膜分離法提高麥芽四糖糖漿純度的研究

李佳明,張宏建,王靚,陳旭升,張建華*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)2(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無(wú)錫,214122)

麥芽四糖(maltotetraose, G4)是一種由4個(gè)α-D-吡喃葡萄糖單元以α-1,4-糖苷鍵連接而成的典型的直鏈麥芽低聚糖[1]。由于其黏度高[2]、熱量低、保濕性能好、增稠作用強(qiáng)、能延緩淀粉老化[3]以及成膜能力好等特性,在食品和化妝品領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用;此外由于其易于消化吸收,能促進(jìn)人體對(duì)鈣離子的吸收,改善腸道環(huán)境,并且不易被酵母利用等特點(diǎn),也常應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)。因此,對(duì)于麥芽四糖的研究也受到了廣泛的關(guān)注。

目前麥芽四糖主要通過(guò)酶法制備,其中包括淀粉液化、糖化、分離等步驟。KIMURA等[4]將麥芽四糖生成酶(EC 3.2.1.60)固定在大孔疏水樹(shù)脂上實(shí)現(xiàn)了麥芽四糖的連續(xù)生產(chǎn),并在1990年采用固定床型生物反應(yīng)器完成了麥芽四糖的生產(chǎn)[5]。錢瑩等[6]通過(guò)對(duì)糖化pH、溫度等條件進(jìn)行了優(yōu)化,得到了純度為52%的麥芽四糖,但并未給出優(yōu)化后的具體操作條件。信成夫等[7]對(duì)糖化pH、溫度、糖化程度進(jìn)行了正交優(yōu)化,得到了純度為57%的麥芽四糖。事實(shí)上,純度高于95%的麥芽四糖常用于標(biāo)準(zhǔn)品的定量分析,而純度高于80%的麥芽四糖則在食品以及化妝品行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用。目前市售的高純度麥芽四糖一般用于定量分析的標(biāo)準(zhǔn),通常是采用色譜法制得,但是該方法是間歇性的,并且效率很低,不適用于大規(guī)模生產(chǎn)。LI等[8]采用模擬移動(dòng)床將麥芽四糖純度提高至81%,但麥芽四糖的收率只有69%,此外該方法具有耗水量大等弊端。在純化的策略中,膜分離法由于其節(jié)能、高效、環(huán)保、過(guò)程簡(jiǎn)單、無(wú)相變等優(yōu)點(diǎn)[9-10],而被大家所看好。DE OLIVEIRA等[11]采用納濾法從甘蔗水解液中回收低聚木糖;SCHMIDT等[12]以果糖、乳糖混合溶液為研究對(duì)象,探究了溫度、壓力和濃度對(duì)納濾分離單糖與二糖的影響;BANDINI等[13]對(duì)采用納濾法結(jié)晶母液中回收葡萄糖的可能性進(jìn)行了研究。但目前采用膜分離法來(lái)提高麥芽四糖含量尚未見(jiàn)到報(bào)道。

本文旨在完成麥芽四糖的純化,得到高純度的產(chǎn)品,應(yīng)用于科研等各個(gè)行業(yè)中。為此,本研究采用“超濾+納濾“組合的膜分離法,嘗試去除糖化副產(chǎn)物,將產(chǎn)品中麥芽四糖的純度提升至80%以上。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

麥芽四糖糖漿,實(shí)驗(yàn)室自制;葡萄糖(glucose,G1)、麥芽糖(maltose,G2)、麥芽三糖(maltoriose,G3)、麥芽四糖(G4)標(biāo)準(zhǔn)品,上?；菡\(chéng)生物科技有限公司;醋酸鈉、無(wú)水乙醇、HCl、NaOH等常規(guī)試劑,分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)所用膜均為1812型卷式膜,泰州星達(dá)膜科技有限公司,基本參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 膜性質(zhì)Table 1 Membrane properties

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

XK-1812膜分離設(shè)備,南京軒科環(huán)?？萍加邢薰?HH-602型水浴鍋,常州金壇良友儀器有限公司;HPAEC-PAD配有脈沖電流檢測(cè)器的高效陰離子交換色譜,美國(guó)Thermo Scientific有限公司。

圖1 膜分離系統(tǒng)示意圖Fig.1 Schematic diagram of membrane system

1.3 膜分離過(guò)程

在進(jìn)料質(zhì)量濃度10 g/L,跨膜壓差1.0 MPa,操作溫度25 ℃的條件下,根據(jù)分離系數(shù)、滲透通量、各糖截留率等指標(biāo)進(jìn)行膜的篩選。在此基礎(chǔ)上,對(duì)跨膜壓差、溫度、進(jìn)料濃度等操作件進(jìn)行優(yōu)化,每次實(shí)驗(yàn)進(jìn)料體積4 L。為確保系統(tǒng)穩(wěn)定,每改變操作條件時(shí),循環(huán)30 min系統(tǒng)穩(wěn)定后測(cè)定滲透通量并取樣分析。

間歇滲濾的進(jìn)料體積為4 L,在進(jìn)料質(zhì)量濃度15 g/L,跨膜壓差1.0 MPa,操作溫度35 ℃的條件下,當(dāng)截留液體積降到原始體積一半時(shí),向截留液中加入去離子水恢復(fù)至原始體積,重復(fù)此過(guò)程5次。

1.4 玉米淀粉酶解產(chǎn)物組成的分析

取一定質(zhì)量的麥芽四糖糖漿,稀釋后取上清液并過(guò)0.22 μm水系膜,用HPAEC-PAD分析酶解產(chǎn)物中低聚糖組成[14-15]。

1.5 糊精分子質(zhì)量的分析

參照王寶石[16]的方法測(cè)定糊精分子質(zhì)量分布特征。

1.6 膜通量

膜分離操作過(guò)程中,料液循環(huán)30 min,待系統(tǒng)穩(wěn)定后收集并計(jì)量1 min內(nèi)的滲透液體積,按公式(1)計(jì)算膜通量(Jp):

(1)

式中:Jp,膜通量,L/(h·m2);Vp,滲透液體積,L;Am,有效過(guò)濾面積,0.2 m2;t,過(guò)濾時(shí)間,h。

1.7 溶質(zhì)截留率的計(jì)算

按1.4節(jié)的方法檢測(cè)料液與滲透液中G1、G2、G3、G4的質(zhì)量濃度,按公式(2)計(jì)算截留率(R):

(2)

式中:ρf,進(jìn)料液溶質(zhì)濃度,g/L;ρp,滲透液溶質(zhì)濃度,g/L。

1.8 分離系數(shù)

分離系數(shù)在本實(shí)驗(yàn)中用于評(píng)估G4、G3兩種物質(zhì)的分離效率(α),其計(jì)算公式(3)為:

(3)

式中:p,滲透液,f,料液;ρG4、ρG3分別為G4、G3的質(zhì)量濃度,g/L;RG3、RG4分別為G3、G4的截留率。

1.9 濃縮因子

濃縮過(guò)程中的濃縮因子定義如公式(4)所示:

(4)

式中:V0,初始時(shí)進(jìn)料體積,L;VR,濃縮結(jié)束時(shí)的進(jìn)料體積,L。

1.10 純度

純度的計(jì)算如公式(5)所示:

(5)

式中:Pn,某一小分子糖的純度,%;ρn,某一小分子糖的質(zhì)量濃度,g/L;ρ,樣品中G1-G4的總質(zhì)量濃度,g/L。

1.11 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為3次實(shí)驗(yàn)的平均值,用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示;采用Origin 2021、Excel軟件處理數(shù)據(jù)和作圖;用SPSS 20的單因素方差分析(ANOVA)和Student-Newman-Keuls 程序進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾預(yù)處理糖化產(chǎn)物

因麥芽四糖糖漿中除小分子糖外,仍然有大分子質(zhì)量糊精的存在,這會(huì)給后續(xù)的納濾操作帶來(lái)很大影響。因此采用截留分子質(zhì)量為1 000 Da的超濾膜(XT),在進(jìn)料質(zhì)量濃度10 g/L,跨膜壓差0.6 MPa,操作溫度25 ℃下對(duì)麥芽四糖糖漿進(jìn)行預(yù)處理。表2所示為超濾前后各糖的純度、小分子糖總濃度以及糊精分子質(zhì)量分布的變化,可以看出超濾前后各糖純度及小分子糖總濃度差異較小,說(shuō)明此超濾膜做到了對(duì)小分子糖的回收,避免了操作過(guò)程中目標(biāo)產(chǎn)物的損失,同時(shí)超濾后高分子質(zhì)量聚集區(qū)的所占面積減少了72%,且重均分子質(zhì)量從37.90 kDa下降到了10.08 kDa,表明超濾除去了大量的大分子質(zhì)量糊精,為后續(xù)納濾純化麥芽四糖打下了基礎(chǔ)。

表2 超濾前后的糊精分子質(zhì)量分布、各糖純度及小分子糖總濃度Table 2 The molecular weight distribution of dextrin, the purity of each sugar and the total concentration of small molecular sugar before and after ultrafiltration were analyzed

2.2 納濾膜的篩選

以小分子糖總質(zhì)量濃度為10 g/L的麥芽四糖超濾滲透液為原料,在跨膜壓差1.0 MPa,操作溫度25 ℃下進(jìn)行了各納濾膜的篩選,結(jié)果如表3所示。隨著納濾膜截留分子質(zhì)量的提高,其滲透通量也在不斷上升。除膜NFG外,其他納濾膜的G4截留率均保持在97%以上,有利于G4的回收,其中膜NFX較膜NFW、NDF,有最低的G2、G1截留率,最高的分離系數(shù)(G4/G3),更有利于完成G4與其他小分子糖的分離,達(dá)到提高麥芽四糖純度的目標(biāo)。因此在后續(xù)的研究中,選擇膜NFX進(jìn)行研究。

表3 各納濾膜的分離性能Table 3 Separation performance of each membrane

2.3 跨膜壓差對(duì)膜NFX分離性能的影響

在以壓力為驅(qū)動(dòng)力的納濾過(guò)程中,跨膜壓差是主要的傳質(zhì)驅(qū)動(dòng)力,也是影響截留率、滲透通量、膜污染的重要因素。以小分子糖總質(zhì)量濃度為10 g/L超濾滲透液為原料,在操作溫度為25 ℃下,探究跨膜壓差對(duì)膜NFX分離性能的影響。隨著跨膜壓差的增加,納濾膜滲透通量的變化呈現(xiàn)先升高、在1.0 MPa后增長(zhǎng)趨勢(shì)變緩慢(圖2-a)。這可以通過(guò)Darcy定律與串聯(lián)阻力模型來(lái)解釋,當(dāng)跨膜壓差較低時(shí),傳質(zhì)阻力的變化較小,滲透通量隨著傳質(zhì)推動(dòng)力(跨膜壓差)的增加而增加,當(dāng)跨膜壓差繼續(xù)增加時(shí),膜表面的污染以及濃差極化的加劇,傳質(zhì)阻力的變化程度強(qiáng)于跨膜壓差的變化,導(dǎo)致滲透通量不再增加。

a-跨膜壓差對(duì)滲透通量以及分離系數(shù)的影響;b-跨膜壓差對(duì)各物質(zhì)截留率的影響

圖2-b顯示了在其他條件都相同時(shí),跨膜壓差對(duì)各小分子糖截留率的影響。膜NFX對(duì)G4、G3的截留率維持在較高水平,且隨著跨膜壓差的增加而緩慢增長(zhǎng),但G2、G1的截留率有較為明顯的上升趨勢(shì)。通常情況下,跨膜壓差對(duì)納濾過(guò)程的影響有2種競(jìng)爭(zhēng)現(xiàn)象。一方面,壓力的增加導(dǎo)致溶劑通量的增加,但溶質(zhì)的傳輸受到空間效應(yīng)和電效應(yīng)的阻礙。因此,較高的溶劑滲透通量導(dǎo)致較低的滲透物濃度,從而造成截留率的增加;另一方面,跨膜壓差的增加會(huì)將更多的溶質(zhì)輸送到膜表面,并導(dǎo)致更高的濃差極化效應(yīng),并且溶質(zhì)在高濃度梯度下有通過(guò)膜輸送的趨勢(shì)。濃差極化甚至可通過(guò)降低電荷效應(yīng)導(dǎo)致溶質(zhì)截留率降低[17]。這兩個(gè)過(guò)程將決定納濾膜在不同跨膜壓差下的最終截留率[18]。

在1.0 MPa下膜NFX的G4平均截留率為99.29%。繼續(xù)增加跨膜壓差,雖然能得到更高的滲透通量,分離系數(shù)(G4/G3)也會(huì)增加,但滲透通量的提升十分有限,而更高的跨膜壓差會(huì)增加分離G2、G1的難度,也會(huì)增加運(yùn)行成本。因此,在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選擇跨膜壓差為1.0 MPa進(jìn)行其他條件的探究。

2.4 操作溫度對(duì)納濾膜NFX分離性能的影響

以小分子糖總質(zhì)量濃度為10 g/L超濾滲透液為原料,在1.0 MPa下,探究操作溫度對(duì)膜NFX分離性能的影響。隨著操作溫度的不斷升高,滲透通量也隨之升高(圖3-a)。TSURU等[19]對(duì)這種現(xiàn)象給出了3種解釋:1)溶劑分子在較高溫度下增加的熱能,使得它們能夠克服由于孔壁摩擦力在微孔中產(chǎn)生的能量勢(shì)壘;2)由于親水性空隙表面上的吸附水層變薄,導(dǎo)致有效孔徑隨著溫度增加而增加;3)高溫降低了料液黏度,從而導(dǎo)致滲透通量升高。

a-操作溫度對(duì)各物質(zhì)滲透通量和分離系數(shù)的影響;b-操作溫度對(duì)各物質(zhì)截留率的影響

如圖3-b所示,隨著操作溫度的增加,G4截留率并沒(méi)有明顯變化,G3的截留率從97.67%下降到91.49%,G2 的截留率從80.53%下降到63.71%,G1的截留率從26.17%下降到14.91%。操作溫度的增加,提高了G4與G3的分離系數(shù)(圖3-b),進(jìn)一步增強(qiáng)了膜NFX的分離性能。這是由于溫度的升高加強(qiáng)了水與溶質(zhì)的傳質(zhì)[20],同時(shí)也增強(qiáng)了溶質(zhì)的擴(kuò)散作用[21],并使得膜孔徑熱膨脹,加強(qiáng)了溶質(zhì)通過(guò)膜的運(yùn)輸,最終導(dǎo)致G3、G2、G1,截留率下降,滲透通量增加。

由于當(dāng)溫度高于35 ℃時(shí),G4與G3分離系數(shù)(圖3-b)不再發(fā)生變化,且滲透通量的增加也較為緩慢,更高的操作溫度也會(huì)導(dǎo)致納濾膜使用壽命的衰減,因此選擇35 ℃作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的操作溫度。

2.5 進(jìn)料濃度對(duì)納濾膜NFX分離性能的影響

在操作壓力為1.0 MPa,操作溫度為35 ℃下,探究進(jìn)料濃度對(duì)納濾膜NFX分離性能的影響。隨著進(jìn)料濃度的升高,滲透通量不斷下降(圖4-a)。這是由于進(jìn)料濃度越大,在操作過(guò)程中越容易出現(xiàn)濃差極化現(xiàn)象[12],進(jìn)而導(dǎo)致滲透通量的降低;此外,進(jìn)料濃度的增加,也會(huì)增加溶液黏度并增厚動(dòng)態(tài)膜[22],使得糖類物質(zhì)附著在膜表面,進(jìn)一步加劇膜污染,使得傳質(zhì)阻力升高。另外更高的進(jìn)料濃度也會(huì)增加滲透壓,降低膜分離的有效推動(dòng)力最終導(dǎo)致滲透通量降低。因此,選擇合適的進(jìn)料濃度對(duì)麥芽四糖的分離純化具有重要指導(dǎo)作用。

a-進(jìn)料濃度對(duì)滲透通量以及分離系數(shù)的影響;b-進(jìn)料濃度對(duì)各物質(zhì)截留率的影響

不同進(jìn)料濃度下,各糖截留率的變化如圖4-b所示。隨著進(jìn)料濃度的升高,G4、G3的截留率變化較小,其中G4的截留率逐漸接近99%,而G2、G1的截留率則呈現(xiàn)先增加后趨于平緩的趨勢(shì)。同時(shí)隨著進(jìn)料濃度的增加,分離系數(shù)也不斷增加。這是由于進(jìn)料濃度增加,會(huì)增強(qiáng)濃差極化并導(dǎo)致動(dòng)態(tài)膜加厚[23],最終導(dǎo)致各小分子糖的截留率都有不同程度的上升。在一些研究中,因?yàn)闈獠顦O化作用占主導(dǎo),出現(xiàn)了隨著進(jìn)料濃度的增加,溶質(zhì)截留率降低的現(xiàn)象[12]。

在進(jìn)料質(zhì)量濃度低于15 g/L時(shí),G1、G2的截留率增長(zhǎng)較為緩慢,而當(dāng)進(jìn)料質(zhì)量濃度高于15 g/L時(shí),G1、G2截留率則出現(xiàn)了明顯的上升趨勢(shì),分離難度上升,雖然分離系數(shù)一直處于增加的狀態(tài),但這主要是G4截留率高造成的。而當(dāng)進(jìn)料質(zhì)量濃度高于15 g/L時(shí),滲透通量的下降較為迅速,也將延長(zhǎng)分離操作時(shí)間,增加了染菌的風(fēng)險(xiǎn)。因此在綜合考慮下,選擇進(jìn)料質(zhì)量濃度為15 g/L作為后續(xù)研究的初始進(jìn)料濃度。

按照上述優(yōu)化后的操作條件,納濾至不產(chǎn)水時(shí)G4純度由73.40%提高至78.20%,未能達(dá)到G4純度80%的分離目標(biāo)。因此后續(xù)采用間歇滲濾進(jìn)一步提高G4的純度。

2.6 間歇滲濾

在間歇滲濾過(guò)程中,每階段濃縮后,加入純水的進(jìn)料溶液成為下一階段的濃縮進(jìn)料液。濃縮步驟采用膜NFX在錯(cuò)流下進(jìn)行,其中進(jìn)料質(zhì)量濃度15 g/L,操作溫度35 ℃,跨膜壓差1.0 MPa,各階段的濃縮因子為2。間歇滲濾過(guò)程中通量的變化如圖5-a所示,整個(gè)過(guò)程分為5個(gè)階段,總操作時(shí)間約1.72 h。在各濃縮階段中,溶質(zhì)濃度隨著濃縮時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,造成濃差極化以及膜污染加劇[24],導(dǎo)致滲透通量隨著操作時(shí)間的延長(zhǎng)而減少?？梢灶A(yù)見(jiàn)的是,在間歇滲濾期間對(duì)進(jìn)料溶液的再稀釋會(huì)對(duì)滲透通量有積極的影響。一旦進(jìn)料溶液被再稀釋,滲透通量就能增加到初始值甚至更高。在第一個(gè)濃縮階段中,滲透通量由初始的32.54 L/(m2·h),在20 min后下降到26.22 L/(m2·h)。但在經(jīng)過(guò)對(duì)第一階段截留液加水稀釋后,滲透通量恢復(fù)至35.29 L/(m2·h),說(shuō)明滲濾過(guò)程中濃差極化的影響有限[25]。溶質(zhì)濃度在間歇滲濾過(guò)程中的變化如圖5-b所示,由于間歇滲率過(guò)程中除去了一些小分子低聚糖,溶質(zhì)濃度隨著每個(gè)階段的間歇滲濾而降低。由于各物質(zhì)的截留率不同,如圖5-c所示,當(dāng)進(jìn)行到第四階段時(shí),葡萄糖已被基本去除,在第五階段時(shí)G4回收率為92.15%。由圖5-d可以看出,在第二階段時(shí)G4純度已經(jīng)從最開(kāi)始的73.54%提升至80.71%,達(dá)到了分離目標(biāo),在第五階段時(shí),G4純度達(dá)到87.14%。

a-滲透通量;b-總糖濃度的變化;c-各低聚糖濃度占比的變化;d-G4純度的變化

3 結(jié)論

本文采用“超濾+納濾“組合膜分離的方法來(lái)提高G4的純度。截留分子質(zhì)量1 000 Da的超濾膜可以去除大分子質(zhì)量糊精,同時(shí)回收小分子糖,適用于納濾前的糖漿預(yù)處理;截留分子質(zhì)量為150～300 Da的納濾膜(NFX),對(duì)G4的截留率高,對(duì)其他小分子糖截留率較低,適用于提高G4純度;在最優(yōu)操作條件下納濾后G4純度由73.40%提升至78.20%;進(jìn)一步經(jīng)過(guò)濃縮因子為2的5個(gè)階段的間歇滲濾,在第二階段完成了將G4純度從73.54%提升至80%的目標(biāo),并在第五階段將G4純度提升至87.14%,G4回收率達(dá)92.15%。由于G4與G3相對(duì)分子質(zhì)量相近,膜分離雖然不能完成兩者的絕對(duì)分離,但可以提高產(chǎn)品中麥芽四糖的比例,對(duì)進(jìn)一步研究麥芽四糖的應(yīng)用價(jià)值就有重要意義。