響應(yīng)面法優(yōu)化松針板栗黑米酒的發(fā)酵工藝

尤潔,宋飛飛,吳偉斌

(福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)系,福建 福州,350007)

松針是松科松屬植物的葉子,因其形如針而得名。松屬植物是世界上分布廣泛、資源豐富、四季常綠的樹種之一,是可持續(xù)利用的再生資源[1]。松針是松屬植物主要的副產(chǎn)物之一,也是其主要藥用部位[2];板栗是一種富含糖、氨基酸、蛋白質(zhì)、脂肪的營(yíng)養(yǎng)及經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的植物果實(shí),是人體必需脂肪酸、礦物質(zhì)、維生素和膳食纖維的良好來源[3-4]。黑米酒,是一種以黑米為原料制作的酒[5],是純天然飲料,不加香精、糖和色素卻香甜醇厚,色澤鮮亮,綠色、原生態(tài)等特點(diǎn)使其在眾多發(fā)酵酒中脫穎而出,獨(dú)樹一幟[6-7]。

松針提取物含有豐富的水溶性黃酮、多種礦物質(zhì)和維生素[8],具有抗炎、抗癌、降壓、抗氧化、清除自由基等作用[9-11],但現(xiàn)階段松針的應(yīng)用仍處于原始狀態(tài),其藥用價(jià)值和保健價(jià)值尚未得到開發(fā)[12]。板栗是一種藥食同源的農(nóng)產(chǎn)品[13],糖分是其基本營(yíng)養(yǎng)成分,因口感獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富而備受好評(píng)。但是,新鮮板栗貯藏條件苛刻,產(chǎn)量受季節(jié)限制,市場(chǎng)上鮮板栗深加工較少[14]。

將松針和板栗作為輔助性原料引入黑米酒的發(fā)酵工藝中,不但能提高它們的利用率和深加工開發(fā)力度,還可以改善傳統(tǒng)黑米酒的功能性,大幅提升其多糖含量和風(fēng)味[15-16]。因此對(duì)松針板栗黑米酒的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化具有十分重要的意義。本文采用響應(yīng)面法對(duì)松針板栗黑米酒的發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化,旨在為松針板栗黑米酒及其他新型風(fēng)味發(fā)酵酒的價(jià)值提升及應(yīng)用開發(fā)提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬尾松松針,采自福州鼓山;板栗、黑米均為市售;NaCl、無水乙醇、葡萄糖等試劑均為分析純,西安天茂化工有限公司;甜酒曲、米酒曲和小曲,紹興古越龍山釀酒有限公司;果酒酵母、葡萄酒酵母、米酒酵母(食品級(jí)),湖北安琪酵母股份有限公司;果膠酶(7 500 PGNU/g)、明膠、硅藻土、殼聚糖,成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

GZX-9140MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、HPX-9272MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司;800y多功能粉碎機(jī),武義海納電器有限公司;FA2004電子天平,上海舜宇恒平科技儀器有限公司;SHB-B95A真空泵,鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;WD-9415C超聲清洗器,北京六一生物科技有限公司;YM50Z智控型立式壓力蒸汽滅菌器,上海三申醫(yī)療器械有限公司;不銹鋼正壓桶式過濾器,上海信步過濾設(shè)備制造有限公司;HL-10D蒸飯柜,浙江寧波趙記電器有限公司;HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋,上海力辰邦西儀器科技有限公司;PHSJ-3F pH指示計(jì),上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;酒精計(jì),河北省武強(qiáng)縣同輝儀表廠;砂罐(5 L)裝、陶瓷瓶(0.5 L)裝,福建德化縣樸達(dá)陶瓷有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

松針板栗黑米酒釀造工藝流程如下,可分為前處理、主過程、后處理3個(gè)階段(圖1)。

圖1 松針板栗黑米酒釀造工藝流程Fig.1 Brewing process of pine needle chestnut black rice wine

原料前處理→蒸煮→淋飯冷卻→拌曲糖化→搭窩培菌→沖缸→主發(fā)酵→過濾→滅菌→裝瓶→陳釀→成品

1.3.2 操作要點(diǎn)

1.3.2.1 前處理

選用新鮮嫩綠的松針;由于在試驗(yàn)中使用的板栗和黑米均為市售,為保證試驗(yàn)的可復(fù)制性和推廣性以及結(jié)果的精準(zhǔn)性和可靠性,對(duì)選取的板栗和黑米進(jìn)行了一定的質(zhì)量分析及相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。選取的板栗表面光滑且無裂痕,形狀端正,大小均勻,淀粉含量68%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)、含水率55%、油脂含量1.5%、蛋白質(zhì)含量5%、糖含量7%、灰分含量1%;黑米顆粒飽滿,無雜質(zhì),顏色均勻,淀粉含量77%、含水率12%、膨化度1.3、脂肪酸含量2.5%、蛋白質(zhì)含量9%。

稱取20 g新鮮松針,清洗干凈,切成5 cm長(zhǎng),用50 g/L NaCl溶液浸泡12 h,水位沒過松針2 cm。將松針段在50 ℃恒溫干燥3 h至恒重后,將其粉碎到80目。用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇充分浸泡45 min。然后用內(nèi)沸法加入80 ℃熱水中恒溫加熱30 min,料液比1∶20(g∶mL)。將松針粉過濾得到松針提取物;栗子去皮洗凈,栗仁切碎,無大顆粒即得栗粉。將黑米洗凈,室溫20 ℃,浸泡12 h后,取出瀝干;將由甜酒曲、米酒曲和小曲組成的復(fù)合曲(質(zhì)量比5∶3∶2)在23 ℃的適量水中浸泡3 h活化。

采用松針提取物進(jìn)行發(fā)酵,而不是直接將松針放入發(fā)酵,這樣可以防止發(fā)酵過程中因松針導(dǎo)致酒體變成青灰色,而內(nèi)沸法可以有效提高松針中黃酮多酚類和多糖物質(zhì)的溶出度,不僅不會(huì)減少松針中的活性成分,還能減輕酒中的苦澀感[17]。

1.3.2.2 蒸煮淋飯

稱取預(yù)處理過的黑米650 g和板栗末350 g拌勻,組成初始原料,把原料放在蒸飯箱內(nèi),在100 ℃下蒸45 min。將蒸熟的板栗和黑米取出,放在消毒過的紗布上,用冷開水沖至30 ℃左右。此操作步驟不僅可以降低板栗和黑米的溫度,增加水分,還可以使黑米表面光滑,使顆粒分離,透氣,有利于下一步混合酒曲和“搭窩”。這一過程要盡可能的快速進(jìn)行,盡量避免將蒸好的板栗和黑米暴露在空氣中時(shí)間過長(zhǎng),造成細(xì)菌污染。

1.3.2.3 拌曲糖化

針對(duì)黑米糖化困難的實(shí)際情況,采用甜酒曲、米酒曲和小曲質(zhì)量比5∶3∶2的組合,復(fù)合發(fā)酵[18]。將加工過的板栗、黑米和活性酒曲按照酒曲的添加量占原料質(zhì)量的0.8%進(jìn)行攪拌。將攪拌均勻的混合物放入砂罐中,將其表面做成一個(gè)倒喇叭狀的窩,用酒精擦拭砂罐內(nèi)壁和罐蓋,并用無菌紗布覆蓋,嚴(yán)實(shí)密封,避免雜菌的污染。將其置于23 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行糖化發(fā)酵,發(fā)酵后可出現(xiàn)菌絲體和糖液。糖化酶的活性在50 h左右達(dá)到最高,然后霉菌進(jìn)入衰退階段,糖化酶的活性也隨之降低。因此,糖化反應(yīng)的時(shí)間為48 h,之后進(jìn)行發(fā)酵和成熟。

1.3.2.4 主發(fā)酵

考慮到酵母的生態(tài)喜好性和菌體量的平衡,將果酒酵母、葡萄酒酵母、米酒酵母按質(zhì)量比1∶0.8∶1混合,加入體積分?jǐn)?shù)2%的葡萄糖水,28 ℃活化50 min[19]作為較為適宜的酵母接種條件,能夠最大程度地促進(jìn)發(fā)酵效率,從而得到了較好的黑米酒發(fā)酵效果。將活化的混合酵母加入砂罐中,加入30 g松針汁和500 g水,發(fā)酵液的初始還原糖質(zhì)量濃度在100 g/L左右。然后在23 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行主發(fā)酵。每8 h進(jìn)行1次攪拌。測(cè)定每日的酒精含量及還原糖的濃度,直至還原糖的濃度穩(wěn)定,發(fā)酵8 d左右,完成主發(fā)酵進(jìn)程。

1.3.2.5 后處理

對(duì)砂罐中發(fā)酵物進(jìn)行手動(dòng)壓濾。將濾液置于4 ℃沉淀1 d,取上清液,加入明膠和殼聚糖復(fù)合澄清劑澄清,再用0.45 μm不銹鋼正壓桶式過濾器過濾。在85 ℃下加熱25 min后在110 ℃下進(jìn)行超高溫滅菌15 s,然后快速冷卻。冷卻后裝入經(jīng)高溫滅菌的陶瓷瓶中,即得試驗(yàn)用酒。繼續(xù)在4 ℃和30 ℃溫度下交替陳釀,間隔10 d,共陳釀40 d,即得成品松針板栗黑米酒。

1.3.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化

單因素試驗(yàn):松針汁添加量[1%、2%、3%、4%、5%,質(zhì)量分?jǐn)?shù)(下同)]、板栗添加量(20%、25%、30%、35%、40%)、復(fù)合酒曲添加量(0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%)、混合酵母添加量(0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%)、發(fā)酵溫度(24、26、28、30、32 ℃)和發(fā)酵時(shí)間(4、5、6、7、8 d)為影響因素,進(jìn)行單因素試驗(yàn),采用非糖固形物含量、酒精含量、氨基酸態(tài)氮含量為主,感官評(píng)價(jià)為輔的評(píng)價(jià)指標(biāo)體系,以此綜合考察各因素對(duì)松針板栗黑米酒品質(zhì)的影響[20]。響應(yīng)面試驗(yàn):在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,4個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)通過權(quán)重均衡化和離差標(biāo)準(zhǔn)化得出的綜合加權(quán)分作為響應(yīng)值(Y),利用DesignExpert12軟件設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)(表1),確定松針板栗黑米酒的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design test

1.3.4 測(cè)定方法

酒精含量的測(cè)定:重鉻酸鉀氧化法;還原糖濃度測(cè)定:GB 5009.7—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中還原糖的測(cè)定》直接滴定法;pH值、氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定:GB/T 13662—2018《黃酒》電位滴定法;非糖固形物含量的測(cè)定:GB/T 13662—2018《黃酒》重量法(仲裁法);水浸法:將經(jīng)預(yù)處理的松針加入水中,于80～90 ℃恒溫下進(jìn)行加熱。醇提法:在90 ℃下按料液比1∶20(g∶mL)進(jìn)行浸提。內(nèi)沸法:將經(jīng)預(yù)處理的松針在50%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇溶液中按料液比1∶1(g∶mL)充分浸沒,過濾后,將松針粉加入80 ℃的溫水中恒溫加熱[21]。

1.3.5 感官評(píng)定方法

感官評(píng)價(jià)小組由10名(5男5女)具有較強(qiáng)食品口感控制能力和相關(guān)經(jīng)驗(yàn)的食品專業(yè)人員組成,均已通過食品品質(zhì)分析及其應(yīng)用等專業(yè)課程,且經(jīng)過預(yù)選、初選、終選和統(tǒng)一培訓(xùn)等環(huán)節(jié),以保證感官評(píng)價(jià)結(jié)果的可靠性和可信度。在預(yù)選階段,篩選了具有較好味覺和嗅覺能力的人員;在初選階段,將相關(guān)人員帶入實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行初步的感官培訓(xùn)和限制性培訓(xùn);在終選階段,選定了較為敏銳的人員作為感官評(píng)價(jià)人員,并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的感官評(píng)價(jià)統(tǒng)一培訓(xùn)。

感官評(píng)價(jià)小組分別對(duì)松針板栗黑米酒的色、香、味、風(fēng)格進(jìn)行打分,總分100分,感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)列于表2。

表2 松針板栗黑米酒感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standard of pine needle chestnut black rice wine

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Response surface test design and results

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析

使用Design-Expert 12軟件,按照Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原則進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn),使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多重比較。使用Origin 2022軟件繪制圖表的組件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 輔料添加量對(duì)發(fā)酵工藝的影響

由圖2-a可知,當(dāng)松針汁添加量為2%時(shí),酒的非糖固形物含量達(dá)到了最高值25.3 g/L,酒精含量為13.6%,氨基酸態(tài)氮含量為0.48 g/L,感官評(píng)價(jià)為88分。當(dāng)松針汁添加量超過2%時(shí),醪液的發(fā)酵度降低,酒精含量不足,導(dǎo)致酒體不夠協(xié)調(diào)濃郁[22]。由圖2-b可知,板栗的最佳添加量為25%,在此添加量下,酒的非糖固形物含量為25.8 g/L,酒精含量為15.2%,氨基酸態(tài)氮含量為0.61 g/L,同時(shí)感官評(píng)價(jià)為90分。板栗添加量不足25%時(shí),口感層次不夠豐富,感官評(píng)價(jià)偏低;而超過30%時(shí),蛋白質(zhì)含量較高,影響酒的渾濁度。因此,在進(jìn)行綜合分析各指標(biāo)含量和感官評(píng)價(jià)后,確定板栗與松針汁的最佳添加量分別為25%和2%。

a-松針汁添加量;b-板栗添加量

2.1.2 發(fā)酵劑添加量對(duì)發(fā)酵工藝的影響

由圖3-a可知,當(dāng)復(fù)合酒曲添加量較少時(shí),樣品的非糖固形物含量、酒精含量和氨基酸態(tài)氮含量均較低,感官評(píng)價(jià)也不高。隨著復(fù)合酒曲添加量的增加,在1.2%時(shí)達(dá)到最優(yōu),但添加量超過1.2%后,酒精含量顯著升高,感官評(píng)價(jià)則顯著降低,并出現(xiàn)較大的酸味。這可能是由于復(fù)合酒曲過多,導(dǎo)致發(fā)酵不完全或產(chǎn)生氣味,進(jìn)而引發(fā)酸敗。圖3-b顯示,在松針板栗黑米酒中,隨著混合酵母使用量的增加,氨基酸態(tài)氮含量逐漸升高。當(dāng)混合酵母添加量為0.10%時(shí),非糖固形物含量達(dá)到最大值23.5 g/L,而酒精含量在0.04%～0.08%使用量范圍內(nèi)隨混合酵母使用量的增加而逐漸升高,當(dāng)添加量為0.08%時(shí),酒精含量可達(dá)14.9%。但超過0.08%的添加量后,酒精含量反而會(huì)降低。經(jīng)過綜合分析比較,最佳混合酵母使用量為0.10%。

a-復(fù)合酒曲添加量;b-混合酵母添加量

2.1.3 發(fā)酵條件對(duì)發(fā)酵工藝的影響

適宜的發(fā)酵溫度有利于酵母中微生物的生長(zhǎng)代謝,促進(jìn)發(fā)酵和酒精等生成物的產(chǎn)生,使黑米酒的香味更加豐富[23]。由圖4-a可知,發(fā)酵溫度升高時(shí),酒精、非糖固形物和氨基酸態(tài)氮含量均先增加后減少,28 ℃時(shí)達(dá)到最佳值(非糖固形物含量26.1 g/L,酒精含量14.3%,氨基酸態(tài)氮含量0.58 g/L,感官評(píng)價(jià)90分)。發(fā)酵溫度過高則導(dǎo)致糖分消耗過多,酸含量過高,各指標(biāo)下降。此外,圖4-b顯示,隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng),非糖類固形物含量減少,而氨基酸態(tài)氮和酒精含量增加。發(fā)酵初期,糖分含量較高,而隨著時(shí)間推移,酵母轉(zhuǎn)化糖分生成乙醇,提高酒精含量。同時(shí),酒曲中的蛋白酶分解蛋白質(zhì),形成氨基酸和多肽,增加酒香的刺激性,影響口感。綜合分析顯示,發(fā)酵溫度28 ℃和7 d的發(fā)酵時(shí)間是最佳條件。

a-發(fā)酵溫度;b-發(fā)酵時(shí)間

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵工藝試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1 數(shù)字模型的建立及分析

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ),對(duì)松針板栗黑米酒的發(fā)酵工藝進(jìn)行了研究。以松針汁添加量(A)、板栗添加量(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)作為影響因素,綜合加權(quán)分(Y)作為反應(yīng)值,進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合后,獲得各因素水平對(duì)松針板栗黑米酒綜合加權(quán)分(Y)影響的二次多項(xiàng)回歸模型:Y=-355.67+22.26A+2.56B+103.92C+0.26AB-0.10AC+0.02BC-6.48A2-0.060B2-7.21C2

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 4 Variance analysis of response surface test

采用Design-Expert 12軟件,通過Origin 2022繪圖,得到了松針板栗黑米酒的發(fā)酵過程的響應(yīng)面和等高線,可以較好地反映各種因素以及它們之間的交互作用。響應(yīng)面曲線越大,說明兩個(gè)因子之間的相互影響就越明顯。由圖5可知,松針汁添加量、板栗添加量與發(fā)酵時(shí)間的相互作用對(duì)綜合加權(quán)分的影響。響應(yīng)面的開口都向下,且有最高值,圖5-a顯示,松針汁添加量和板栗添加量交互的等高線為橢圓,表明對(duì)結(jié)果有較大的影響,且與方差分析相吻合。

a、d-松針汁添加量和板栗添加量交互響應(yīng)面及等高線圖;b、e-松針汁添加量和發(fā)酵時(shí)間交互響應(yīng)面及等高線圖;c、f-板栗添加量和發(fā)酵時(shí)間交互響應(yīng)面及等高線圖

2.3 最佳工藝參數(shù)確定與驗(yàn)證

通過Design-Expert 12軟件分析,得到松針板栗黑米酒的最佳發(fā)酵工藝條件為松針汁添加量2.206 12%,板栗添加量27.325 3%,發(fā)酵時(shí)間7.229 62 d,模型預(yù)測(cè)的綜合加權(quán)分最大預(yù)測(cè)分值為79.492 5?？紤]到實(shí)際操作性,綜合調(diào)整發(fā)酵工藝參數(shù)為松針汁添加量2.2%,板栗添加量27.3%,發(fā)酵時(shí)間7 d,復(fù)合酒曲添加量1.2%,混合酵母接種量0.1%,發(fā)酵溫度28 ℃,取3次試驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值,綜合加權(quán)分為80.13,結(jié)果表明,響應(yīng)面模型與實(shí)際狀況吻合較好,可以有效地指導(dǎo)發(fā)酵過程的優(yōu)化。

3 結(jié)論與討論

研究發(fā)現(xiàn),采用黑米酒發(fā)酵工藝,使用松針和板栗作為主要輔料,通過使用非糖固形物含量、酒精含量、氨基酸態(tài)氮含量等指標(biāo)體系進(jìn)行綜合考察,感官評(píng)價(jià)作為輔助評(píng)價(jià)指標(biāo),來評(píng)價(jià)各因素對(duì)松針板栗黑米酒品質(zhì)的影響。結(jié)果表明,松針和板栗是促進(jìn)黑米酒品質(zhì)的主要因素之一,它們對(duì)黑米酒的口感和品質(zhì)影響顯著。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,響應(yīng)面試驗(yàn)得出最佳發(fā)酵工藝條件為:松針汁添加量2.2%,板栗添加量27.3%,發(fā)酵時(shí)間7 d,復(fù)合酒曲添加量1.2%,混合酵母接種量0.1%,發(fā)酵溫度28 ℃,最終酒精含量為15.8%。制得的松針板栗黑米酒呈玫瑰色,色澤亮麗,口感柔軟,酒體和諧。

松針含有豐富的揮發(fā)性精油和多種有機(jī)酸,板栗富含淀粉和單寧酸等營(yíng)養(yǎng)成分,能夠促進(jìn)松針板栗黑米酒的形成和口感的提升。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及文獻(xiàn)的比對(duì)和分析發(fā)現(xiàn),使用松針和板栗作為輔料,能夠顯著提升黑米酒的品質(zhì),這是一個(gè)具有潛力的釀造方式。未來需要進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中的松針和板栗是否具有協(xié)同效應(yīng),探究板栗和松針對(duì)黑米酒釀造的影響機(jī)制,以提供更準(zhǔn)確的理論支持來改進(jìn)酒類生產(chǎn)工藝。