冠突散囊菌GT-1固態(tài)發(fā)酵對低次煙葉品質的影響

李萌 曾婷婷 楊金初 徐永明 李歡 馬林 饒智

文章編號：2096-398X2024）03-0038-08

（1.鄭州輕工業(yè)大學 煙草科學與工程學院， 河南 鄭州 450001； 2.河南中煙工業(yè)有限責任公司 技術中心， 河南 鄭州 450000； 3.廣西中煙工業(yè)有限責任公司 柳州卷煙廠， 廣西 柳州 545001； 4.紅云紅河煙草（集團）有限責任公司， 云南 昆明 650202）

摘 要：為探究應用冠突散囊菌固態(tài)發(fā)酵提升低次煙葉品質的可行性，從茯磚茶中分離篩選冠突散囊菌并接種于低次煙葉進行固態(tài)發(fā)酵，通過感官評吸考察固態(tài)發(fā)酵對煙葉品質的影響，應用同時蒸餾萃取和GC/MS檢測固態(tài)發(fā)酵過程中1、3、5、7 d的煙葉主要致香成分的變化.結果表明，從茯磚茶中成功分離到候選菌株GT-1，經(jīng)形態(tài)和分子生物學鑒定確認為冠突散囊菌.將GT-1接種于低次煙葉進行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵5天煙葉感官質量最佳，香氣量、香氣質、濃度和余味較對照均有較為明顯改善.發(fā)酵煙葉中共檢測出33種主要致香成分，包含16種類胡蘿卜素降解產(chǎn)物、9種芳香族氨基酸轉化產(chǎn)物、1種葉綠素降解產(chǎn)物、1種類西柏烷降解產(chǎn)物、6種美拉德反應產(chǎn)物.隨著固態(tài)發(fā)酵時間的延長，煙葉主要致香成分總量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，致香成分總量在第5 d達到最高，為402.03 μg/g；相較于未發(fā)酵煙葉，致香成分含量提高了22.54%，其中4，7，9-巨豆三烯-3-酮、香葉基丙酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、苯甲醇、苯乙醇、2-乙?；量┑戎孪阄镔|含量顯著提高，極大的豐富了煙氣的甘甜香、煙草香、果香、花香等香氣.冠突散囊菌固態(tài)發(fā)酵可提高煙葉香氣物質含量和種類，有效提升低次煙葉品質.

關鍵詞：冠突散囊菌； 固態(tài)發(fā)酵； 低次煙葉； 致香成分； 發(fā)酵時間

中圖分類號：TS45; S572??? 文獻標志碼： A

Effect of the solid-state fermentation with Eurotium cristatum GT-1 on the quality of low-grade tobacco leaves

LI Meng1， ENG Ting-ting1， YANG Jin-chu2， XU Yong-ming2， LI Huan3， MA Lin1， RAO hi4*

1.College of Tobacco Science and Engineering， hengzhou University of Light Industry， hengzhou 450001， China; 2.Technology Center， China Tobacco Henan Industrial Co.， Ltd.， hengzhou 450000， China; 3.Liuzhou Cigarette Factory， China Tobacco Guangxi Industrial Co.， Ltd.， Liuzhou 545001， China; 4.Hongyun Honghe Tobacco（Group）Co.， Ltd.， unming 650202， China）

Abstract：To investigate the feasibility of solid-state fermentation of low-grade tobacco leaves with Eurotium cristatum，E.cristatum was isolated from Fuzhuan tea and inoculated into low-grade tobacco leaves for solid-state fermentation.Simultaneous distillation extraction and GC/MS were used to detect the changes in the main aroma components of tobacco leaves at 1，3，5，7 days during solid-state fermentation.Sensory evaluation was conducted to investigate the impact of solid-state fermentation time on tobacco quality.The candidate strain GT-1 was successfully isolated from Fuzhuan tea，and confirmed as E.cristatum by morphological and molecular identification.The results showed that the sensory quality of tobacco leaves was the best after fermentation for 5 days，and the aroma amount，concentration and aftertaste were significantly improved compared with untreated tobacco leaves.A total of 33 main aroma components were detected，including 16 carotenoid degradation products，9 aromatic amino acid conversion products，1 chlorophyll degradation product，1 of cembranoid degradation products，and 6 Maillard reaction products.With the extension of solid-state fermentation time，the total amount of main aroma components in tobacco leaves shows a trend of increasing and then decreasing.The total amount of aroma components reaches its highest point at 402.03 μg/g on the 5th day.Compared to the C，the content of aroma components increased by 22.54%.Among them，the content of aroma substances such as 4，7，9-macrostigmen-3-one，geranylacetone，dihydrokiwifruit lactone，benzyl alcohol，phenylethanol，and 2-acetylpyrrole were significantly increased，which greatly enriching the sweet，tobacco，fruit，flower aromas of the smoke.Solid-state fermentation with E.cristatum GT-1 can increase the content and variety of aromatic substances in tobacco leaves，and thus effectively improve the quality of low-grade tobacco leaves.

Key words：Eurotium cristatum； solid-state fermentation； low-grade tobacco leaves； aromatherogenic ingredients； fermentation time

0 引言

低次煙葉是卷煙生產(chǎn)過程中質量較差的煙葉，具有香氣量不足、雜氣重、刺激性強等缺點，難以在配方中應用或僅能用于低檔卷煙，如何提高低次煙葉的利用率是煙草行業(yè)中的研究熱點之一.煙葉固態(tài)發(fā)酵是提高煙葉品質的一個重要環(huán)節(jié)，相比于液態(tài)發(fā)酵，固態(tài)發(fā)酵是一種接近自然狀態(tài)下的發(fā)酵，發(fā)酵工藝簡單、穩(wěn)定，產(chǎn)物濃度高，發(fā)酵過程無廢水、廢氣產(chǎn)生［1］.微生物在煙草發(fā)酵過程中發(fā)揮重要作用，能夠降解低次煙葉中的糖類、蛋白質、纖維素等物質改善煙葉品質［2］.薛云等［3］利用芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵處理廣西河池C4F煙葉，發(fā)酵后煙葉香氣質有所改善，雜氣減小，提升了煙葉利用率.李萌等［4］通過混菌固態(tài)發(fā)酵低次煙葉發(fā)現(xiàn)，煙葉的揮發(fā)性致香成分含量增加，香氣質和香氣量得到提升，煙葉品質明顯改善.

冠突散囊菌Eurotium cristatum）俗稱“金花菌”，是茯磚茶發(fā)酵過程中的優(yōu)勢微生物［5］，能夠利用茶葉中的茶多酚、糖類等物質，同時分泌纖維素酶、蛋白酶、果膠酶等胞外酶促進茶葉物質的代謝，從而形成茯磚茶特有的香味［6-8］.此外，研究人員發(fā)現(xiàn)冠突散囊菌能夠通過調節(jié)微生物菌群依賴的色氨酸代謝來緩解結腸炎的結腸損傷，具有降血糖、抑菌的作用［9，10］.冠突散囊菌目前主要應用于茯磚茶及其它茶葉的固態(tài)發(fā)酵上［8，11］，在煙草中主要應用在液態(tài)發(fā)酵中［12，13］，在固態(tài)發(fā)酵中應用較少.因此，本研究從茯磚茶中篩選冠突散囊菌應用于低次煙葉固態(tài)發(fā)酵，并探究發(fā)酵時間對于煙葉品質的影響，評價冠突散囊菌固態(tài)發(fā)酵對煙葉增香和感官質量提升的效果，旨在發(fā)掘適用于卷煙增香的微生物，改善低次煙葉的吸食品質，為提升低次煙葉的工業(yè)可用性提供新的技術手段.

1 材料與方法

1.1 實驗原材料

低次煙葉由云南中煙工業(yè)有限責任公司提供；茯磚茶購自安化縣安榮茶業(yè)有限公司.

瓊脂粉（北京索萊寶科技有限公司）；氯化鈉（東京化成工業(yè)株式會社）；蛋白胨（成都普思生物科技有限公司）；牛肉膏（河南天孚化工有限公司）；酵母粉（中國醫(yī)藥集團上海化學試劑公司）；2×Taq Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；真菌基因組DNA提取試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成.

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g.將去皮馬鈴薯切成塊，加入1 000 mL去離子水，煮沸10～20 min，用紗布過濾后，加入蒸餾水至1 000 mL.將pH值調整為7.0，經(jīng)121 ℃，20 min 高壓滅菌后，倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，等待冷卻.

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（YPD）：葡萄糖2 g，蛋白胨2 g，酵母粉1 g，100 mL去離子水，調節(jié)pH值至7.0，121 ℃高壓滅菌20 min.

1.2 實驗儀器與設備

固態(tài)煙葉發(fā)酵反應艙（鄭州輕工業(yè)大學研制）；恒溫培養(yǎng)箱（濟南愛來寶儀器設備有限公司）；LX-C35L型立式自動電熱壓力蒸汽菌器（合肥華泰醫(yī)療設備有限公司）；小型勻漿機（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）；離心機（ThermoFisher賽默飛世爾科技公司）；PCR儀（AppliedBiosystems美國應用生物系統(tǒng)公司）；電泳儀（BIO-RAD伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司）.

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的分離純化及鑒定

稱取10 g茯磚茶葉于250 mL錐形瓶中，加入90 mL無菌水，于30 ℃、180 r/min條件下振蕩2 h后，將菌懸液稀釋成10-2～10-7的濃度梯度，均勻涂布在PDA平板中，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，待黃色“金花”狀的菌落長出后進行分離鑒定并保藏.

形態(tài)學鑒定：將分離純化得到的菌株進行活化，接種至PDA培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)至形成菌落，顯微鏡下觀察菌絲和孢子形態(tài).

分子生物學鑒定：應用試劑盒提取PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的單菌落菌株基因組DNA，以此為模板進行PCR擴增.引物為真菌鑒定通用引物ITS1 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）. PCR擴增體系（20 μL）為：2×Taq Master Mix 10 μL；上下游引物各0.5 μL；模板DNA 2 μL；ddH2O補足至20μL.PCR擴增條件為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸40 s，35 個循環(huán)；72 ℃再延伸7 min，4 ℃保存.擴增產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）有限責任公司測序，測序結果在NCBI（National Center of Biotechnology Information，美國國家生物信息技術中心）數(shù)據(jù)庫進行BLAST同源性比對，利用MEGA 7軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定菌株［14］.

1.3.2 固態(tài)發(fā)酵

將冠突散囊菌GT-1于PDA平板培養(yǎng)基上活化2次.超凈工作臺中用接種鏟刮取孢子于100 mL已滅菌帶有玻璃珠的無菌水內(nèi)，振搖20 min，用脫脂棉過濾到新的無菌燒瓶內(nèi)，制成均勻的孢子懸浮液，通過血球計數(shù)法［15］得到孢子懸浮液濃度為1×106 CFU/mL（該孢子懸浮液用于接種）.以上微生物實驗均無菌操作.動態(tài)固態(tài)發(fā)酵條件為GT-1接種量10%，濕度 70%，溫度28 ℃，轉速15 rpm/min.

試驗共分為原樣、對照組和處理組三組進行.原樣煙葉不接種GT-1，平衡48 h后直接制樣進行致香成分檢測和評吸.對照組煙葉不接種GT-1，平衡48 h后直接放入固態(tài)發(fā)酵反應艙中發(fā)酵7天，分別在1，3，5，7 d取出進行感官評吸.處理組煙葉平衡48 h后噴灑菌懸液，放入固態(tài)發(fā)酵反應艙中發(fā)酵7天，分別在第1、3、5、7 d取出進行感官評吸并測定煙葉揮發(fā)性致香成分含量.試驗均重復3次.

1.3.3 煙葉致香成分的測定

采用同時蒸餾萃取技術結合氣相色譜/質譜（GC/MS）聯(lián)用測定發(fā)酵煙葉揮發(fā)性致香成分［4］.將發(fā)酵后的煙葉在 40 ℃ 烘箱中干燥，粉碎機粉碎后過孔徑為 0.425 mm 篩.準確稱取 25 g 煙末樣品、30 g 氯化鈉和 200 mL水放入同時蒸餾萃取裝置一端的圓底燒瓶中，裝置的另一端盛有 60 mL 二氯甲烷，在 60 ℃下水浴加熱，同時蒸餾萃取 2.5 h.同時蒸餾萃取完成后，二氯甲烷萃取液用無水硫酸鈉干燥，4 ℃下靜置過夜，過濾，加入1 mL的內(nèi)標物（乙酸苯乙酯，二氯甲烷作為溶劑）后濃縮，萃取液濃縮不足 1 mL 時，用二氯甲烷定容至 1 mL，過0.22 μm 濾膜于 2.0 mL 的色譜瓶中，立即進行上機檢測.

GC/MS 檢測條件：色譜柱為HP-5MS60 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度280 ℃；載氣為高純氦氣；柱溫箱為程序升溫，起始溫度50 ℃保持1 min，以4 ℃/min升至148 ℃保持1 min，以2 ℃/min升至172 ℃保持1 min，以4 ℃/min升至280 ℃保持5 min；分流比5∶1；流速3.0 mL/min.離子源溫度230 ℃；四極桿溫度 150 ℃；EI 離子源 70 e V；質量掃描范圍35～550 amu；采用NIST 17檢索.

1.3.4 感官評吸

分別將未發(fā)酵煙葉、對照和接菌發(fā)酵煙葉切絲后進行卷制，置于溫度（22±1） ℃、相對濕度（60±2）%的恒溫恒濕箱中平衡48 h.由7 人組成的專業(yè)評吸小組根據(jù)國家標準 YC/T 138-1998［16］中的方法進行評吸，對抽吸結果進行感官質量評價.

1.4 數(shù)據(jù)分析

應用 Excel 2010處理原始數(shù)據(jù).應用SPSS 22.0 對試驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析和多重比較.

2 結果與討論

2.1 菌株的分離純化及鑒定

2.1.1 菌落形態(tài)特征分析

候選菌株GT-1接種在PDA培養(yǎng)基上生長良好，菌落表面致密，孢子呈黃色（圖1），與茶葉表面的“金花”形態(tài)類似.在100倍油鏡下觀察其菌株形態(tài)，該菌株孢子呈圓形，大部分聚集于菌絲頂端，與菌絲緊密相連，菌絲無隔膜（圖2）.

2.1.2 菌株分子生物學鑒定

從茯磚茶分離純化出的疑似冠突散囊菌的ITS 序列擴增產(chǎn)物的電泳結果如圖3所示（圖中M為Marker），在550 bp處有單一、明亮且清晰條帶.獲得的ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST同源性比對顯示，該菌株與冠突散囊菌（E.cristatum）的序列相似度度為100%.應用GT-1菌株和近緣菌株ITS序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4所示.GT-1菌株與冠突散囊菌聚為一支，結合菌落和孢子形態(tài)確定菌株GT-1為冠突散囊菌.

2.2 冠突散囊菌GT-1發(fā)酵煙葉感官評吸

由7位評吸人員組成的評吸小組分別對原樣、無菌水處理對照樣和GT-1發(fā)酵煙葉卷制而成的卷煙進行評吸，并按照1.3.4中所述的評分方法進行評分，取評分的平均值繪制成圖5.由圖5可知，噴灑無菌水發(fā)酵1、3、5和7d的對照煙葉感官質量與未發(fā)酵原樣類似，僅勁頭略有下降，香氣質和香氣量均無改善.低次煙葉感官質量較差，主要表現(xiàn)香氣量不足、香氣質不佳且雜氣重、余味不佳.添加GT-1顯著提高了供試煙葉的感官質量，發(fā)酵5 d的評吸結果最好，其次是發(fā)酵3 d.經(jīng)過接菌處理發(fā)酵后，煙葉的香氣量、濃度和余味均有較為明顯的改善，雜氣減輕，對勁頭影響不大或略有降低.微生物種群是影響發(fā)酵質量的關鍵因素，本研究中直接發(fā)酵未能改善供試煙葉感官質量，推測可能是煙葉攜帶微生物缺乏對煙葉感官質量有正向作用的功能微生物所致.

2.3 冠突散囊菌GT-1發(fā)酵煙葉主要致香成分變化

煙葉的致香物質是評價煙葉品質的重要指標［17］，接種冠突散囊菌GT-1發(fā)酵煙葉的香氣質和香氣量均較原樣顯著提升.通過同時蒸餾萃取和GC/MS對不同發(fā)酵時間冠突散囊菌GT-1發(fā)酵煙葉的致香成分進行檢測，并和原樣的檢測結果進行比較，其致香成分變化如圖6和表1所示.煙葉樣品中共檢測出33種主要致香成分，根據(jù)香味前體物質分類可分為五類，即類胡蘿卜素降解產(chǎn)物、芳香族氨基酸轉化產(chǎn)物、葉綠素降解產(chǎn)物、類西柏烷降解產(chǎn)物和美拉德反應產(chǎn)物［18］，分別有16種、9種、1種、1種和6種.不同發(fā)酵時間煙葉致香成分具有明顯變化，致香成分含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢.隨著固態(tài)發(fā)酵時間的延長，煙葉主要致香成分總量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，推測是煙葉上接種的冠突散囊菌5 d后開始衰亡、細胞代謝活力下降.與感官評吸結果一致，發(fā)酵5 d時致香成分含量達到最高，為402.03 μg/g，相較于未發(fā)酵煙葉，致香成分含量提高了22.54%，這可能是發(fā)酵煙葉感官質量提升的重要原因.

新植二烯對煙葉的品質有著重要的影響［19，20］，其含量在各個發(fā)酵階段占比均較高，發(fā)酵5天煙葉較對照含量提高12.67%.類胡蘿卜素降解產(chǎn)物是發(fā)酵中除新植二烯外含量最高的香氣物質，類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量在第5 d最高（63.56 μg/g），較原樣含量提高了37.11%，該類物質能夠減少煙葉刺激性，可增加花香和果香等香韻［21，22］.類胡蘿卜素降解產(chǎn)物中4，7，9-巨豆三烯-3-酮含量占比較高，具有甘甜香和煙草香［23，24］；香葉基丙酮含量變化最大，相較于原樣提高了192.37%，可豐富煙葉果香［25］，具有良好的自由基清除能力［26］.與在苦丁茶上研究結果類似［27］，發(fā)酵煙葉芳樟醇含量也有較大提升.除此之外，與原樣相比，發(fā)酵煙葉檢出了4種新的類胡蘿卜素降解產(chǎn)物（β-環(huán)檸檬醛、6-甲基-5-庚烯-2-醇、愈創(chuàng)木酚、4-環(huán)戊烯-1，3-二酮、3-羥基-2-丁酮），這些成分具有果香、甜香和香草香.

芳香族氨基酸轉化產(chǎn)物含量雖然占比較小，但也是煙葉重要的風味組成，具有豐富的花香香味的苯甲醇和苯乙醇［28］在發(fā)酵過程中顯著變化，發(fā)酵5d分別提高了133.23%和85.81%.芳香族氨基酸轉化產(chǎn)物中產(chǎn)生了3種新物質（3，4-二甲基苯甲醛、鄰苯二甲酸二丁酯、3-甲基苯酚），具有杏仁香和果香［29］.茄酮是煙葉致香物質中類西柏烷降解產(chǎn)物的代表指標［30］，具有新鮮胡蘿卜的香味，增加煙草香氣，使煙氣醇和細膩［31］，發(fā)酵5 d提高了72.86%.美拉德反應產(chǎn)物2-乙?；量┚哂谢ㄏ恪⑶逑悖?2］，發(fā)酵5d提高了183.64%.

冠突散囊菌發(fā)酵可顯著提高茶葉的香氣物質含量與種類［27，33-35］，本研究在煙葉上也得了類似的研究結果.目前對于冠突散囊菌發(fā)酵產(chǎn)香的機制尚不清楚，推測可能與菌體生長及代謝過程中對大分子香氣前體物的降解［36］、芳香物質的合成［37，38］及分泌胞外酶的催化作用［39，40］有關，未來可綜合應用化學分析和代謝組學、基因組學及轉錄組學等高通量組學技術開展進一步研究.

3 結論

本研究從茯磚茶茶葉中分離、篩選得到一株冠突散囊菌GT-1并將其應用于煙葉固態(tài)發(fā)酵.發(fā)酵后煙葉感官質量提升顯著，發(fā)酵5 d效果最佳，發(fā)酵后煙葉香氣質和香氣量顯著提升，雜氣減少，余味舒適.發(fā)酵煙葉香味物質種類和含量較對照煙葉均顯著提高，香味物質含量總體呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，其中發(fā)酵5 d煙葉香味物質含量最高，表明香氣物質的增加可能是冠突散囊菌GT-1發(fā)酵煙葉感官質量提升的重要原因.本研究首次將冠突散囊菌應用于低次煙葉增香提質，后續(xù)可進一步對接種量、溫度、濕度及轉速等發(fā)酵條件發(fā)酵參數(shù)進行優(yōu)化并對其增香機制進行深入研究，為其在卷煙工業(yè)中的應用提供基礎數(shù)據(jù).

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【責任編輯：蔣亞儒】

基金項目：國家自然科學基金項目（31401810）； 云南中煙工業(yè)有限責任公司科研項目（JB2022YL02）

作者簡介：李 萌（1982—），男，河南長葛人，講師，博士，研究方向：煙草生物技術

通訊作者：饒 智（1973—），男，云南昭通人，高級農(nóng)藝師，碩士，研究方向：煙草原料與卷煙工藝，rzhyhe@163.com