溫度對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞UMNSAH/DF- 1 的影響

張雨晴，夏 晴（并列一作），喻 峰，吳 軍*

（中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心(生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所)中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫，上海）

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中扮演著至關(guān)重要的角色，為科學(xué)家們提供了一個(gè)可控制、可重復(fù)、且具有高度可變性的體外實(shí)驗(yàn)平臺(tái)[1]。在這個(gè)背景下，雞胚成纖維細(xì)胞UMNSAH/DF-1 作為一種重要的細(xì)胞系，已在禽流感病毒和其他禽源病毒的研究中展現(xiàn)出其獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值，儼然已經(jīng)成為禽源病毒學(xué)研究、疫苗開發(fā)以及宿主細(xì)胞反應(yīng)等領(lǐng)域的理想工具[2-4]。

近年來，隨著對(duì)禽流感等禽類病毒感染機(jī)制和生物學(xué)特性深入研究的需求不斷增加，UMNSAH/DF-1 細(xì)胞的使用也逐漸受到廣泛認(rèn)可。但是UMNSAH/DF-1 細(xì)胞在運(yùn)輸過程中容易受到外界溫度波動(dòng)的影響，在溫度變化的條件下或外界溫度較低時(shí)，UMNSAH/DF-1 細(xì)胞可能會(huì)出現(xiàn)大量“空泡化”現(xiàn)象，即細(xì)胞內(nèi)形成較多空泡，這可能與溫度對(duì)細(xì)胞膜的滲透性和細(xì)胞器的功能有關(guān)，通常被視為細(xì)胞發(fā)生異?；蚴艿揭恍┐碳r(shí)的一種響應(yīng)[5-6]。

溫度對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)來說是一個(gè)關(guān)鍵的環(huán)境因素，會(huì)直接影響到細(xì)胞的生長、代謝和功能。而細(xì)胞培養(yǎng)的最佳溫度則是由多個(gè)因素綜合影響來決定。不同種類、不同來源的細(xì)胞對(duì)于生長的最適溫度有所不同。但一般而言，禽類動(dòng)物細(xì)胞在培養(yǎng)過程中常在溫度為39 ℃左右的條件下表現(xiàn)出較好的生長特性，UMNSAH/DF-1 細(xì)胞可能也不例外。本文旨在通過系統(tǒng)性的實(shí)驗(yàn)研究，比較不同溫度下培養(yǎng)對(duì)UMNSAH/DF-1 細(xì)胞生長及“空泡化”程度的影響，同時(shí)通過模擬活細(xì)胞株常溫運(yùn)輸環(huán)境來探究改善UMNSAH/DF-1 細(xì)胞生長狀態(tài)及減少其胞體“空泡化“現(xiàn)象的方法，以期為未來疫苗研發(fā)、抗病毒治療和基礎(chǔ)研究提供更為可靠的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

雞胚成纖維細(xì)胞UMNSAH/DF-1 來自于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫（目錄號(hào)：GNO30）；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、胰酶、雙抗購于賽默飛世爾科技公司；PBS、DMSO 購于國藥控股股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞傳代及顯微拍照

當(dāng)UMNSAH/DF-1 細(xì)胞融合率達(dá)到80%以上時(shí)進(jìn)行1：2 傳代處理。棄去舊培養(yǎng)基，加1～2 ml 的0.25%胰酶于培養(yǎng)瓶中，置于39 ℃培養(yǎng)箱中消化2～3 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加3～6 mL 完全培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細(xì)胞，完全脫落后吸出至離心管，離心（1 000 rpm，5 min）。棄去上清液，加1～3 mL 完全培養(yǎng)基重懸。將重懸后細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至兩個(gè)新的T25 培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充新的完全培養(yǎng)基至8～10 mL/瓶，將兩瓶搖勻后UMNSAH/DF-1 細(xì)胞分別置于37℃、39 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中觀察培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至第24 h、48 h、72 h、4 天時(shí)鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并顯微拍照。

1.2.2 細(xì)胞換液

提前將DMEM 完全培養(yǎng)液（含10% FBS）、PBS 置于37 ℃水浴鍋中進(jìn)行預(yù)熱。從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。吸出舊培養(yǎng)基，加入2～3 mL D-PBS 緩慢清洗細(xì)胞2 遍以去除殘余培養(yǎng)基。加入5～8 mL 事先預(yù)熱好的DMEM 完全培養(yǎng)液，分別將細(xì)胞移至37 ℃與39 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)觀察培養(yǎng)。

1.2.3 模擬活細(xì)胞株常溫運(yùn)輸環(huán)境

將生長狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)生長期的UMNSAH/DF-1 細(xì)胞灌滿新鮮的DMEM 完全培養(yǎng)液（含10%FBS）至T25 培養(yǎng)瓶頸部（保留微量空氣），擰緊瓶蓋且通過封口膜密封瓶口。將細(xì)胞置于室溫中（10 ℃～25 ℃）分別放置0 天、1 天、2 天、4 天后顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。將室溫放置4 天且胞體出現(xiàn)大量“空泡”的UMNSAH/DF-1 細(xì)胞進(jìn)行1：2 傳代處理，之后將傳代后的細(xì)胞移至39 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至第24 h、48 h 時(shí)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同溫度下培養(yǎng)對(duì)UMNSAH/DF-1 細(xì)胞生長及“空泡化”的影響

為了比較不同的培養(yǎng)溫度對(duì)UMNSAH/DF-1 細(xì)胞生長狀態(tài)及“空泡化”現(xiàn)象的影響，我們將等量傳代的2瓶UMNSAH/DF-1 細(xì)胞（T25 培養(yǎng)瓶）分別置于37 ℃與39 ℃恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱中觀察培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)UMNSAH/DF-1 細(xì)胞株的生理狀態(tài)和胞體“空泡”的數(shù)量具有顯著影響。相較于37 ℃，39 ℃的培養(yǎng)溫度更適合UMNSAH/DF-1 細(xì)胞的生長，同時(shí)也可顯著減少UMNSAH/DF-1 細(xì)胞胞體“空泡”的產(chǎn)生（如圖1 顯示），細(xì)胞狀態(tài)較好。

圖1 比較37 ℃與39 ℃培養(yǎng)時(shí)UMNSAH/DF-1 細(xì)胞的生長狀態(tài)及“空泡化”程度

2.2 探究常溫運(yùn)輸對(duì)UMNSAH/DF-1 細(xì)胞生長及“空泡化”的影響

通過模擬活細(xì)胞株常溫運(yùn)輸環(huán)境(溫度曲線如圖2所示)，分別將灌滿與未灌滿新鮮完全培養(yǎng)液的UMNSAH/DF-1 細(xì)胞置于室溫環(huán)境中（10 ℃～25 ℃）分別放置0 天、1 天、2 天、4 天后觀察UMNSAH/DF-1 細(xì)胞生長狀態(tài)及“空泡化”程度。結(jié)果顯示：當(dāng)灌滿完全培養(yǎng)液的UMNSAH/DF-1 細(xì)胞常溫放置1～2 天時(shí)，開始出現(xiàn)部分未完全貼壁且透亮的圓細(xì)胞（屬正?，F(xiàn)象），同時(shí)貼壁的UMNSAH/DF-1 細(xì)胞胞體也開始出現(xiàn)少量“空泡”化現(xiàn)象（如圖3b，3c 顯示）。常溫放置至第4 天時(shí)，UMNSAH/DF-1 胞體“空泡化”現(xiàn)象顯著增加（如圖3d 顯示）。而未灌滿完全培養(yǎng)液的UMNSAH/DF-1 細(xì)胞從第2 天開始細(xì)胞增殖顯著減少，細(xì)胞狀態(tài)相較于灌滿培養(yǎng)液組較差（如圖3f-3h 顯示）。

圖2 模擬活細(xì)胞株常溫運(yùn)輸?shù)沫h(huán)境實(shí)時(shí)溫度曲線（天）

圖3 探究常溫放置0 天、1 天、2 天、4 天時(shí)灌滿完全培養(yǎng)液（圖3a-3d）與未灌滿完全培養(yǎng)液（圖3e-3h）對(duì)MNSAH/DF-1 細(xì)胞生長狀態(tài)及“空泡化”程度的影響

2.3 探究傳代培養(yǎng)對(duì)UMNSAH/DF-1 細(xì)胞生長及“空泡化”的影響

當(dāng)發(fā)現(xiàn)室溫放置4 天后的UMNSAH/DF-1 細(xì)胞胞體開始出現(xiàn)大量的“空泡”時(shí)，我們嘗試將該細(xì)胞進(jìn)行正常傳代后置于39 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)觀察培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：UMNSAH/DF-1 細(xì)胞內(nèi)的“空泡”數(shù)量又會(huì)顯著減少，且隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加UMNSAH/DF-1 細(xì)胞生長狀態(tài)也逐漸恢復(fù)正常，不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增培養(yǎng)（如圖4 顯示）。由此可見：將UMNSAH/DF-1 細(xì)胞置于室溫放置時(shí)間越長，胞體“空泡化”現(xiàn)象越顯著，嚴(yán)重時(shí)可直接影響細(xì)胞后續(xù)的生長狀態(tài)，而傳代培養(yǎng)對(duì)UMNSAH/DF-1 細(xì)胞出現(xiàn)大量“空泡化”現(xiàn)象后具有明顯的改善效果。

圖4 探究傳代培養(yǎng)對(duì)MNSAH/DF-1 細(xì)胞生長狀態(tài)及“空泡化”程度的影響

3 結(jié)論

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，生長溫度下對(duì)UMNSAH/DF-1 細(xì)胞的生長狀態(tài)及“空泡化”程度的影響非常顯著。相較于37 ℃，39 ℃的培養(yǎng)溫度更有利于UMNSAH/DF-1 細(xì)胞的生長，同時(shí)也可顯著減少UMNSAH/DF-1 細(xì)胞胞體“空泡化”現(xiàn)象的發(fā)生。而通過常溫運(yùn)輸U(kuò)MNSAH/DF-1活細(xì)胞時(shí)，UMNSAH/DF-1 細(xì)胞在室溫環(huán)境中放置的時(shí)間越久，其胞體“空泡化”現(xiàn)象就會(huì)越明顯，且灌滿完全培養(yǎng)液后進(jìn)行運(yùn)輸?shù)幕罴?xì)胞株?duì)顟B(tài)相較于未灌滿培養(yǎng)液組來說細(xì)胞生長狀態(tài)會(huì)更好。但是將產(chǎn)生大量“空泡”的UMNSAH/DF-1 細(xì)胞進(jìn)行正常傳代培養(yǎng)后，其胞體“空泡”的數(shù)量又會(huì)顯著減少，且隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，UMNSAH/DF-1 細(xì)胞又會(huì)逐漸恢復(fù)至其正常的生長狀態(tài)?？傊?，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：相較于37 ℃，39 ℃的生長溫度與傳代培養(yǎng)可顯著改善UMNSAH/DF-1 細(xì)胞生長狀態(tài)及“空泡化”程度。UMNSAH/DF-1 細(xì)胞在常溫運(yùn)輸過程中也更容易受到溫度波動(dòng)的影響，溫度過低時(shí)細(xì)胞胞體會(huì)產(chǎn)生大量的空泡。但是將收到的UMNSAH/DF-1 細(xì)胞進(jìn)行正常傳代處理后細(xì)胞就會(huì)逐漸恢復(fù)至其正常狀態(tài)。