AB-8樹脂聯(lián)用C18柱分離牡丹籽粕中新橙皮苷及生物活性研究

鄒平,陳文濤,胡建剛,徐瑩,張迎陽,孫承駿,夏煒芳,高蕙文

1(常州大學(xué) 藥學(xué)院/生物與食品工程學(xué)院,江蘇 常州,213164)2(紹興市食品藥品檢驗研究院,浙江 紹興,312071)3(常州市食品藥品纖維質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心,江蘇 常州,213022)

牡丹是中國特有的植物[1],具有良好的觀賞和藥用價值,是一種重要的經(jīng)濟作物,具有數(shù)千年的生長和栽培歷史。油牡丹是一種牡丹品種,牡丹籽可用于制備食用油。牡丹籽粕為牡丹籽榨油后的副產(chǎn)品,目前的研究表明,已經(jīng)從牡丹籽粕提取了許多種類的活性成分,包括黃酮類化合物[2],多酚[3],功能性多糖[4]等。許多報告表明,類黃酮具有許多有益的生物學(xué)特性[5-6],例如抗氧化、抗炎、抗病毒和抗腫瘤特性。新橙皮苷是一類純天然的類黃酮物質(zhì),有著強大的抗氧化和抗炎作用,它能夠誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞凋亡,并且在DPPH自由基消除實驗中顯示出顯著的抗氧化活性[7]。新橙皮苷可以顯著促進胃分泌物和胃酸產(chǎn)生量,從而增加服用葡萄糖耐量和胰島素敏感度,并且明顯降低血糖小鼠的胰島素抵抗,并且有效降低血清甘油三酯、總膽固醇、瘦素水平和肝功能指標(biāo),從而達到治療疾病的目的[8]。CHEN等[9]建立了一種利用高效液相紫外光譜(HPLC-ultra-violet spectroscopy, HPLC-UV)分離定量新橙皮苷的方法,新橙皮苷的檢測限(limit of detection, LOD)和定量限(limit of quantitation, LOQ)分別低于0.84 mg/mL和2.84 mg/mL;UCHIYAMA等[10]通過正相HPLC分離商業(yè)樣品中的新橙皮苷,相對比例為84%;WANG等[11]構(gòu)建了一種新型乙醇兩相系統(tǒng)(ethanolic two-phase system, ETPS),用于從柚子中分離新橙皮苷,回收率為68.03%;DALMAU等[12]利用超聲輔助的方法從橙副產(chǎn)物中提取新橙皮苷,提取率為39%。新橙皮苷作為黃酮類化合物的一種,具有較強的生物活性,WANG等[13]評估了新橙皮苷的抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)新橙皮苷通過激活人骨肉瘤細胞中的ROS/JNK通路引起G2/M期阻滯并誘導(dǎo)細胞凋亡和自噬;ORTIZ等[14]研究發(fā)現(xiàn)新橙皮苷具有抗破骨細胞和抗炎作用,抑制破骨細胞標(biāo)志物的表達,降低活性氧、促炎細胞因子和基質(zhì)金屬蛋白酶水平;ZHANG等[15]證實了新橙皮苷在影響細胞凋亡、細胞生長、腫瘤發(fā)生和腫瘤微環(huán)境中起著重要作用。

本實驗通過前期探索,利用有機溶劑提取牡丹籽粕中的黃酮類化合物(flavonoids in peony seed meal,PMSF),借助吸附動力學(xué)篩選出AB-8大孔樹脂與C18柱聯(lián)用分離新橙皮苷的方法,同時探究了新橙皮苷的生物活性(抗氧化、抑制癌細胞增殖),分子動力學(xué)模型揭示了其抑制癌細胞增殖的作用機理,為進一步開發(fā)牡丹籽粕產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

油牡丹籽粕,中國江蘇國色天香油用牡丹科技發(fā)展有限公司;蘆丁、無水乙醇、乙腈、三氟乙酸、DPPH、ABTS、氯化硝基四氮唑藍(nitrotetrazolium chloride,NBT)、吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate,PMS)、NADH(均為分析純),阿拉丁(上海)生物試劑公司;C18球形硅膠柱,常州三泰生物科技公司;大孔樹脂AB-8、X-5、DM301、CAD-40、D101、NKA,廣州偉伯科技有限公司。

721 N可見光分光光度計,上海儀電分析儀器有限公司;多功能離心機,德國Eppendorf公司;SHB-ⅢA環(huán)水式真空泵,上海聚昆儀器設(shè)備有限公司;ATY224精密電子天平,常州萬泰天平儀器有限公司;UV-3600紫外可見近紅外分光光度計,島津企業(yè)管理(中國)有限公司;Q ExactiveTMPlus 質(zhì)譜儀,賽默飛世爾科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PMSF的處理

1.2.1.1 PMSF的提取

將牡丹籽粕經(jīng)過粉碎機破碎后,篩選出5.00 g粉末,加入乙醇溶劑,放入恒溫磁力攪拌機中。根據(jù)實驗室前期實驗[16]結(jié)果可知PSMF提取的最佳條件為料液比1∶15,浸提溫度50 ℃,乙醇體積分數(shù)70%,浸提時間30 min,此時PSMF質(zhì)量濃度最高,為(234.84±1.17) mg/mL。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

PSMF含量的測定方法根據(jù)文獻[16]修改如下:取10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品配制50 mg/mL對照液,稀釋成0.0～50.0 mg/mL不同質(zhì)量濃度梯度,再加入5 mL 10 g/L AlCl3溶液,搖勻后靜置10 min,以吸光度(y)為縱坐標(biāo),蘆丁含量(x)為橫坐標(biāo)在415 nm處測定吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。蘆丁對照品溶液在0.00～50.00 mg/mL,吸光度與蘆丁的濃度呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為:y=(0.03±2.01E-4)x+(0.01±0.006),R2=0.999 45。

1.2.2 大孔樹脂的篩選

1.2.2.1 大孔樹脂預(yù)處理

本實驗選取了6種不同性質(zhì)(弱極性、中極性和非極性)的大孔樹脂,它們是AB-8、X-5、DM301、CAD-40、D101和NKA。為了確保大孔樹脂的分離性質(zhì)[17],先用95%乙醇(體積分數(shù))浸泡24 h,接著用蒸餾水多次沖刷,直到?jīng)]有明顯的酒精味,流出液無渾濁后。最后,用40 g/L NaOH浸泡24 h,以除去樹脂合成過程中的雜物,以免對樣品吸收產(chǎn)生負面影響。將處理過的樹脂用蒸餾水徹底洗凈,之后用雙層濾紙過濾,以備后續(xù)使用。

1.2.2.2 大孔樹脂的參數(shù)

不同性質(zhì)的大孔樹脂對于不同極性的物質(zhì)具有不同分離效果,綜合比較6種不同大孔樹脂的吸附率、解吸率的差異來篩選樹脂。不同樹脂參數(shù)見表1。

表1 六種不同大孔樹脂的性質(zhì)比較Table 1 Comparison of properties of six different macroporous resins

1.2.2.3 吸附率的計算

從AB-8、X-5、DM301、CAD-40、D101和NKA共6種大孔樹脂溶液中取出5 g,放入錐形瓶內(nèi),加入20 mL PMSF溶液,恒溫振蕩12 h(30 ℃,120 r/min),取出上清液,計算溶液中剩余PMSF濃度。吸附速率的計算如公式(1)所示:

(1)

1.2.2.4 解吸率的計算

將大孔樹脂溶液放入錐形瓶內(nèi),加入20 mL 75%乙醇,并將其放入恒溫振蕩箱中,在30 ℃、120 r/min的恒溫條件下,充分吸收12 h,取上清液測定溶液中剩余PMSF含量,這是因為乙醇可以與大孔樹脂溶液中的分子態(tài)產(chǎn)物競爭吸附,使產(chǎn)物溶解于乙醇,從而從大孔樹脂溶液上解析出PMSF。解吸率的計算如公式(2)所示:

(2)

式中:A1,吸附前溶液中PMSF含量,mg/mL;A2,吸附后溶液中剩余PMSF含量,mg/mL;A3,解吸后溶液中PMSF含量,mg/mL;V1,解吸液體積,mL;V2,吸附液體積,mL。

1.2.2.5 吸附動力學(xué)

吸附動力學(xué)研究在振蕩培養(yǎng)箱中以25 r/min的速度在30 ℃下進行。分別在0～120 min每10 min對來自6種不同樹脂樣品進行紫外分析。以上述清液中PMSF的濃度為橫坐標(biāo),以吸附平衡時的吸附量為縱坐標(biāo),繪制出樹脂準(zhǔn)一級動力學(xué)模型和準(zhǔn)二級動力學(xué)模型的等溫吸附曲線[18]。同時,利用Langmuir和Freundlich吸附模型[19],得到了相應(yīng)的等溫吸附方程。其計算如公式(3)和公式(4)所示:

準(zhǔn)一級動力學(xué)方程為:

ln(Qe-Qt)=lnQe-K1×t

(3)

準(zhǔn)二級動力學(xué)方程為:

此外，TGF-β還可抑制MMPs的活性以及誘導(dǎo)蛋白酶抑制劑如纖溶酶原激活物抑制劑1 (plasminogen activator inhibitor 1,PAI-1)和金屬蛋白酶組織抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)的合成，發(fā)揮基質(zhì)保存作用[24-25]。

(4)

式中:Qe,樹脂在PMSF吸收穩(wěn)定時的吸收量,mg/g;Qt,t時刻樹脂的吸收量,mg/g;K1和K2,動力學(xué)參數(shù)。

Langmuir等溫吸附如公式(5)所示:

(5)

Freundlich等溫吸附如公式(6)所示:

(6)

式中:Ce,吸收完全后溶液中PMSF的含量,mg/L;Qe,吸收穩(wěn)定時的吸收量,mg/L;Qm,最大吸附量,mg/L;Ka,Langmuir方程式中大孔樹脂與PMSF之間推動力的大小程度;Kb,Freundlich方程式中與大孔樹脂吸附量有關(guān)的系數(shù)。

1.2.3 動態(tài)洗脫工藝的確定

1.2.3.1 確定最佳上樣流速

選用30 mm×300 mm的層析柱,將層析柱垂直安裝,采用濕法裝柱,將大孔樹脂裝入層析柱后用蒸餾水沖洗平衡,然后上樣10 mL 1 mg/mL的PMSF液。實驗選擇了2、4、6、8、10 BV/h的流速進行收集。在大孔樹脂吸附30 min,加入75%乙醇,每管收集1 mL。然后,按照1.2.1.2節(jié)的方法計算了PMSF含量,并繪制曲線,確定最佳上樣流速。

1.2.3.2 確定最佳上樣量

采用最佳上樣速率開始采集,每管采集1 mL,測量PMSF含量,描繪泄漏曲線,確定最佳上樣量。

1.2.3.3 確定最佳乙醇洗脫濃度

通過控制最佳上樣量和流速,以及使用不同濃度的乙醇加以洗脫,每管收集1 mL,計算PMSF含量,描繪曲線,確定最佳乙醇洗脫濃度。

1.2.3.4 確定最佳洗脫速度

實驗洗脫流速分別為1、2、3、4、5、6 mL/min。每管收集1 mL,測定PMSF含量,繪制曲線,確定最佳洗脫速度。

1.2.3.5 大孔樹脂分離

根據(jù)最佳上樣量、最佳上樣流速、最佳乙醇洗脫濃度、最佳洗脫速度進行吸附分離,分離后的不同組分測試其抗氧化能力。

1.2.4 C18柱分離

C18球形硅膠柱選用常州三泰科技公司分離柱,粒徑15 mm,孔徑100 ?,具體信息見表2。流動相選用含有0.1%三氟乙酸的70%乙腈-水溶液(體積分數(shù)),選用經(jīng)大孔樹脂分離后的組分上樣,上樣量為2 mL,流速1 mL/min。

表2 C18球形硅膠柱性質(zhì)Table 2 Properties of C18 spherical silica gel column

1.2.5 抗氧化活性

1.2.5.1 DPPH自由基清除率

根據(jù)文獻[20],稍加修改。分別配制成質(zhì)量濃度(200、400、600、800、1 000 mg/mL)的PMSF。將1 mL 0.2 mmol/L DPPH自由基溶液(95%乙醇溶解)加入3 mL樣品,避光反應(yīng)30 min,517 nm處測定了樣品的吸光度?？瞻诪? mL樣品+3 mL 95%乙醇,對照為1 mL DPPH+3 mL 95%乙醇溶液。在相同條件下測定A517。DPPH自由基清除率的計算如公式(7)所示:

(7)

式中:As、Ab,樣品和空白的吸光度。

1.2.5.2 超氧陰離子自由基清除率

參照文獻[20]并稍加修改。具體方法如下,分別配制成質(zhì)量濃度(200、400、600、800、1 000 mg/mL)的PMSF。1.5 mL PMSF液,依次加入0.5 mL 300 mmol/L NBT(pH 8.0 Tris-HCl緩沖液配制),0.5 mL 468 mmol/L NADH(pH 8.0 Tris-HCl緩沖液配制),0.5 mL 60 mmol/L PMS(pH 8.0 Tris-HCl緩沖液配制),沖擊混合,25 ℃水浴5 min,560 nm處測定光吸收值,以緩沖液代替樣品作為空白對照。超氧陰離子自由基清除率的計算如公式(8)所示:

(8)

式中:As、Ab,樣品和空白吸光度。

1.2.5.3 ABTS陽離子自由基清除率

根據(jù)文獻[20]的方法進行。將5 mL 7 mmol/L ABTS溶液與88 mL 140 mmol/L過硫酸鉀溶液混合,在20 ℃下放置20 h,加入約3倍75%乙醇,在734 nm處的吸光度為0.70±0.02,得到ABTS陽離子溶液。分別配制成質(zhì)量濃度200、400、600、800、1 000 mg/mL的PMSF。樣品由9.8 mL稀釋的ABTS陽離子溶液和0.2 mL PMSF組成。以0.2 mL蒸餾水和9.8 mL稀釋的ABTS陽離子溶液的混合物為空白,以0.2 mL PMSF和9.8 mL蒸餾水為對照。所有混合物在室溫下放置0.5 h,用分光光度計在734 nm處測定。ABTS陽離子自由基清除活性的計算如公式(9)所示:

(9)

式中:As、Ac和Ab,樣品、對照和空白的吸光度。

1.2.5.4 MTT法檢測PC12細胞存活率

將PC12細胞密度為1×105個/mL,將其直接注射于96孔細胞培養(yǎng)板中,經(jīng)過24 h的預(yù)培育后,將培養(yǎng)基吸去,加入100 mL無血清培養(yǎng)液,其中含有25 mmol/L PMSF,并設(shè)置對照組和空白組,每組4個重復(fù)實驗。在PMSF處理24 h后,每一個孔中加入10 mL MTT溶解液,培育4 h后,然后將上清液吸出,向每一個孔內(nèi)添加100 mL Formazan溶化液,混合均勻后放回細胞培養(yǎng)箱中孵育4 h以內(nèi),直到在倒置顯微鏡下觀測不到紫色結(jié)晶為止。通過酶標(biāo)儀檢測570 nm下各孔的吸光度,并將其相應(yīng)的存活率公式表示出來。存活率的計算如公式(10)所示:

(10)

式中:A0、A1和A2,實驗組、空白組和對照組OD值。

1.2.5.5 細胞內(nèi)ROS含量測定

將PC12細胞以每孔1×105個/mL的密度注射于無菌的全黑96孔板中,待細胞生長融合至80%左右時,加入100 mL含有0、5、10、15、20、25 mmol/L PMSF的無血清培養(yǎng)液,經(jīng)過24 h的PMSF處理后,取出舊的培育液,依次加入100 mL含量為10 mmol/L熒光探測器,以觀察細菌的生長情況,并進行進一步的研究。在培養(yǎng)箱中孵育20 min,孵育完成后,利用PBS緩沖液進行1～2次沖洗,以除去未加入細菌的探針。最后,每個孔中加入100 mL PBS緩沖液,在陰暗的自然環(huán)境下,熒光強度用熒光酶標(biāo)儀測定,激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為495 nm和529 nm。經(jīng)PMSF處理后,PC12細胞內(nèi)ROS水平測定結(jié)果的計算如公式(11)所示:

(11)

式中:A0、A1和A2,實驗組、空白組和對照組OD值。

1.2.5.6 細胞內(nèi)抗氧化活性(antioxidant activity in the cell, CAA)測定

從PC12細胞中取出對數(shù)生長期的細胞,將其密度調(diào)節(jié)至6×104個/mL,然后將其均勻地分散于無菌的全黑96孔板中,在細菌培育完成后,應(yīng)當(dāng)除去孔內(nèi)舊栽培基,并采用無菌D-Hank’s水溶液進行1～2次沖洗,以確保未充分貼壁和死去的細菌得到有效清除。為了進行比較,實驗組中加入100 mL和DCFH-DA探針,對照組和空白組中分別加入100 mL稀釋的DCFH-DA探針,以便進行更深入的研究。將細菌放入37 ℃、5% CO2栽培箱中孵育1 h,然后用無菌D-Hank’s水溶液沖洗2～3次,將試驗組和對照組分別加入100 mL ABAP水溶液(600 mmol/L)和100 mL無菌D-Hank’s水溶液,接著迅速將其放入熒光酶標(biāo)儀,設(shè)置5 min的間隔,實時檢測1 h,以獲取真實熒光信息。激發(fā)波長為485 nm,而發(fā)射波長為538 nm。CAA值的計算如公式(12)所示:

(12)

式中:SA,添加PMSF后的熒光值與時間形成曲線的面積;CA,空白組的熒光值與時間形成曲線的面積。

1.2.6 抑制癌細胞增殖

1.2.6.1 MTT法檢測細胞活力

當(dāng)細胞融合度達到90%時,采用傳代操作方法獲得細胞懸液。離心吸棄培養(yǎng)基,加入4 mL完全培養(yǎng)基后,用臺盼藍進行細胞染色,染色后對細胞計數(shù),細胞均勻接種于96孔板中,密度為5×104個/mL,體積為90 mL。然后將96孔板在37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中孵育一夜。將96孔板置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中48 h。給藥培養(yǎng)48 h后,將MTT溶液依次加入96孔板,每孔體積為10 mL,將96孔板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。每孔依次DMSO 100 mL。檢測96孔板在570 nm和630 nm處的吸光度值。

1.2.6.2 細胞周期檢測

用培養(yǎng)基配制不同濃度的cattle(125～2 000 mg/mL),每孔加入300 mL,將6孔板置于5 pc CO2培養(yǎng)箱中,37 ℃培養(yǎng)48 h。給藥培養(yǎng)48 h后,先用200 mL不含EDTA的胰酶消化細胞,用離心機以2 000 r/min離心5 min收集細胞,吸棄上層液體,用預(yù)冷1×PBS進行洗滌,次數(shù)為2次,2 000 r/min離心5 min。棄上清液后,加入1 mL 75%乙醇,放入4 ℃冰箱過夜固定細胞。固定24 h后用離心機以2 000 r/min離心5 min收集細胞,吸棄上層液體,用預(yù)冷1×PBS進行洗滌,次數(shù)為2次,2 000 r/min離心5 min。再分別加入細胞周期檢測試劑,在室溫條件下避光孵育30 min,最后輕輕吹打均勻后再用流式細胞儀分析。

1.2.7 分子動力學(xué)

BCL-2、CDK-2蛋白晶體結(jié)構(gòu)從Alphafold[21]數(shù)據(jù)庫(https://alphafold.com/entry/A0A7L2ZRC1)中下載獲得。小分子新橙皮苷結(jié)構(gòu)從PubChem[22]數(shù)據(jù)庫下載獲得,并在MMFF94力場下進行能量最小化。分子動力學(xué)模擬采用AMBER 18軟件進行模擬。模擬時,非鍵的截斷距離設(shè)為10 ?,Particle mesh Ewald(PME)方法被用于計算長程的靜電作用,SHAKE方法用于限制氫原子鍵長,Langevin算法用于溫控,其中碰撞頻率γ設(shè)為2 ps-1。體系壓強為1 atm,積分步長為2 fs,每隔10 ps保存軌跡用于后續(xù)分析。

所有體系的蛋白和配體間的結(jié)合自由能通過MM/GBSA[23]方法計算。本研究中采用90～100 ns的MD軌跡用作計算,具體如公式(13)所示:

ΔGbind=ΔGcomplex-(ΔGreceptor+ΔGligand)
=ΔEinternal+ΔEVDW+ΔEelec+ΔGGB+ΔGSA

(13)

式中:ΔEinternal表示內(nèi)能、ΔEVDW表示范德華作用、ΔEelec表示靜電相互作用。其中內(nèi)能包括鍵能(Ebond)、角能(Eangle)、和扭轉(zhuǎn)能(Etorsion);ΔGGB和ΔGSA統(tǒng)稱溶劑化自由能。其中,GGB為極性溶劑化自由能、GSA為非極性溶劑化自由能。對于ΔGGB,本文采用NGUYEN等[24]研究者開發(fā)得GB模型進行計算(igb=8)。非極性溶劑化自由能(ΔGSA)則基于表面張力(γ)與溶劑可及性表面積(surface area, SA)的乘積計算得到,ΔGSA=0.007 2×SA。熵變由于高耗計算資源與低精度,在本研究中忽略不計。

1.3 組分分析

基于液-質(zhì)聯(lián)用(liquid chromatograph mass spectrometer, LC-MS)非靶向的方式進行檢測,重復(fù)3次,所得到的數(shù)據(jù)供生物信息學(xué)分析,最終得出代謝物。采用Thermo超高效液相系統(tǒng)(Vanquish,USA),根據(jù)化合物的性質(zhì),采用Hypersil GOLDTMC18選擇性HPLC色譜柱,進樣量10 mL,流速0.9 mL/min,柱溫40 ℃,流動相A為85%甲酸-水(體積分數(shù))溶液,流動相B為去離子水溶液。質(zhì)譜采用的是美國Thermo公司的Qexactive高分辨質(zhì)譜檢測系統(tǒng)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗中用Origin 2018來統(tǒng)計數(shù)據(jù)及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂的篩選

2.1.1 吸附率與解吸率

吸附/解吸能力是評價回收目標(biāo)化合物的吸附/解吸過程時最重要的指標(biāo)。如圖1所示,本實驗共測試了6種大孔樹脂,包括2種弱極性(AB-8和X-5),2種中極性(DM301和CAD-40)和2種非極性(D101和NKA)對PMSF的吸附/解吸能力。從圖1可以看出,弱極性(AB-8和X-5)樹脂對PMSF的吸附/解吸能力優(yōu)于其他樹脂,非極性(D101和NKA)樹脂對PMSF的吸附/解吸能力相對較低。大孔吸附樹脂的分離特性在很大程度上取決于其特定面積、表面極性和孔徑[25],AB-8為聚苯乙烯型弱極性吸附樹脂,表面有一定的酯基,親水性得到改善,該樹脂的比表面積和孔徑較大,對于PMSF具有較好的吸附/解吸能力。

圖1 六種大孔樹脂吸附率與解吸率Fig.1 Adsorption and desorption rates of 6 macroporous resins

2.1.2 吸附動力學(xué)

吸附是一種物理化學(xué)過程[26],主要涉及溶質(zhì)(吸附物)從液相到吸附劑表面的傳質(zhì)。樹脂吸附[15]可以分為3個不同的區(qū)域:1)外部區(qū)域幾乎完全飽和的吸收;2)中間區(qū)域在特定時間內(nèi)發(fā)生的吸收;3)最內(nèi)層區(qū)域尚未發(fā)生吸收。隨著吸附過程的持續(xù),飽和區(qū)越來越厚,從而促使顆粒內(nèi)部的擴散過程。不同時間下的吸附動力學(xué)曲線如圖2所示,AB-8大孔樹脂的吸附性能優(yōu)于其他5種。隨著時間的增加,吸附量也逐漸提高。0～60 min時,PMSF吸附量迅速增加,此后,即使時間增加,吸附也不再改變,這是因為大孔樹脂的表面結(jié)合位點大多已被總黃酮飽和。6種樹脂的顆粒內(nèi)擴散模型的線性回歸如圖3所示,AB-8樹脂的顆粒內(nèi)擴散模型(斜率)分別為0.003 95和0.075 71(表3)。很明顯,AB-8樹脂在吸附的初始階段,顆粒內(nèi)擴散并不是唯一的機制,因為回歸線不是通過原點的。AB-8樹脂的截距值為正,表明它具有快速動態(tài)的特性,因此,在初始階段,吸附速率受到薄膜擴散等因素的影響,但粒內(nèi)擴散仍然是主要機制[27]。

圖2 六種大孔樹脂吸附曲線Fig.2 Adsorption curves of 6 macroporous resins

a-一級動力學(xué)方程;b-二級動力學(xué)方程

表3 一級動力學(xué)與二級動力學(xué)方程Table 3 First-order dynamics and Second-order dynamics equations

通過對6種樹脂的吸附動力學(xué)方程擬合及Langmuir和Freundlich模型的分析,結(jié)果如圖4所示,6種樹脂對PMSF吸附能力最好的為AB-8樹脂。Langmuir和Freundlich模型結(jié)果表明,AB-8樹脂的吸附均適用于兩種模型,Langmuir模型的R2為0.982 09,高于Freundlich模型的0.914 49(表4),該模型表明樹脂表面是均質(zhì)的。綜合考慮,選用AB-8分離PMSF。

a-Langmuir等溫吸附公式;b-Freundlich等溫吸附公式

表4 Langmuir與Freundlich等溫吸附公式Table 4 Langmuir and Freundlich isothermal adsorption formulas

2.2 動態(tài)洗脫工藝

上樣速度、上樣量的差異、洗脫劑的濃度以及洗脫流速的差異都會影響目標(biāo)產(chǎn)物的最終分離效果。根據(jù)圖5-a可以看出,上樣流速對分離效果有顯著影響。當(dāng)上樣流速為8 BV/h時,曲線迅速達到最高點,表明大孔樹脂吸附已經(jīng)達到飽和狀態(tài),PMSF未能被充分吸附進樹脂內(nèi)部就被沖出柱外。根據(jù)圖5-b所示,當(dāng)柱體積保持不變時,隨著流出液的增加,PMSF的含量也會增加。當(dāng)收集管數(shù)為60時,PMSF的含量達到最大值,為0.52 mg/mL,此時AB-8型大孔樹脂的吸附已經(jīng)接近飽和狀態(tài)。由于改變乙醇溶液的濃度,可以有效地改變PMSF與大孔樹脂溶液之間的疏水作用,進而使吸收物洗脫下來。根據(jù)圖5-c所示,60%乙醇洗脫的PMSF含量最高達0.93 mg/mL,這可能是由于不同濃度的乙醇溶液對黃酮與大孔樹脂間的作用力影響有所不同,因而使得洗脫效果更加顯著。洗脫速度過快會導(dǎo)致分子無法從色譜柱中洗脫出來,太慢的洗脫速度則會導(dǎo)致多組分被一同洗脫出柱,分離效果受到影響,因此選擇合適的洗脫速度也尤為重要。圖5-d顯示,當(dāng)洗脫速度為5 mL/min時,PMSF含量最高達0.95 mg/mL。

a-上樣速度;b-上樣量;c-洗脫劑;d-洗脫流速

2.3 C18分離

通過前期對于PMSF的分離,結(jié)合液相分析(圖6-a),可以發(fā)現(xiàn),PMSF有11個不同組分,AB-8樹脂吸附后的液相圖(圖6-b)有3個不同組分,C18柱可有效分離新橙皮苷(圖6-c),結(jié)合質(zhì)譜鑒定(鑒定由蘇州帕諾米克生物公司完成)(圖6-d),新橙皮苷的質(zhì)核比為610.18,分子結(jié)構(gòu)為C28H34O15(圖6-e),新橙皮苷的含量由PMSF中的27.21%提升至82.31%。

a-PMSF;b-AB-8組分;c-C18組分;d-新橙皮苷質(zhì)譜;e-新橙皮苷結(jié)構(gòu)

2.4 抗氧化活性

類黃酮是天然植物化學(xué)物質(zhì),可能具有治療作用,有助于預(yù)防多種疾病。本實驗測試了新橙皮苷(200、400、600、800、1 000 mg/mL)清除自由基能力(DPPH自由基、超氧陰離子自由基和ABTS陽離子自由基),結(jié)果如圖7-a所示。

隨著濃度的提高,新橙皮苷的抗氧化能力也逐漸提升,1 mg/mL DPPH、超氧陰離子和ABTS陽離子清除能力分別為83.23%、81.05%和72.03%。進行PC12活性測試,如圖7-b所示,250 mg/mL添加量時,PC12細胞存活率高于85%,表明新橙皮苷對于PC12的活性影響不大,可進行細胞內(nèi)抗氧化測試。通過檢測添加了不同含量新橙皮苷的PC12細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量,發(fā)現(xiàn)ROS含量隨著新橙皮苷的添加而減少,當(dāng)新橙皮苷添加量為250 mg/mL時,ROS含量較未添加減少了30.21%,CAA活性提高了14.39%,這表明新橙皮苷可以通過提高CAA活性來降低細胞內(nèi)ROS含量。新橙皮苷的酚羥基結(jié)構(gòu)是影響其抗氧化活性的關(guān)鍵因素,羥基基團的存在可以改善整體結(jié)合[28],并且可以促進分子與雙層脂質(zhì)膜的極性頭部區(qū)域之間的相互作用;另一方面,酚羥基的存在可以抑制膜的疏水核心的轉(zhuǎn)變,新橙皮苷的多個酚羥基基團,在細胞膜上建立脂水界面,可以阻止自由基進一步滲透到脂質(zhì)疏水核心,從而來提高其細胞內(nèi)抗氧化的能力。

2.5 抑制癌細胞增殖

本研究測試了質(zhì)量濃度125～2 000 mg/mL下的新橙皮苷對于4種腫瘤細胞株(SH-SY5Y、K562、293T和MCF-7/ADR)的抑制能力,并用MTT法進行檢測。如圖8所示,2 000 mg/mL的新橙皮苷均可有效抑制4種腫瘤細胞株(SH-SY5Y、K562、293T和MCF-7/ADR),其中新橙皮苷對于K562的抑制能力最強,有效抑制率為92.49%,因此對K562進行MTT法檢測,結(jié)果表明500 mg/mL時的新橙皮苷可以有效抑制K562的G1分裂時期從而實現(xiàn)抑制K562癌細胞增殖。

a-抑制4種癌細胞增殖能力;b-MTT法檢測K562增殖

2.6 分子動力學(xué)

如圖9-a所示,基于分子對接獲取的小分子新橙皮苷與BCL-2蛋白的結(jié)合復(fù)合物,新橙皮苷結(jié)合在BCL-2蛋白的表面空腔內(nèi)(見圖9-a中1),從圖9-a中2～3相互細節(jié)圖中可以看出,結(jié)合位點由LEU-201、TYR-202、LEU-209、SER-216、ASN-143、PHE212氨基酸圍繞而成的活性口袋。其中,小分子和位點上的LEU-201、LEU-209、PHE212發(fā)生疏水作用,和TYR-202、LEU-209、SER-216發(fā)生氫鍵作用。這些相互作用是小分子和蛋白穩(wěn)定結(jié)合的主要原因。如圖9-b所示,基于分對接獲取的小分子新橙皮苷與CDK-2蛋白的結(jié)合復(fù)合物,新橙皮苷結(jié)合在CDK-2蛋白的表面空腔內(nèi)(見圖9-a中1),從圖9-a中2～3相互細節(jié)圖中可以看出,結(jié)合位點由PHE-87、PHE-85、ALA-34、ILE-88、VAL-13、VAL-21、GLY-16、LYS-93、THR-17、GLN-136、GLU-15、ASP-89、ASP-150、ASN-137氨基酸圍繞而成的活性口袋。其中,小分子和位點上的PHE-87、PHE-85、ALA-34、ILE-88、VAL-13、VAL-21發(fā)生疏水作用,和ASP-150、ASN-137發(fā)生氫鍵作用。這些相互作用是小分子和蛋白穩(wěn)定結(jié)合的主要原因。

分子動力學(xué)模擬的均方根偏差可以反應(yīng)復(fù)合物的運動過程,RMSD越大以及波動越劇烈表示運動劇烈,反之,運動平穩(wěn)。如圖10所示,BCL-2、CDK-2結(jié)合了新橙皮苷的蛋白(紅色)表現(xiàn)出比未結(jié)合新橙皮苷的BCL-2、CDK-2蛋白更低的RMSD。表明小分子與蛋白結(jié)合的非常密切,小分子與結(jié)合穩(wěn)定性非常好。

a-BCL-2;b-CDK-2

RMSF可以反應(yīng)分子動力學(xué)模擬的過程中蛋白的柔性。通常藥物結(jié)合蛋白后,蛋白柔性下降,進而達到穩(wěn)定蛋白的作用,而發(fā)揮酶活性。如圖11所示,新橙皮苷可以穩(wěn)定BCL-2、CDK-2蛋白的整體柔性,進而達到潛在的影響B(tài)CL-2、CDK-2蛋白生物功能的效果。

a-BCL-2;b-CDK-2

基于分子動力學(xué)模擬的軌跡,采用MM-GBSA的方法計算了結(jié)合能,該結(jié)合能可以更為準(zhǔn)確的反應(yīng)小分子和目標(biāo)蛋白的結(jié)合效果。如表5所示,BCL-2/新橙皮苷、CDK-2/新橙皮苷的結(jié)合能為(-20.40±2.51) kcal/mol、(-44.18±1.77) kcal/mol。數(shù)值為負數(shù)表明該分子與目標(biāo)蛋白具結(jié)合親和力,數(shù)值越低表示結(jié)合越強。顯然計算表明BCL-2/新橙皮苷、CDK-2/新橙皮苷的結(jié)合親和力較強。通過能量分解,可以看出這些復(fù)合物的結(jié)合主要貢獻能為靜電能和范德華能,再就是非極性溶劑化自由能。

表5 MM/GBSA預(yù)測的結(jié)合自由能和能量成分 單位:kcal/mol

氫鍵為最強的非共價結(jié)合作用之一,數(shù)目越多表示結(jié)合越好。本研究監(jiān)測了在模擬期間BCL-2/新橙皮苷、CDK-2/新橙皮苷復(fù)合物的氫鍵數(shù)目,以反應(yīng)氫鍵在兩者結(jié)合的貢獻。如圖12所示,在BCL-2/新橙皮苷復(fù)合物中,小分子和蛋白在模擬過程中形成的氫鍵數(shù)目在0～7個。在CDK-2/新橙皮苷復(fù)合物中,小分子和蛋白在模擬過程中形成的氫鍵數(shù)目在2～8個。大多數(shù)時間氫鍵數(shù)目在5～6,意味著新橙皮苷與CDK-2結(jié)合期間,氫鍵持續(xù)存在,并且時常發(fā)生多個氫鍵,對兩者的結(jié)合起到重要貢獻作用。相比較而言,新橙皮苷與CDK-2的氫鍵數(shù)目要大于與BCL-2蛋白的氫鍵數(shù)目,這和結(jié)合能效果一致。

a-BCL-2;b-CDK-2

3 結(jié)論

牡丹籽粕作為牡丹籽榨油后的廢棄物,存在很多活性物質(zhì)(黃酮、多酚和蛋白等),本實驗借助AB-8樹脂聯(lián)用C18柱的方法從牡丹籽粕中分離純化出新橙皮苷,測試了新橙皮苷的生物活性,表明其具有優(yōu)異的生物活性,1 mg/mL新橙皮苷對于DPPH自由基、超氧陰離子自由基和ABTS陽離子自由基清除能力分別為83.23%、81.05%和72.03%;細胞內(nèi)抗氧化活性測試表明250 mg/mL新橙皮苷可以有效提高14.39% CAA活性,從而減少細胞內(nèi)30.21% ROS含量。細胞內(nèi)過量的ROS會促進癌細胞增殖,因其優(yōu)異的抗氧化活性,因此測試了新橙皮苷對于抑制4種癌細胞(SH-SY5Y、K562、293T和MCF-7/ADR)增殖,實驗表明2 000 mg/mL新橙皮苷對于K562的抑制率為92.49%,MTT法檢測結(jié)果表明500 mg/mL新橙皮苷可以有效抑制K562的G1期;分子動力學(xué)模擬結(jié)果表明新橙皮苷可以通過結(jié)合BCL-2、CDK-2產(chǎn)生氫鍵抑制K562增殖。本實驗從牡丹籽粕中分離純化新橙皮苷,探究了新橙皮苷的生物活性,結(jié)果表明新橙皮苷具有良好的抗氧化活性與抑制K562癌細胞增殖能力,為科學(xué)認識牡丹籽粕廢棄物提供理論基礎(chǔ)。