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    黑平菇及白色變異平菇單核菌株的遺傳多樣性分析

    2024-05-22 09:31:40夏會楠李東曉周金看王春霞郭金英鄭素月
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2024年7期

    夏會楠 李東曉 周金看 王春霞 郭金英 鄭素月

    夏會楠,李東曉,周金看,等. 黑平菇及白色變異平菇單核菌株的遺傳多樣性分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2024,52(7):41-47.

    doi:10.15889/j.issn.1002-1302.2024.07.006

    (河北工程大學(xué)園林與生態(tài)工程學(xué)院,河北邯鄲 056038)

    摘要:以篩選平菇雜交過程中優(yōu)良菌株為目標(biāo),分析黑平菇以及白色變異平菇單核菌株遺傳多樣性。用24個(gè)白色變異平菇原生質(zhì)體單核菌株以及37個(gè)黑平菇原生質(zhì)體單核菌株為試驗(yàn)材料,采用酯酶同工酶技術(shù)以及ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對其單核菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明,酯酶同工酶白色變異原生質(zhì)體單核菌株菌株共檢測出7條遷移率不同的酶帶,黑平菇單核菌株共檢測出8條遷移率不同的酶帶,多態(tài)性條帶分別占65.8%、75%;ISSR分子標(biāo)記技術(shù)將平菇白色變異單核菌株以及黑平菇單核菌株的原生質(zhì)體單核菌株從5個(gè)ISSR引物中分別擴(kuò)增出68、74條清晰的DNA多態(tài)片段,多態(tài)性位點(diǎn)分別占78.5%、63%。兩類聚類分析結(jié)果表明,當(dāng)GS為0.75時(shí),將24個(gè)平菇白色變異菌株單核菌株分為兩大類;當(dāng)GS為0.79左右時(shí),將37個(gè)黑平菇單核菌株分為兩大類。說明酯酶同工酶技術(shù)以及ISSR分子標(biāo)記技術(shù)可以用于單核菌株遺傳多樣性分析,為平菇雜交育種過程中優(yōu)良親本單核體的選擇提供理論依據(jù)。

    關(guān)鍵詞:平菇;單核菌株;酯酶同工酶;ISSR分子標(biāo)記

    中圖分類號:S646.1+40.32? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A? 文章編號:1002-1302(2024)07-0041-07

    平菇是具有食用性和藥用性的可食用性大型子實(shí)體真菌,生長周期短收益快,且含有人體所需的大量生物活性物質(zhì)、礦物質(zhì)和維生素,蛋白質(zhì)含量高,脂肪含量低,具有非常高的營養(yǎng)價(jià)值,已成為人們的重要蔬菜。平菇是典型的四極性異宗結(jié)合菌。四極性異宗結(jié)合菌,交配型是由A、B這2對因子控制,同一菌株產(chǎn)生的擔(dān)孢子分為4種不同交配型:A1B1、A2B2、A1B2、A2B1,只有A、B這2個(gè)因子各不相同時(shí)才能進(jìn)行交配[1-2]。原生質(zhì)體單核菌株只有2種交配型。平菇雙核菌株通過單核化技術(shù)回到質(zhì)配前的單核狀態(tài),是擔(dān)子菌獨(dú)特的生物學(xué)現(xiàn)象,原生質(zhì)體單核化是平菇遺傳育種上的一個(gè)重要節(jié)點(diǎn),單核菌株具有遺傳多樣性,是研究平菇遺傳性狀以及基因定位的重要材料,同時(shí)單核菌株也為平菇雜交育種提供了重要的種質(zhì)資源。

    酯酶同工酶技術(shù)是從蛋白質(zhì)水平上研究單核菌株之間的遺傳差異性,廣泛應(yīng)用于親緣關(guān)系鑒定以及遺傳差異研究中[1-2]。但酯酶同工酶僅僅只能從蛋白質(zhì)水平研究單核菌株遺傳差異,不能分析DNA水平上單核菌株遺傳差異,因此要更進(jìn)一步采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對單核菌株遺傳差異性進(jìn)行研究[3-4]。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)是基于SSR發(fā)展起來的新技術(shù),具有穩(wěn)定性及多態(tài)性,能夠更好地分析單核菌株之間的遺傳差異性[5-7]。筆者采用酯酶同工酶以及ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對白色變異平菇菌株的24個(gè)單核菌株以及黑色出發(fā)菌株的37個(gè)單核菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析,以期為食用菌育種提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    試驗(yàn)于2023年2—5月在河北工程大學(xué)食用菌研究室內(nèi)進(jìn)行,試驗(yàn)所需平菇白色變異菌株是在平菇系統(tǒng)選育過程中發(fā)現(xiàn)的白色變異菌株,試驗(yàn)所需變異白平菇原生質(zhì)體單核體,分別編號為B1~B24,黑色出發(fā)菌株原生質(zhì)體單核體H1~H37,由河北工程大學(xué)食用菌研究室鑒定、保藏。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 菌絲體培養(yǎng)

    將變異的白色平菇以及黑色出發(fā)菌株接種于PDA平板上進(jìn)行培養(yǎng)。

    1.2.2 單核菌株收集

    通過原生質(zhì)體制備獲得單核菌株,將單核菌株接種至鋪有玻璃紙的PDA平板上進(jìn)行培養(yǎng),菌絲長滿平板后刮取菌絲備用。

    1.2.3 酯酶同工酶分析

    將備用菌絲放入研缽中,加入液氮快速研磨,取0.5 g菌絲加入700 μL pH值為7.5的磷酸鹽緩沖液,混勻后加入離心管19 ℃ 12 000 r/min 離心5 min取上清液。使用DYC2-24EN型雙垂直電泳儀進(jìn)行垂直電泳。

    1.2.4 ISSR分子鑒定

    采用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒提取單核菌株DNA,采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度及質(zhì)量,進(jìn)行凝膠成像拍照,剩余DNA放在-20 ℃保存?zhèn)溆?,后期進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增體系見表1。所采用的ISSR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    1.3 數(shù)據(jù)分析

    利用NTSYS-PC軟件進(jìn)行聚類分析,打開Ntsys 軟件中的ntedit.exe程序以及NTSYS-PC程序,用非加權(quán)組平均法(UPGMA)構(gòu)建各菌株的親緣關(guān)系樹狀圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 酯酶同工酶分析

    2.1.1 白色變異平菇酯酶同工酶

    酯酶同工酶分析結(jié)果表明,24個(gè)白色變異平菇原生質(zhì)體單核菌株共檢測到7條不同遷移率的酶帶,相對遷移率(Rf)在0.23~0.63之間,各個(gè)單核菌株酶帶數(shù)量在4~7條,多態(tài)性帶型占65.8%,部分平菇白色變異單核菌株酯酶同工酶圖譜見圖1。

    2.1.2 白色變異平菇酯酶同工酶聚類分析

    聚類分析樹狀圖見圖2。由圖2可知,供試的24個(gè)白色變異平菇單核菌株間的遺傳相似系數(shù)(GS)為0.6~1.0,當(dāng)GS為0.685時(shí)可將菌株分為2組,根據(jù)樣本量依次分為A、B 2組。A組為B1、B2等20個(gè)菌株,B組為B17、B18、B19、B20等4個(gè)菌株。

    2.1.3 黑色出發(fā)平菇酯酶同工酶分析

    酯酶同工酶分析結(jié)果表明,37個(gè)黑色平菇原生質(zhì)體單核菌株共檢測到8條不同遷移率的酶帶,相對遷移率在014~0.47之間,各個(gè)單核菌株酶帶數(shù)量在3~7條,多態(tài)性帶型占75%,部分黑平菇單核菌株酯酶同工酶圖譜見圖3。

    2.1.4 黑平菇酯酶同工酶聚類分析

    由圖4聚類分析樹狀圖可知,供試的37個(gè)平菇單核菌株間的遺傳相似系數(shù)(GS)為0.58~1.00,當(dāng)GS為0.66時(shí)可將菌株分為2組,根據(jù)樣本量依次分為A、B 2組。A組為H1、H2等33個(gè)菌株,B組為H13、H14、H15、H16等4個(gè)菌株。

    2.2 ISSR引物篩選及聚類分析

    2.2.1 DNA檢測

    24株白色變異平菇單核菌株DNA質(zhì)量檢測結(jié)果如圖5所示,有明顯的DNA條帶,可進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)增試驗(yàn)。黑色出發(fā)菌株部分DNA檢測結(jié)果如圖6所示,有明顯DNA條帶,可進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)增試驗(yàn)。

    2.2.2 ISSR引物篩選

    從28個(gè)引物(表2)中篩選出5個(gè)擴(kuò)增條帶清晰的引物,對24個(gè)白色變異單核菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增,均能擴(kuò)增出清晰的條帶,分別是P2、P4、P5、P9、P22、P22、P9的擴(kuò)增圖譜分別如圖7、圖8所示,5個(gè)引物對24個(gè)平菇白色變異單核菌株共擴(kuò)增出73條清晰條帶。擴(kuò)增條帶最多的引物是P22,擴(kuò)增條帶最少的引物是P5,擴(kuò)增出14條條帶。多態(tài)性位點(diǎn)占78.5%。

    2.2.3 24個(gè)平菇單核菌株的ISSR聚類分析

    將24個(gè)平菇單核菌株的DNA擴(kuò)增圖譜轉(zhuǎn)化成GS矩陣圖,再利用NTSYS-PC軟件UPGMA法進(jìn)行聚類分析,構(gòu)建單核菌株親緣關(guān)系圖。由圖9可知,24個(gè)單核菌株GS在0.58~1.00之間,當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.75時(shí)可將24個(gè)平菇單核菌株分為兩大類,A類有B1、B2等20個(gè)菌株,B類有B17、B18、B19、B20等4個(gè)菌株,與酯酶同工酶分析結(jié)果一致。

    2.2.4 黑平菇菌株ISSR引物篩選

    從28個(gè)引物(表2)中篩選出4個(gè)擴(kuò)增條帶清晰的引物(P6、P11、P19、P22),對37個(gè)黑平菇原生質(zhì)體單核菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增均能擴(kuò)增出清晰的條帶。P22、P6的擴(kuò)增圖譜分別如圖10、圖11所示。 4個(gè)引物對37個(gè)平菇單核菌株共擴(kuò)增出64個(gè)清晰的條帶。擴(kuò)增條帶最多的引物是P22,擴(kuò)增出16條條帶,擴(kuò)增條帶最少的是P5,擴(kuò)增出5條條帶。多態(tài)性位點(diǎn)占63%。

    2.2.5 37個(gè)黑平菇單核菌株的ISSR聚類分析

    將37個(gè)平菇單核菌株的DNA擴(kuò)增圖譜轉(zhuǎn)化成GS矩陣圖,再利用NTSYS-PC軟件UPGMA法進(jìn)行聚類分析,構(gòu)建單核菌株親緣關(guān)系聚類分析圖。由圖12可知, 供試的37個(gè)單核菌株GS在?0.78~1.00之間,當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.79時(shí)可將37個(gè)平菇單核菌株分為兩大類,A類有H1、H2等33個(gè)單核菌株,B類有H13、H14、H15、H16等4個(gè)菌株,與酯酶同工酶分析結(jié)果一致。

    3 討論與結(jié)論

    在生產(chǎn)中,為達(dá)到育種目標(biāo)提高生產(chǎn)力,單核菌株遺傳差異研究在食用菌育種中起著非常重要的作用,為平菇雜交育種提供優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源[8-10]。酯酶同工酶分析、ISSR分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食用菌雜交育種、種質(zhì)資源鑒定以及單核菌株遺傳差異研究[11]。本試驗(yàn)在酯酶同工酶分析的基礎(chǔ)上又進(jìn)行了ISSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)一步研究了白色變異平菇單核菌株遺傳差異性,便于挑出優(yōu)良單核菌株用于育種工作。根據(jù)聚類分析圖來看,遺傳相似性基本一致。酯酶同工酶試驗(yàn)在24個(gè)單核菌株中共檢測出7條遷移率不同的酶帶,多態(tài)性帶型占658%。24個(gè)平菇單核菌株間的遺傳相似系數(shù)(GS)在0.6~1.0之間,當(dāng)GS為0.685時(shí)可將菌株分為2組,根據(jù)樣本量依次分為A、B 2組。A組為B1、B2等20個(gè)菌株,B組為B17、B18、B19、B20等4個(gè)菌株,并且Rf為0.63的條帶為24個(gè)單核菌株所共有的,可以認(rèn)為是白色變異平菇單核體的特征譜帶。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)用篩選出的5條引物對24個(gè)平菇單核菌株的DNA進(jìn)行ISSR擴(kuò)增,24個(gè)平菇單核菌株共擴(kuò)增出73條清晰條帶。擴(kuò)增條帶最多的引物是P22,擴(kuò)增條帶最少的引物是P5,擴(kuò)增出14條條帶,多態(tài)性位點(diǎn)占78.5%。當(dāng)GS為0.75時(shí),將24個(gè)菌株分為兩大類。平菇黑色出發(fā)菌株分別分離出單核菌株37個(gè),平菇黑色出發(fā)菌株原生質(zhì)體單核菌株酯酶同工酶試驗(yàn)共檢測出8條遷移率不同的酶帶,多態(tài)性帶占75%。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)將平菇黑色出發(fā)菌株的原生質(zhì)體單核菌株從5個(gè)ISSR引物中分別擴(kuò)增出64條清晰的DNA多態(tài)片段,多態(tài)性位點(diǎn)分別占63%,兩類聚類分析結(jié)果表明,當(dāng)GS為0.79左右時(shí),將37個(gè)黑色出發(fā)菌株分[21]為兩大類。酯酶同工酶分析以及ISSR分子標(biāo)記技術(shù)均可以作為單核菌株遺傳差異研究的技術(shù)手段。通過酯酶同工酶以及分子標(biāo)記技術(shù)研究單核菌株遺傳差異大體分類相同之間的小分支還有所差異。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對黑色出發(fā)菌株以及白色變異菌株的單核菌株進(jìn)行了具體的遺傳多樣性分析,當(dāng)GS為0.75時(shí),將白色變異菌株24個(gè)菌株分為兩大類。當(dāng)GS為0.79左右時(shí),將黑色出發(fā)菌株37個(gè)菌株分為兩大類。酯酶同工酶試驗(yàn)結(jié)果表明,平菇黑色出發(fā)菌株以及平菇白色變異菌株遺傳系相接近,在遺傳相似系數(shù)在0.75左右能將其分為兩大類。綜上所述,平菇白色變異菌株的單核菌株遺傳多樣性不同于黑色出發(fā)菌株。這為平菇擴(kuò)充種質(zhì)資源庫奠定了基礎(chǔ)。

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    基金項(xiàng)目:河北省高等學(xué)校學(xué)科技術(shù)研究項(xiàng)目(編號:QN2021210);邯鄲市科技技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃(編號:21422012326);河北省農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(編號:202360101010014)。

    作者簡介:夏會楠(1998—),女,河北承德人,碩士,研究方向?yàn)槭乘幱谜婢?。E-mail:2199797807@qq.com。

    通信作者:鄭素月,博士,教授,碩士生導(dǎo)師,從事食用菌遺傳育種研究工作。E-mail:zhengsuyue@sina.com。

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