熊果酸通過調(diào)控雌激素受體抑制甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞增殖、遷徙、侵襲的機(jī)制研究

段祥凱，陳紅躍

1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450000

2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院甲乳外科，河南 鄭州 450000

甲狀腺癌屬于常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，臨床中甲狀腺乳頭狀癌（PTC）最為常見[1]。國際流行病學(xué)報(bào)告顯示，女性患甲狀腺癌的概率是男性的3 至4 倍，女性性激素，尤其是雌激素在甲狀腺癌的發(fā)展過程中起到了重要作用[2]。雌激素通過其受體ERα、ERβ發(fā)揮作用，ERα 大多促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖，與之相反，ERβ 通常抑制惡性腫瘤細(xì)胞的生長[3]。熊果酸是中藥夏枯草的提取物之一，具有廣泛的藥理學(xué)作用，如抗炎、抗氧化、抗病毒等[4-5]。隨著近年對(duì)中醫(yī)藥更為深入的探索，熊果酸在抗腫瘤方面也表現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用前景，如甲狀腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、前列腺癌等[6]。目前，熊果酸在PTC 發(fā)展進(jìn)程中的作用機(jī)制尚不明確。本研究觀察熊果酸對(duì)甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞生物學(xué)的影響及具體作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑胎牛血清、RPMI 1640 培養(yǎng)基、胰蛋白酶溶液（Biological 公司），RIPA 組織裂解液、PMSF（索萊寶公司）。CCK-8 試劑盒（上海同仁公司），蛋白電泳凝膠制備盒（陜西中暉赫彩公司）。ERα、ERβ 抗體（武漢三鷹公司）。Transwell 小室（美國Corning 公司）。甲狀腺癌BCPAP 細(xì)胞：人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞（賽百慷公司）；Nthy-ori3-1 細(xì)胞：人甲狀腺正常細(xì)胞株（北京北納生物技術(shù)研究院）；熊果酸（索萊寶公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)甲狀腺癌BCPAP 細(xì)胞，采用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2及飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期時(shí)，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 熊果酸配置稱取25 mg 熊果酸粉劑，加入到1 mL DMSO內(nèi)進(jìn)行溶解。為提高熊果酸在DSMO中的溶解度，可進(jìn)行超聲波震蕩并加熱，配置好的熊果酸母液用直徑0.22 μm 的濾網(wǎng)在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行過濾。

1.4 Westernblot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Nthy-ori3-1 細(xì)胞和BCPAP 細(xì)胞中ERα 和ERβ 表達(dá)當(dāng)Nthy-ori3-1 細(xì)胞與BCPAP 細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，胰蛋白酶消化收集細(xì)胞。RIPA 裂解液和PMSF 提取細(xì)胞總蛋白。BCA 法配平2 組細(xì)胞蛋白總量。以每孔10 μL 的規(guī)格上樣后電泳，隨后將目的條帶轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上轉(zhuǎn)模，脫脂牛奶封閉后一抗孵育過夜，TBST 液洗膜5 次，每次5 min。二抗孵育1 h，TBST 液洗膜5 次，每次5 min。ECL 液發(fā)光顯影，以目的蛋白條帶與內(nèi)參灰度值比值為相對(duì)蛋白含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 CCK-8 檢測(cè)熊果酸對(duì)BCPAP 細(xì)胞增殖的影響當(dāng)BCPAP 細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，胰酶消化；將細(xì)胞濃度調(diào)整為10×103/mL，按照每孔100 μL，將細(xì)胞懸液打入96 孔板中。每組設(shè)置4 個(gè)復(fù)孔，將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基。將不同濃度的熊果酸培養(yǎng)基（0、4、8、16、32、64 μmol/L）分別加入各孔中，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h，加入CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h；用酶標(biāo)儀在450 nm 下檢測(cè)吸光值。并計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)熊果酸對(duì)BCPAP 細(xì)胞遷移能力的影響當(dāng)BCPAP 細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，胰酶消化；將細(xì)胞濃度調(diào)整為10×104/mL，在無菌6 孔板中每孔加入2 mL 細(xì)胞懸液。BCPAP 細(xì)胞在孔底生長面積接近100%時(shí)，用200 μL 無菌槍頭進(jìn)行劃痕，PBS 清洗2 次。6 孔板中分別加入濃度不同的熊果酸（濃度分別為0 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L）無血清培養(yǎng)基2 mL。置于ZOOM 培養(yǎng)箱中，拍攝間隔時(shí)間設(shè)置為每6 h拍攝一次。使用Image J軟件測(cè)量各組BCPAP細(xì)胞劃痕愈合面積。

1.7 Transwell 檢測(cè)熊果酸對(duì)BCPAP 細(xì)胞侵襲能力的影響RPMI 1640 培養(yǎng)基與Matrigel 膠按8∶1 的比例進(jìn)行稀釋，BCPAP 細(xì)胞無血清RPMI 1640 培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)，胰酶消化離心，用不含血清1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，在Transwell小室上室中每孔均勻鋪入100 μL，下層小室加入濃度為0 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L 的熊果酸溶液500 μL。37 ℃孵箱培養(yǎng)24 h 后甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色10 min，200 倍光鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)目計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 Westernblot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)熊果酸干預(yù)BCPAP 細(xì)胞后ERα 和ERβ 表達(dá)情況BCPAP 細(xì)胞常規(guī)消化接種于無菌6 孔板，待細(xì)胞融合至80%時(shí)，將6 孔板內(nèi)培養(yǎng)基更換為無血清熊果酸培養(yǎng)基（0 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L）。24 h 后胰酶消化收集細(xì)胞，RIPA 裂解液和 PMSF 提取細(xì)胞總蛋白。BCA 法配平各組細(xì)胞蛋白總量。以每孔10 μL 的規(guī)格上樣后電泳，隨后將目的條帶轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上轉(zhuǎn)模，脫脂牛奶封閉后一抗孵育過夜，TBST 液洗膜5 次，每次5 min。二抗孵育1 h，TBST 液洗膜5 次，每次5 min。ECL液發(fā)光顯影，以目的蛋白條帶與內(nèi)參灰度值比值為相對(duì)蛋白含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS21.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，滿足正態(tài)性、方差齊性采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Nthy-ori3-1細(xì)胞與BCPAP 細(xì)胞中ERα和ERβ的表達(dá)情況見圖1。Nthy-ori3-1 細(xì)胞與BCPAP 細(xì)胞比較，ERα 的表達(dá)水平較低（P＜0.05），ERβ 的表達(dá)水平較高（P＜0.05）。

圖1 Nthy-ori3-1細(xì)胞與BCPAP細(xì)胞中ERα和ERβ的表達(dá)情況

2.2 熊果酸對(duì)BCPAP 細(xì)胞增殖活性的影響見表1和圖2。不同濃度的熊果酸（4、8、16、32、64 μmol/L）對(duì)BCPAP 細(xì)胞增殖活性具有抑制作用，呈時(shí)間和濃度依賴性（P＜0.05）。IC50為11 μmol/L。后續(xù)試驗(yàn)采用24 h為藥物作用時(shí)間。

表1 熊果酸對(duì)BCPAP細(xì)胞增殖活性的影響（± s） %

表1 熊果酸對(duì)BCPAP細(xì)胞增殖活性的影響（± s） %

注：①與B0組比較，P＜0.05

48 h存活率100 ± 0.00 77.28 ± 1.22①60.12 ± 2.27①22.09 ± 3.37①13.89 ± 1.35①4.43 ± 1.25①組別B0 B4 B8 B16 B32 B64 n4 4 4 4 4 4 24 h存活率100 ± 0.00 80.48 ± 1.56①64.72 ± 0.97①26.99 ± 1.45①17.89 ± 0.38①5.45 ± 0.98①

圖2 熊果酸對(duì)BCPAP細(xì)胞增殖活性的影響

2.3 熊果酸對(duì)BCPAP 細(xì)胞遷移率的影響見表2。同時(shí)間點(diǎn)，B4 組、B8 組BCPAP 細(xì)胞遷移率低于B0組（P＜0.05）。熊果酸濃度越高，BCPAP 細(xì)胞遷移能力受到的抑制就越強(qiáng)。

表2 熊果酸對(duì)BCPAP細(xì)胞遷移率的影響（± s） %

表2 熊果酸對(duì)BCPAP細(xì)胞遷移率的影響（± s） %

注：①與同時(shí)間點(diǎn)B0組比較，P＜0.05

細(xì)胞遷移率25.55 ± 1.41 17.22 ± 1.71①9.56 ± 1.36①32.56 ± 1.88 20.49 ± 2.21①13.45 ± 0.88①組別B0（12 h）B4（12 h）B8（12 h）B0（24 h）B4（24 h）B8（24 h）n3 3 3 3 3 3

注：N是Nthy-ori3-1細(xì)胞；B是BCPAP細(xì)胞

2.4 熊果酸對(duì)BCPAP 細(xì)胞侵襲力的影響見圖3。與B0 組比較，B4 組、B8 組BCPAP 細(xì)胞侵襲數(shù)明顯降低（P＜0.05），細(xì)胞侵襲數(shù)量隨熊果酸濃度上升逐漸下降。而B0 組和陰性對(duì)照組細(xì)胞透膜量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 熊果酸對(duì)BCPAP細(xì)胞侵襲力的影響

2.5 熊果酸對(duì)BCPAP 細(xì)胞中ERα 和ERβ 表達(dá)情況的影響見圖4。熊果酸作用24 h 后，B4 組、B8 組ERα 表達(dá)水平低于B0 組（P＜0.05），ERβ 表達(dá)水平高于B0 組（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，熊果酸可以抑制ERα的表達(dá)，促進(jìn)ERβ的表達(dá)。

圖4 熊果酸對(duì)BCPAP細(xì)胞中ERα和ERβ表達(dá)情況的影響

3 討論

PTC是最常見的甲狀腺惡性腫瘤，約占甲狀腺癌發(fā)病率的80%[7]。PTC 在早期即可進(jìn)行淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，增加患者死亡風(fēng)險(xiǎn)。目前PTC 的治療方式以手術(shù)治療為主，但少數(shù)患者經(jīng)手術(shù)加碘放射治療后效果并不明顯[8]。對(duì)此，天然藥物治療及靶向治療或許是一個(gè)新的方向。

PTC的發(fā)展與雌激素及其受體密切相關(guān)，體外實(shí)驗(yàn)表明雌激素可以促進(jìn)PTC 的發(fā)生發(fā)展[9]。雌激素主要通過雌激素受體ERα 和ERβ 發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。ER基因位于人體染色體的6q24-27 區(qū)域，ERα 和ERβ的編碼基因存在一定差異，兩者表現(xiàn)出的生物學(xué)效應(yīng)也表現(xiàn)不同。ERα 和ERβ 兩者均在PTC 腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，但PTC 患者組織中ERα 的表達(dá)明顯高于正常甲狀腺組織，而ERβ 的表達(dá)低于正常甲狀腺組織。在分化較差的未分化甲狀腺癌中，這種表達(dá)差異更為明顯[10]。研究表明，高表達(dá)的ERα可以促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的增殖，ERβ 則促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞進(jìn)行分化和凋亡，使用ERα 激動(dòng)劑可以促進(jìn)抗凋亡Bcl-2的表達(dá)，使用ERβ 激動(dòng)劑可以促進(jìn)抗凋亡蛋白Bax 的表達(dá)，ERα 和ERβ 在甲狀腺癌的發(fā)展進(jìn)程中起到拮抗作用[11]。除甲狀腺癌外，ER 在多種雌激素相關(guān)惡性腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中起到關(guān)鍵作用，如乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌等[12]。研究表明，ERα和ERβ的表達(dá)比例對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展起到重要作用，當(dāng)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長的ERα表達(dá)明顯高于抑制腫瘤細(xì)胞生長的ERβ時(shí)，就會(huì)誘導(dǎo)雌激素反應(yīng)器官腫瘤的產(chǎn)生[13]。

甲狀腺癌屬于中醫(yī)學(xué)石癭范疇，《三因極一病證方論》中明確提出了石癭的概念。甲狀腺癌的病機(jī)為肝郁脾虛、氣滯痰濁，用藥多以祛痰散結(jié)、活血化瘀為主[14]。夏枯草具有化痰散結(jié)、清熱解毒的作用，廣泛應(yīng)用于甲狀腺疾病[15]。熊果酸是一種五環(huán)三萜酸，為抗腫瘤中藥夏枯草提取物之一[16]。近年因其抗腫瘤功效成為研究的熱點(diǎn)之一。熊果酸可以從多方面發(fā)揮抗癌作用，如誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、減少腫瘤血管生成、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移等。Wang X 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸可以激活凋亡途徑，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，抑制胃癌細(xì)胞增殖。Wang M 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸可以通過自噬途徑抑制肺癌細(xì)胞的生長，促進(jìn)其凋亡。李龍龍等[19]研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸可以通過AMPK/STAT3/COX-2信號(hào)通路抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7的生長和增殖。侯東升等[20]研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸可以下調(diào)PTC TPC-1細(xì)胞中存活素及血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)從而達(dá)到抑制甲狀腺癌TPC-1 細(xì)胞的發(fā)展進(jìn)程。本研究提示，相對(duì)于熊果酸低濃度組（0 μmol/L），熊果酸中、高濃度組（4 μmol/L、8 μmol/L）可以抑制甲狀腺癌BCPAP 細(xì)胞的增殖能力。且熊果酸濃度越高，甲狀腺癌BCPAP 細(xì)胞的增殖能力受到的抑制越明顯。同樣，與B0組比較，熊果酸中、高濃度組（4 μmol/L、8 μmol/L）甲狀腺癌BCPAP 細(xì)胞遷徙能力明顯下降。侵襲實(shí)驗(yàn)也表明，熊果酸可以抑制甲狀腺癌細(xì)胞BCPAP 的侵襲能力，且濃度越高，侵襲能力下降的越明顯。

綜上所述，熊果酸能抑制甲狀腺癌BCPAP 細(xì)胞的增殖、遷徙與侵襲，可能與降低甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞中ERα的表達(dá)水平、提升了ERβ的表達(dá)水平有關(guān)。