機配體異煙酸HINO）與五水合硫酸銅通過溶劑熱法合成了一例CuII）配位物，對其進行進行了系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)分析與表征，并探究了其在體外的超氧化物歧化酶活性和兒茶酚酶活性.實驗結(jié)果表明，該配合物同時兼具優(yōu)良的抗氧化活性（IC50值達0.43 μmol/L）和兒茶酚酶活性（kcat值為：3.166×103 h-1）.通過系統(tǒng)的構(gòu)效關(guān)系分析，以期通過上述研究為后續(xù)定向合成高效類酶模擬物提供一定的理論研究基礎(chǔ).

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【責任編輯：蔣亞儒】

基金項目：國家自然科學基金項目（21801161）； 中國博士后科學基金面上項目（2019M653524）； 陜西科技大學博士科研啟動基金項目（BJ15-35）； 西北大學合成與天然功能分子化學教育部重點實驗室開放基金項目（3380500672018-003））

作者簡介：宋 明（1997—），男，四川南充人，在讀碩士研究生，研究方向：電磁波吸收屏蔽的應(yīng)用

通訊作者：黃文歡（1987—），女，福建福州人，副教授，博士，研究方向：能源存貯及轉(zhuǎn)化、電磁波吸收屏蔽、固態(tài)電池關(guān)鍵材料的應(yīng)用，huangwenhuan@sust.edu.cn