基于干酪乳桿菌ZLC01的山羊奶發(fā)酵乳及其特征性代謝物研究

王道滇,肖夢林,魏光強,黃艾祥,和萬忠,施婭楠*

1(云南農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術學院,云南 昆明,650201)2(云南皇氏來思爾乳業(yè)有限公司,云南 大理,671000)3(迪慶藏族自治州生產(chǎn)力促進中心,云南 迪慶藏族自治州,674499)

山羊乳是一種獨特的乳資源,是我國豐富乳品消費結(jié)構(gòu)、助力產(chǎn)業(yè)扶貧的重要產(chǎn)業(yè)[1]。山羊乳富含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素和礦物質(zhì),有“奶中之王”的美稱[2-3]。與牛奶相比,山羊乳富含容易消化分解的A2型β-酪蛋白[4],脂肪球粒徑小[5];此外,羊乳功能性不飽和脂肪酸的含量與人乳相近[6],致敏性低、易消化吸收,是潛在的人乳替代品[7]。然而,較小的脂肪球,較多的短、中鏈脂肪酸,尤其是C6～C10的游離脂肪酸[8]和較低含量的酪蛋白造成羊奶膻味重、發(fā)酵乳組織狀態(tài)差。因此,山羊奶發(fā)酵乳風味和品質(zhì)的改善有待解決。

具備較好蛋白和脂肪水解能力的乳酸菌能夠代謝產(chǎn)生氨基酸、脂肪酸等代謝物,加速凝乳,改善乳制品的風味和質(zhì)地[9-10]。益生菌復配發(fā)酵能對羊奶的營養(yǎng)價值、風味和組織狀態(tài)產(chǎn)生積極貢獻[11];嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌是乳制品中常用的傳統(tǒng)發(fā)酵劑,能在一定程度上掩蓋羊奶的膻味[12-13],但其對羊奶凝乳能力較差。羅伊氏乳桿菌凝乳能力好,可用于發(fā)酵乳餅的研制[14];干酪乳桿菌產(chǎn)酸和蛋白水解能力強,可產(chǎn)生胞外多糖增強發(fā)酵乳的黏附性,提高酸奶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[15];干酪乳桿菌與短乳乳桿菌CGMCC1.5954復配發(fā)酵可提高益生菌活菌數(shù)、增強乳凝膠硬度,減少乳清析出[16];PENG等[17]添加干酪乳桿菌和雙歧桿菌V9發(fā)酵牛奶,提高了發(fā)酵乳的活菌數(shù)和短鏈脂肪酸含量,賦予發(fā)酵乳更佳的口感和風味。

羊奶發(fā)酵乳具有輔助調(diào)節(jié)血脂、降低膽固醇、改善炎癥等生物學價值[18]。目前,云南市售的山羊奶發(fā)酵乳膻味較重,組織狀態(tài)較差,所含物質(zhì)不明確,品質(zhì)有待提升,山羊奶品質(zhì)改善及新產(chǎn)品的開發(fā)具有良好的發(fā)展前景;研究旨在篩選具有較好蛋白和脂肪降解能力的發(fā)酵劑制備新型山羊奶發(fā)酵乳(new fermented goat milk,LBSTL-GMFM),解決傳統(tǒng)發(fā)酵劑加工山羊奶發(fā)酵乳(fermented goat milk,LBST-GMFM)品質(zhì)較差的問題,基于代謝組學技術探究山羊奶發(fā)酵乳的關鍵代謝物及相關代謝通路,為山羊奶發(fā)酵乳的研究與開發(fā)提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山羊奶(蛋白質(zhì)2.99 g/100 g,脂肪3.34 g/100 g,乳固形物11.73 g/100 g),云南石林小尖山乳制品廠。

嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)21728菌株和保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricussubsp.)6098菌株,中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)ZLC01、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)和羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)由生產(chǎn)乳餅、乳扇的酸乳清中分離鑒定。

酚酞(分析純),天津市北辰方正試劑廠;氨水(色譜純),費希爾化學公司;乙酸銨、乙腈和甲醇均為色譜純,德國默克股份有限公司。

1.2 儀器與設備

HPX-9272ME培養(yǎng)箱,上海博訊實業(yè)有限公司;GJJ-0.06/70高壓均質(zhì)機,上海諾尼輕工機械有限公司;Vanquish超高效液相、Q Exactive HFX高分辨質(zhì)譜、Heraeus Fresco17離心機,賽默飛世爾科技公司;Waters ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)液相色譜柱,Waters有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 山羊奶發(fā)酵乳加工工藝設計

山羊奶發(fā)酵乳加工工藝如圖1所示。

圖1 山羊奶發(fā)酵乳加工工藝流程圖Fig.1 Process flow chart of fermented goat milk

1.3.2 發(fā)酵劑的篩選

乳酸菌的蛋白水解度和脂肪降解能力越強,發(fā)酵乳風味和凝乳效果越好。將保加利亞乳桿菌亞種、嗜熱鏈球菌、干酪乳桿菌ZLC01、羅伊氏乳桿菌、副干酪乳桿菌這5株菌活化至活菌數(shù)108CFU/g,按表1組合復配(體積比)發(fā)酵山羊奶,篩選具有較好蛋白質(zhì)和脂肪降解能力的乳酸菌作為實驗菌種;蛋白水解度參照羅艷華等[19]的方法測定;游離脂肪酸含量參照蘇偉麗[20]的方法測定。

表1 發(fā)酵劑菌種組合列表Table 1 List of strains combination for directed vat set

1.3.3 發(fā)酵乳感官評價

由10位感官評估人員對產(chǎn)品色澤、氣味、滋味、組織狀態(tài)進行感官評定,評分標準見表2。

表2 感官評定標準Table 2 Sensory assessment criteria

1.3.4 理化指標和乳酸菌數(shù)測定

酸度參照GB 5009.239—2016《食品安全國家標準 食品酸度的測定》測定;黏度用黏度計(3號轉(zhuǎn)子,轉(zhuǎn)速30 r/min,時間30 s)測定;持水力參照GUO等[21]的方法測定;乳酸菌數(shù)參考GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》法測定。

1.3.5 發(fā)酵乳代謝物檢測

樣品前處理:取100 μL樣品于400 μL提取液[V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1,含同位素標記內(nèi)標混合物]中,渦旋混勻30 s,超聲10 min(冰水浴),-40 ℃靜置1 h,離心后取上清液于進樣瓶中上機檢測。

UPLC條件:使用Waters ACQUITY UPLC BEH Amide (2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)液相色譜柱,A相為水相,含25 mmol/L乙酸銨和25 mmol/L氨水,B相為乙腈。樣品盤溫度4 ℃,進樣體積3 μL。

質(zhì)譜條件:選擇QE HFX質(zhì)譜儀,采用電噴霧電離源(electron spray ionization,ESI)采集數(shù)據(jù)。正離子模式下噴霧電壓為3 600 kV;負離子模式下噴霧電壓為-3 200 kV。鞘氣體流量30 Arb;輔助氣體流量25 Arb;毛細管溫度350 ℃;全MS分辨率為60 000,MS/MS分辨率為7 500;NCE模式碰撞能量為10/30/60 eV。原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard軟件轉(zhuǎn)成mzXML格式后,使用自主編寫的R程序包(內(nèi)核為XCMS)進行峰識別、峰提取、峰對齊和積分等處理,然后與BiotreeDB(V2.1)自建二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫匹配進行物質(zhì)注釋,算法打分的Cutoff值設為0.3。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有試驗均重復3次,結(jié)果以平均值±標準偏差表示。采用Microsoft Excel 2007、SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)處理,Origin 2018進行圖表繪制;使用R軟件對代謝物進行主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)?；贠PLS-DA,根據(jù)變量投影重要度(variable importance in project,VIP)>1.5,t檢驗的P<0.05和|log2FC|>1(FC為差異倍數(shù),fold change)進行差異代謝物篩選,將差異代謝物通過代謝通路數(shù)據(jù)庫KEGG Pathways(KEGG,www.genome.jp/kegg)進行注釋解析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵劑的篩選

具有較好蛋白和脂肪水解能力的乳酸菌可加速凝乳,改善發(fā)酵乳的風味和質(zhì)地[9]。如圖2所示,相比于其他發(fā)酵劑,發(fā)酵劑B的蛋白水解度和游離脂肪酸含量分別為(9.29±0.24)%、(9.67±0.18) μmol/mL。較小的脂肪球、高含量的中鏈脂肪酸是山羊奶組織狀態(tài)差、膻味重的原因[8],高含量的游離氨基酸和脂肪酸有助于提高發(fā)酵乳的風味和口感[10];發(fā)酵劑B的蛋白水解度和游離脂肪酸含量較高,說明發(fā)酵劑B有較好的凝乳和產(chǎn)香能力。據(jù)報道,干酪乳桿菌具有較好的脂肪和蛋白水解能力[22],可與其他菌種復配發(fā)酵,賦予產(chǎn)品更佳的風味品質(zhì)[23]。綜上,選擇發(fā)酵劑B[V(保加利亞乳桿菌)∶V(嗜熱鏈球菌)∶V(干酪乳桿菌ZLC01)=1∶1∶3]作為后期實驗發(fā)酵劑。

圖2 發(fā)酵劑篩選Fig.2 Fermentation starter screening

2.2 山羊奶發(fā)酵乳品質(zhì)研究

2.2.1 感官評價結(jié)果

分別用傳統(tǒng)發(fā)酵劑和發(fā)酵劑B生產(chǎn)LBST-GMFM和LBSTL-GMFM。如圖3所示,LBSTL-GMFM感官評分高于LBST-GMFM,為88分。2種發(fā)酵乳在氣味、滋味和組織狀態(tài)上差異較大;LBST-GMFM質(zhì)地粗糙、膻味重、酸香味淡、口感偏酸、有乳清析出,LBSTL-GMFM酸香味濃郁、酸甜適口、有輕微羊膻味、黏稠細膩、無乳清析出。LBSTL-GMFM膻味低、風味和組織狀態(tài)較好;這可能是干酪乳桿菌ZLC01能產(chǎn)胞外多糖,降解蛋白質(zhì)和脂肪,產(chǎn)生大量的有機酸、游離氨基酸、游離脂肪酸[22];從而改善發(fā)酵乳的風味和組織狀態(tài)。王記成等[23]通過干酪乳桿菌與嗜熱鏈球菌復配發(fā)酵賦予了發(fā)酵乳細膩的口感、濃郁的乙醛風味。感官評價結(jié)果表明,將干酪乳桿菌ZLC01與傳統(tǒng)發(fā)酵劑共發(fā)酵,有助于發(fā)酵乳風味品質(zhì)的提高。

圖3 山羊奶發(fā)酵乳感官評分圖Fig.3 Sensory scores of fermented goat milk

2.2.2 理化指標及乳酸菌活菌數(shù)分析

不同的發(fā)酵條件可改變發(fā)酵體系的酸度、凝乳pH值、黏度、持水力,影響發(fā)酵乳的組織狀態(tài)和滋味品質(zhì)。如表3所示,干酪乳桿菌ZLC01顯著提高了LBSTL-GMFM的酸度、黏度、持水力和乳酸菌活菌數(shù)(P<0.05),且LBSTL-GMFM的pH值顯著低于LBST-GMFM(P<0.05)。酸度是發(fā)酵乳中總酸性基團物質(zhì)的表征,如肽和游離氨基酸[10]。

表3 山羊奶發(fā)酵乳的基本理化指標及乳酸菌活菌數(shù)Table 3 Basic physicochemical indicators and live lactic acid bacteria count of fermented goat milk

LBSTL-GMFM的pH值較低、酸度高,而感官評分較好。這可能是低溫長時發(fā)酵條件下,發(fā)酵劑將脂肪和蛋白充分降解為氨基酸、肽和脂肪酸等物質(zhì),從而有效提高了LBSTL-GMFM的酸度和乳酸菌活菌數(shù)[16]。這不僅賦予發(fā)酵乳更為濃郁的酸香味,還避免了高溫短時發(fā)酵帶來的乳酸含量高、口感粗糙、乳清析出和風味不足等問題。此外,黏度和持水力反映發(fā)酵乳蛋白凝膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,黏度和持水力下降會導致發(fā)酵乳乳清析出、質(zhì)地粗糙[24]。LBSTL-GMFM較高的黏度和持水力,形成較穩(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu),增強了LBSTL-GMFM的質(zhì)地和口感。FAN等[16]通過干酪乳桿菌和傳統(tǒng)發(fā)酵劑共發(fā)酵,有效提高了發(fā)酵乳中脂肪酸、氨基酸和胞外多糖的含量,賦予發(fā)酵乳更佳的質(zhì)地和口感,與本研究結(jié)果相似。綜上,復配干酪乳桿菌ZLC01發(fā)酵,可充分地將羊乳的蛋白質(zhì)和脂肪水解為氨基酸和游離脂肪酸等物質(zhì)、促進菌體胞外多糖產(chǎn)生,增加發(fā)酵乳酸香味的同時改善發(fā)酵乳的組織狀態(tài)。這可能是LBSTL-GMFM膻味低、酸香味濃郁、組織狀態(tài)較好的原因。下一步可通過代謝組學探究代謝物對發(fā)酵乳品質(zhì)的影響。

2.3 山羊奶發(fā)酵乳代謝物研究

2.3.1 PCA和OPLS-DA

基于LC-QE-MS結(jié)合多元統(tǒng)計分析,探究發(fā)酵乳的小分子代謝物(多元統(tǒng)計分析結(jié)果見電子版增強出版附圖1, https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036207,下同)。PCA顯示2組發(fā)酵乳在代謝物水平上存在差異,OPLS-DA結(jié)果顯示,2種發(fā)酵乳被分離為兩個單獨的集群;正、負離子模式下模型的R2Y分別為0.998和1,Q2分別為0.791和0.943;R2Y、Q2值接近于1,表明此模型能很好的解釋2種山羊奶發(fā)酵乳代謝物的差異。對模型進行200次置換檢驗,正、負離子模式下,置換檢驗模型的R2Y和Q2值均小于原模型,說明模型可靠性高,可根據(jù)VIP值篩選差異代謝物。

2.3.2 差異性代謝物的篩選

基于OPLS-DA結(jié)果,以VIP>1.5,P<0.05以及|log2FC|>1為條件篩選差異代謝物(差異代謝物含量見電子版增強出版附表1, https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036207)。如圖4-b所示,正、負離子模式下,共鑒定到58種差異代謝物,主要包括16種氨基酸、肽及其衍生物,9種脂肪酸及其衍生物,8種核苷酸及其衍生物,7種芳香類化合物,4種生物堿和14種其他類化合物。對差異代謝物進行聚類和可視化分析(圖4-a、圖4-c),LBSTL-GMFM中44種代謝物下調(diào),14種代謝產(chǎn)物上調(diào);上調(diào)的代謝物為4-異丙基苯甲酸、維生素C、橙皮苷、甲基富馬酸、酪氨酰脯氨酸、谷氨酰胺丙氨酸、N-甲酰-L-蛋氨酸、4-羥基苯乙烯、(E)-3-(4-羥基苯基)-2-丙烯醛、絲衣霉酸、喹啉、尿囊素、L-色氨醇、苯乳酸,主要以氨基酸、肽及其衍生物和脂肪酸類化合物為主。其中,4-異丙基苯甲酸、維生素C、橙皮苷、甲基富馬酸、酪氨酰脯氨酸這5種物質(zhì)相對含量分別為LBST-GMFM的12 541、8 601、8 499、1 448、314倍,可作為LBSTL-GMFM的特征代謝物。

a-差異代謝物聚類熱圖;b-差異代謝物分類圖;c-LBST-GMFM中上調(diào)差異代謝物的Log2 FC絕對值

氨基酸、肽及其衍生物能改善羊奶發(fā)酵乳的風味品質(zhì),賦予發(fā)酵乳酸甜的口感;含甘氨酸、丙氨酸和天冬氨酸殘基的肽呈酸味、含谷氨酸的肽呈鮮味[10]。N-甲酰-L-蛋氨酸可通過美拉德反應生成醛類和硫類等風味物質(zhì)[25]、酪氨酰脯氨酸有抗血壓、抗腫瘤[26]等功能活性;大多數(shù)的L型氨基酸呈苦味、L-酪氨酸與甜味相關、L-苯丙氨酸和L-亮氨酸與苦味有關[27]。本研究中,LBSTL-GMFM中L-酪氨酸、L-亮氨酸、L-天冬酰胺、L-苯丙氨酸、2-呋喃酰甘氨酸等相對含量低于對照組,谷氨酰胺丙氨酸、酪氨酰脯氨酸、N-甲酰-L-蛋氨酸、L-色氨醇等相對含量較高;這可能是LBSTL-GMFM風味和酸甜味更佳的原因。此外,發(fā)酵乳中的氨基酸能和還原糖發(fā)生美拉德反應生成香氣閾值較低的揮發(fā)性醛類物質(zhì)[28];干酪乳桿菌可以利用氨基酸作為氮源,促進嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的生長[29],增加胞外多糖含量,從而改善發(fā)酵乳的組織狀態(tài);這可以解釋LBSTL-GMFM氨基酸類代謝物下調(diào),而風味和組織狀態(tài)更佳的原因。

脂質(zhì)代謝物與發(fā)酵乳的風味品質(zhì)密切相關,發(fā)酵乳中的脂肪酸源于微生物對原料乳中脂肪、蛋白質(zhì)和乳糖的分解代謝[30]。LBSTL-GMFM中甲基富馬酸、苯乳酸、4-異丙基苯甲酸等相對含量高于對照組(P<0.05);這類物質(zhì)不僅賦予LBSTL-GMFM濃郁的酸香味和滋味、增強凝乳性能,還有較好的功能活性[28]。其中,苯乳酸有廣譜抑菌作用[31],甲基富馬酸有抑菌、抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[32],4-異丙基苯甲酸與酸菜獨特的酸香味有關[33]。

綜上,LBSTL-GMFM的風味品質(zhì)和營養(yǎng)價值優(yōu)于對照組。N-甲酰-L-蛋氨酸、谷氨酰胺丙氨酸、4-異丙基苯甲酸等物質(zhì)賦予LBSTL-GMFM濃郁的酸香味和清爽的口感;干酪乳桿菌ZLC01具有較強的脂肪和蛋白質(zhì)利用度,可通過氨基酸代謝改善發(fā)酵乳的風味品質(zhì)和組織狀態(tài);下一步,有必要對差異代謝物進行代謝通路富集分析。

2.3.3 差異代謝物通路分析

通過KEGG數(shù)據(jù)庫比對和通路相關性分析(代謝圖通路富集圖見電子版增強出版附圖2-a和附圖2-b),58種差異代謝物主要富集到6條顯著的代謝途徑,分別為苯丙氨酸代謝,維生素B6代謝,酪氨酸代謝,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成,氨酰-tRNA生物合成,纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成途徑。WANG等[34]研究表明,氨基酸是微生物的氮源,氨基酸物質(zhì)的進一步代謝,會影響食品風味物質(zhì)的形成,如酯和醇。本研究中的苯丙氨酸代謝、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、酪氨酸代謝等代謝通路與氨基酸的代謝途徑相關,且氨基酸、肽及其衍生物為主要的差異代謝物;這表明,干酪乳桿菌ZLC01主要通過氨基酸的代謝路徑來改善山羊奶發(fā)酵乳的風味品質(zhì)。

繪制了關鍵差異代謝物與代謝途徑間的關系圖(差異代謝物與代謝途徑關系見電子版增強出版附圖2-c)。在發(fā)酵劑作用下,羊乳中的蛋白質(zhì)、糖類和脂類物質(zhì)通過蛋白、脂肪的水解和氨基酸代謝途徑參與三羧酸循環(huán)[35]。甲基富馬酸由三羧酸循環(huán)中的順烏頭酸的衍生物衣康酸轉(zhuǎn)化而來[32]。酪氨酰脯氨酸由蛋白質(zhì)水解生成;4-異丙基苯甲酸由乳酸菌混菌發(fā)酵代謝糖類和脂質(zhì)等物質(zhì)分解產(chǎn)生[33],賦予新型發(fā)酵乳濃郁的酸香味。此外,L-苯丙氨酸可經(jīng)芳香族氨基轉(zhuǎn)氨酶生成苯丙酮酸,在乳酸脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化為苯乳酸[31],賦予發(fā)酵乳潛在貯藏功能;橙皮苷是甜味劑二氫查耳酮的前體物質(zhì),由L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化而來[36]。吡哆醛呈苦味,干酪乳桿菌可代謝吡哆醛分泌胞外多糖[37],增強凝乳效果;同時,吡哆醛還可以通過維生素B6代謝和酪氨酸代謝途徑產(chǎn)生多巴胺,從而減輕L-酪氨酸帶來的苦味[38]。維生素C具有較強的抗氧化活性和柔和的酸甜味[33],主要由干酪乳桿菌通過山梨糖途徑代謝葡萄糖和2-酮基-L-古洛糖酸生成[38]。LBSTL-GMFM中吡哆醛含量低,橙皮苷和維生素C的相對含量顯著高于對照組(P<0.05),這說明干酪乳桿菌ZLC01主要通過苯丙氨酸代謝、維生素B6代謝和酪氨酸代謝,改善LBSTL-GMFM的滋味和質(zhì)地。

3 結(jié)論

干酪乳桿菌ZLC01有效改善了山羊奶發(fā)酵乳膻味重、組織狀態(tài)差、乳清析出嚴重等問題。LBSTL-GMFM的酸度[(107.26±4.75) °T]、黏度[(1 952.93±21.95) mPa·s]、持水力[(97.17±2.36)%]和乳酸菌活菌數(shù)(2.06×109CFU/g)均高于對照組(P<0.05)。4-異丙基苯甲酸、維生素C、橙皮苷、甲基富馬酸、酪氨酰脯氨酸是LBSTL-GMFM的特征代謝物,其主要通過苯丙氨酸代謝,酪氨酸代謝,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成等途徑生成。4-異丙基苯甲酸和酪氨酰脯氨酸與LBSTL-GMFM濃郁的酸香味有關,維生素C呈酸味、橙皮苷呈甜味、甲基富馬酸有抑菌作用,這些特征性代謝產(chǎn)物賦予LBSTL-GMFM較好的滋味和防腐保鮮作用,共同改善發(fā)酵乳的風味品質(zhì)。本研究可為山羊奶風味改善和山羊奶發(fā)酵乳的研發(fā)提供科學依據(jù)。