三種豬日本腦炎疫苗免疫效果比較

丁林玲 劉璐 陳云蕾 張澤林 湯冠濤 程國(guó)華 袁偉琴 吳昊

基金項(xiàng)目：杭州市農(nóng)業(yè)與社會(huì)發(fā)展科研引導(dǎo)項(xiàng)目（20220919Y203）

作者簡(jiǎn)介：丁林玲（1984－），女，獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物防疫工作

*通信作者：陳云蕾（1991－），男，獸醫(yī)師，主要從事獸醫(yī)技術(shù)服務(wù)和獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作；E-mail：506658911@qq.com

摘? 要：為篩選出免疫效果較好的豬日本腦炎疫苗，本研究從某豬場(chǎng)選出15頭45日齡左右的仔豬，隨機(jī)分成3組（A組、B組和C組），分別接種3種不同廠家的豬日本腦炎疫苗。采集疫苗免疫前、首次免疫后21 d和二次免疫后21 d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)豬血液樣本，通過熒光定量PCR和ELISA方法對(duì)免疫前病毒感染情況和免疫后抗體水平進(jìn)行對(duì)比和分析。結(jié)果顯示，試驗(yàn)仔豬未出現(xiàn)豬日本腦炎病毒感染；A組所用疫苗較B組、C組所用疫苗，抗體水平最高，首次免疫、二次免疫均表現(xiàn)出極顯著差異（P＜0.01），表明A組所用疫苗的免疫效果最好，可用于易感動(dòng)物豬的免疫，以減少病毒由蚊蟲向馬匹感染的風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)鍵詞：豬日本腦炎；疫苗；免疫；抗體水平

中圖分類號(hào)：S851.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2024）02-0022-04

日本腦炎 （Japanese encephalitis，JE）是由黃病毒科黃病毒屬日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起的一種人畜共患病，主要導(dǎo)致人和馬出現(xiàn)腦炎癥狀，但人和馬感染后通常表現(xiàn)為隱性感染。JE同樣可引起母豬繁殖障礙，導(dǎo)致母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎，但懷孕母豬通常沒有臨床癥狀，且不影響后期懷孕[1]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)JEV主要存在于蚊子、野鳥和豬中[2]。豬是JEV重要的擴(kuò)增宿主，鳥類也可增殖和傳播病毒，在豬中存在無病媒傳播的可能[3]。JE嚴(yán)重影響我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)和馬匹競(jìng)技性能的健康發(fā)展。

2023年第19屆亞運(yùn)會(huì)馬術(shù)項(xiàng)目在杭州桐廬成功舉辦，為保障參賽人員與馬匹健康安全，將JE列為19種馬屬動(dòng)物疫病中兩種強(qiáng)制免疫的疫病之一。豬作為JEV重要的擴(kuò)增宿主，增加了蚊蟲向馬匹傳播的風(fēng)險(xiǎn)。因此，為充分保障參賽人員與馬匹的健康安全，保證規(guī)定區(qū)域內(nèi)易感動(dòng)物的JE“零發(fā)生”，選擇適合的疫苗對(duì)易感動(dòng)物——豬進(jìn)行強(qiáng)制免疫顯得尤為重要。本試驗(yàn)選取桐廬縣某豬場(chǎng)15頭45日齡左右仔豬，隨機(jī)分成3組（A組、B組和C組），分別接種3種不同廠家的豬日本腦炎疫苗，通過臨床觀察、熒光定量RT-PCR、ELISA等方法比較試驗(yàn)豬群的免疫效果，選出免疫效果最好的豬日本腦炎疫苗為豬免疫，以減少病毒由蚊蟲向馬匹感染的風(fēng)險(xiǎn)。

1? 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和疫苗

15頭未接種過豬JE疫苗的健康斷奶仔豬；試驗(yàn)疫苗為國(guó)內(nèi)3家生物制品廠生產(chǎn)的疫苗：A疫苗（生產(chǎn)批號(hào)為202302005）、B疫苗（生產(chǎn)批號(hào)為202304010）和C疫苗（生產(chǎn)批號(hào)為20230208）。

1.2 主要試劑與儀器設(shè)備

日本腦炎病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)為2023005）由哈爾濱國(guó)生生物科技股份有限公司生產(chǎn)；日本腦炎抗體檢測(cè)試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)為20230704）由武漢科前生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；熒光定量PCR儀（ABI 7500）由美國(guó)賽默飛世爾科技公司生產(chǎn)；核酸提取儀購(gòu)買于濟(jì)凡生物科技有限公司；酶標(biāo)儀由美國(guó)賽默飛世爾科技公司生產(chǎn)；移液器由上海普蘭德貿(mào)易有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 免疫程序

15頭斷奶仔豬隨機(jī)分成A組、B組和C組，分別注射3家不同生物制品廠生產(chǎn)的疫苗。按廠家推薦，試驗(yàn)仔豬在45日齡進(jìn)行首次免疫，? 90日齡進(jìn)行二次免疫，劑量為每頭豬1頭份。

1.3.2 采樣及樣本檢測(cè)方法

試驗(yàn)仔豬在疫苗免疫前、首次免疫后21 d和二次免疫后21 d分別進(jìn)行前腔靜脈采血，每份采樣量不少于3 mL。對(duì)免疫前采集的抗凝血提取核酸，進(jìn)行JEV核酸檢測(cè)；對(duì)3個(gè)時(shí)間點(diǎn)（免疫前、首次免疫后21 d和二次免疫后21 d）采集的樣本進(jìn)行抗體檢測(cè)。具體操作步驟參照試劑盒說明書，檢測(cè)結(jié)果按照核酸CT值和抗體陽性率等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)

核酸檢測(cè)判斷標(biāo)準(zhǔn)：①FAM通道Ct值≤35且擴(kuò)增曲線為典型的S型，同時(shí)HEX通道或VIC通道Ct值≤35，則判定樣本為JEV陽性；②FAM通道無Ct值顯示或Ct值＞40，同時(shí)HEX通道或VIC通道Ct值≤35（低于試劑盒檢測(cè)下限），則判定樣本為JEV陰性；③FAM通道無Ct值顯示或Ct值＞40，同時(shí)HEX通道或VIC通道內(nèi)標(biāo)Ct值＞40或無Ct值顯示，則檢測(cè)樣本結(jié)果無效。

抗體檢測(cè)判斷標(biāo)準(zhǔn)：①對(duì)照成立條件為陽性對(duì)照平均OD630 nm值≥0.5，陰性對(duì)照平均OD630 nm值＜0.3；②計(jì)算公式中S/P值＝樣本OD630 nm值/陽性對(duì)照平均OD630 nm值，若樣本S/P值≥0.21，則判定JEV抗體為陽性，若樣本S/P值＜0.21，判定JEV抗體為陰性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用EXCEL和GraphPad Prism Vol.8.0軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。“**”表示存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的極顯著差異（P＜0.01）。

2? 結(jié)果與分析

2.1 疫苗免疫前日本腦炎病毒核酸檢測(cè)

使用熒光定量RT-PCR方法對(duì)采集的抗凝血進(jìn)行核酸檢測(cè)（圖1）。從圖1可知，該豬群樣本檢測(cè)中FAM通道陽性對(duì)照Ct值為23.56（陽性對(duì)照Ct值≤35），其余均無Ct值；樣本VIC通道：陽性對(duì)照Ct值為24.38，陰性對(duì)照Ct值為25.05，其余樣本Ct值分別為25.51、24.89和24.91，Ct值均≤35，檢測(cè)結(jié)果判定JEV核酸陰性，表明該豬群在免疫前未感染日本腦炎病毒。

2.2 疫苗免疫后抗體水平檢測(cè)

將疫苗免疫前、首次免疫后21 d和二次免疫后21 d采集的試驗(yàn)仔豬全血離心，收集血清進(jìn)行抗體水平檢測(cè)（圖2）。由圖2可知，免疫前A組、B組、C組試驗(yàn)仔豬的抗體水平無明顯差異；首次免疫后21 d檢測(cè)抗體水平發(fā)現(xiàn)，A組試驗(yàn)仔豬（接種A疫苗）免疫效果明顯高于B組的（接種B疫苗）和C組的（接種C疫苗），且差異極顯著（P＜0.01）；二次免疫后21 d檢測(cè)抗體水平發(fā)現(xiàn)，免疫A疫苗（A組）的試驗(yàn)仔豬的抗體水平明顯高于免疫B疫苗（B組）的和C疫苗（C組）的，且差異極顯著（P＜0.01）。

3? 討論與分析

選擇優(yōu)質(zhì)的疫苗和合理的免疫程序?qū)τ谪i場(chǎng)疫病的預(yù)防至關(guān)重要[4]。一般情況下，廠家推薦仔豬日本腦炎疫苗的免疫程序?yàn)?5日齡左右進(jìn)行首次免疫，90日齡左右加強(qiáng)免疫一次。為驗(yàn)證疫苗免疫效果，在仔豬母源抗體最低或無母源抗體（45日齡左右）時(shí)，進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)，可避免外源病毒對(duì)疫苗免疫效果的影響。

本試驗(yàn)接種疫苗前核酸檢測(cè)結(jié)果：FAM通道陽性對(duì)照CT值小于35，且擴(kuò)增曲線為典型的S型，而樣本和陰性對(duì)照均無CT值，同時(shí)VIC通道CT值均小于35，表明該豬群在接種前均未感染日本腦炎病毒。隨后對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)（免疫前、首次免疫后21 d和二次免疫后21 d）的血清樣本進(jìn)行抗體水平檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在免疫前，三組試驗(yàn)的抗體水平（A組、B組和C組）未有明顯差異，但在首次免疫后21 d和二次免疫后21 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，三組試驗(yàn)仔豬的免疫效果出現(xiàn)極顯著差異，A組試驗(yàn)仔豬與B組和C組試驗(yàn)仔豬之間差異極顯著（P＜0.01），說明A組所注射疫苗的免疫效果明顯高于其他兩種疫苗的。但A組試驗(yàn)仔豬在二次免疫后21 d的抗體水平比首次免疫后21 d出現(xiàn)了下降，有可能是首次免疫和二次免疫之間接種過其他疫苗或豬抵抗力下降等原因引起的，具體原因有待進(jìn)一步深入探究。在三種疫苗免疫效果比較過程中發(fā)現(xiàn)，B組和C組所用的疫苗雖在首次免疫后、二次免疫后均出現(xiàn)抗體水平的升高，但與A組所用的疫苗相比，B組和C組所用的疫苗免疫效果明顯不足，表明A組所用的疫苗免疫效果較好。

綜上所述，A組所用的疫苗是三種疫苗中免疫效果最好的疫苗，但在實(shí)際生產(chǎn)中，疫苗的選擇和合理的免疫程序并不是一成不變的，而是需要根據(jù)自身的實(shí)際情況進(jìn)行合理的調(diào)整。要堅(jiān)持監(jiān)測(cè)常態(tài)化，更好地了解豬群的JEV抗體水平，做到及時(shí)補(bǔ)免[5]，才能充分做到豬日本腦炎真正的“零發(fā)生”，從而降低病毒由蚊蟲向馬匹感染的風(fēng)險(xiǎn)。

參考文獻(xiàn)

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