復(fù)合蛋白粉安全性和免疫功能評(píng)價(jià)

摘 要：本研究旨在評(píng)估復(fù)合蛋白粉（Complex Protein Powder，CPP）的安全性和免疫功能。急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)、遺傳毒性實(shí)驗(yàn)和亞急性口服毒性實(shí)驗(yàn)（28 d）結(jié)果顯示，CPP安全性較高，不會(huì)對(duì)小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響。CPP對(duì)小鼠免疫功能的影響試驗(yàn)顯示，中劑量組（1 667 mg·kg-1 bw·d-1）CPP可以顯著提升小鼠的NK細(xì)胞活性、巨噬細(xì)胞吞噬率等指標(biāo)，有效增強(qiáng)小鼠的免疫功能。

關(guān)鍵詞：乳清蛋白粉；大豆分離蛋白；復(fù)配蛋白粉；安全性；免疫功能評(píng)價(jià)

Evaluation of Safety and Immune Function of Complex Protein Powder

SHI Yawei1， TIAN Yachao2， ZHOU Linyi3*

（1.National Agricultural Science and Technology Park Management Committee of Jiansanjiang in Heilongjiang Province， Jiamusi 156399， China; 2.School of Food Science， Qilu University of Technology， Jinan 250300， China; 3.School of Food and Health， Beijing Technology and Business University， Beijing 100048， China）

Abstract： This study aims to evaluate the safety and immune function of Complex Protein Powder （CPP）. The safety of CPP was evaluated through acute oral toxicity test， genetic toxicity test and subacute oral toxicity test （28 d）. The experiment on the influence of CPP on mice’s immune system revealed that a moderate dose （1 667 mg·kg-1 bw·d-1）"of CPP could notably augment NK cell activity， macrophage phagocytosis rate and other markers in mice.

Keywords： whey protein powder; soy protein isolate; complex protein powder; safety; immune function evaluation

復(fù)合蛋白粉通常是由兩種及兩種以上不同來源的動(dòng)物蛋白或植物蛋白為主要原料制備而成的粉末狀產(chǎn)品。復(fù)合蛋白粉具有增強(qiáng)免疫力[1]、改善記憶力[2]、增強(qiáng)體質(zhì)和運(yùn)動(dòng)能力[3]的功效，因而受到了食品加工企業(yè)以及消費(fèi)者的青睞。豆粉是豆粕粉碎過篩后得到的產(chǎn)物，富含蛋白質(zhì)、脂肪以及人體所需的營養(yǎng)元素，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益和使用價(jià)值。

乳清蛋白是乳制品經(jīng)過沉淀作用除去酪蛋白后，從上清液中提取的物質(zhì)，其主要是由免疫球蛋白等功能性蛋白組成[4]。乳清蛋白作為一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)補(bǔ)充物質(zhì)，具有提高人體免疫力[5]、預(yù)防疾病[6]等功能，其常被廣泛應(yīng)用于復(fù)合蛋白粉中。

大豆分離蛋白屬于食品工業(yè)中的重要植物蛋白，含有大量的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)[7]。大豆分離蛋白經(jīng)過消化吸收后，會(huì)形成大豆蛋白多肽，可以發(fā)揮出抗疲勞、降血糖、增強(qiáng)免疫力等作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)大豆蛋白還具有預(yù)防肥胖[8]、增強(qiáng)體質(zhì)[9]、增強(qiáng)免疫力[10]等保健作用。

大豆蛋白及大豆分離蛋白、乳清蛋白和維生素C在各種保健食品較為常見，但將植物蛋白、動(dòng)物蛋白和維生素C復(fù)配后制備蛋白粉的研究較少。因此本研究通過急性毒性試驗(yàn)、遺傳毒性試驗(yàn)、28 d經(jīng)口毒性試驗(yàn)和免疫功能試驗(yàn)對(duì)CPP的安全性和功能進(jìn)行評(píng)估，為進(jìn)一步開發(fā)和利用復(fù)配蛋白產(chǎn)品提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

受試樣品為混合蛋白粉，每份含豆粉3 g，乳清蛋白粉3 g，大豆分離蛋白1 g，輔料3 g。用法用量：每日1次，每次1份，沖服，即0.167 g·kg-1 bw（成人體重按60 kg計(jì)）。試驗(yàn)菌株采用上海疾控中心提供的組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門菌。

昆明種SPF級(jí)小鼠及SD大鼠（雌雄），由北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司購得，經(jīng)營許可證為SCXK（京）2016-0011。將實(shí)驗(yàn)小鼠和大鼠放于溫度為（22±2）℃、濕度為55%±5%的密閉空間內(nèi)，在12 h的光照-暗循環(huán)中自由飲水和進(jìn)食。依據(jù)齊魯工業(yè)大學(xué)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》完成本試驗(yàn)的各項(xiàng)工作，且經(jīng)過齊魯工業(yè)大學(xué)動(dòng)物倫理學(xué)委員批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑

疊氮鈉從北京鼎國生物科技有限公司購得，2-乙酰氨基芴，1，8-二羥基蒽醌，環(huán)磷酰胺，敵克松和絲裂霉素C從Roche公司購得。血液分析試劑及生化試劑盒從深圳邁瑞生物醫(yī)用電子有限公司購得，細(xì)菌總DNA提取試劑盒從天根生化公司購得，DNA Marker從哈爾濱?；锛夹g(shù)有限公司購得。

1.1.3 儀器

電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；高壓滅菌鍋，日本Panasonic公司；離心機(jī)，美國TOMOS公司；生化分析儀和血細(xì)胞分析儀，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；熒光定量?jī)x（Qubit 3.0），美國Life Technologies公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

依據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中毒理學(xué)評(píng)價(jià)的相關(guān)方法和經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（Organisation for Economic Co-operation and Development，OECD）指南407中的相關(guān)規(guī)定，對(duì)CPP開展急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)、3項(xiàng)遺傳毒性試驗(yàn)及28 d的亞急性口服毒理學(xué)試驗(yàn)的研究。

1.2.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

對(duì)20只實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行研究，平均重量18～20 g，隨機(jī)分為兩組。在開始實(shí)驗(yàn)之前，必須讓小鼠保持14 h的饑餓狀態(tài)。測(cè)試物質(zhì)通過無菌水調(diào)和到每毫升含有1 g的懸浮溶液中，每公斤體重?cái)z入體積為20 mL，從給藥到結(jié)束共14 d，在此期間定時(shí)觀察小鼠的健康情況、出現(xiàn)的中毒跡象及其死亡比例。

1.2.2 遺傳毒性試驗(yàn)

（1）骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)。按照小鼠精母細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)的要求，當(dāng)急性毒性實(shí)驗(yàn)得不到LD50時(shí)，高劑量組以10.0 g·kg-1 bw為宜。從體重在18～22 g的小鼠中，選擇50只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。小鼠雌雄各25只，雌性小鼠和雄性小鼠各隨機(jī)分成5組。陰性對(duì)照組給予無菌水；劑量組使用水作為溶劑，分別以2.5 g·kg-1 bw、5.0 g·kg-1 bw和10.0 g·kg-1 bw的劑量給予藥物；陽性對(duì)照組則使用環(huán)磷酰胺（40 mg·kg-1）。每只小鼠的灌胃容量為200 μL/10 g bw，每隔24 h進(jìn)行1次，最后1次灌胃后等待6 h后，進(jìn)行骨髓涂片并染色觀察。共觀察和統(tǒng)計(jì)每只小鼠（嗜多染紅+正染紅）骨髓中的1 000個(gè)血淋巴細(xì)胞，并記錄所觀察到的成熟紅細(xì)胞數(shù)，計(jì)算未成熟紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞的比值（PCE/NCE）。

（2）精子畸形試驗(yàn)。將25只體重為（20±2）g的雄性小鼠隨機(jī)分成5組，其中劑量組的小鼠使用溶劑為水，劑量分別為2.5 g·kg-1 bw（低）、5.0 g·kg-1 bw（中）和10.0 g·kg-1 bw（高）；陰性對(duì)照組使用無菌水，陽性對(duì)照組使用環(huán)磷酰胺（劑量為40 mg·kg-1 bw），每天灌胃容量為200 μL/10 g bw，持續(xù)5 d。在首次灌胃后35 d，將小鼠處死，取下兩側(cè)副睪丸，制作精液涂片，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并記錄畸形精子的數(shù)量。

1.2.3 28 d經(jīng)口毒性試驗(yàn)

將80只體重為80～100 g的SD大鼠，分為陰性組、對(duì)照組和劑量組。劑量組分別進(jìn)行0.167 g·kg-1（低）、1.670 g·kg-1（中）和16.700 g·kg-1（高）的劑量處理。大鼠自由進(jìn)食，每天攝取量為100 g·kg-1 bw。

通過大鼠臟器指數(shù)評(píng)估樣品的28 d經(jīng)口急性毒性。在解剖之前，對(duì)大鼠進(jìn)行稱重，在解剖之后，摘取它們的各種器官，用無菌生理鹽水清洗表面，再用濾紙將它們吸干，然后快速稱重，稱重后，再用肉眼進(jìn)行尸檢，臟體比=臟器重量/體重×100%。

1.2.4 小鼠免疫功能檢測(cè)

SPF級(jí)昆明種小鼠160只，體重為（20±2）g，分為4組。第1組和第2組均為雌性小鼠，每組有40只。第1組用于進(jìn)行遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（Delayed Type Hypersensitivity，DTH）試驗(yàn)，而第2組用于小鼠碳廓清試驗(yàn)。第3組和第4組均為雄性小鼠，每組有40只。第3組用于巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)，而第4組用于測(cè)定NK細(xì)胞活性。每個(gè)免疫組又分為對(duì)照組和劑量組（共3個(gè)劑量組）。根據(jù)成人每日推薦攝入量（166.7 mg·kg-1 bw·d-1），設(shè)定低劑量組（833 mg·kg-1 bw·d-1）、中劑量組（1667 mg·kg-1 bw·d-1）、高劑量組（5 001 mg·kg-1 bw·d-1）。灌胃，每次用量20 g·kg-1。對(duì)照組用純水代替，灌胃30 d后測(cè)定免疫指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 20.0對(duì)本文數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量數(shù)據(jù)使用單因素方差分析，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)使用非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

由表1可知，實(shí)驗(yàn)大鼠灌胃CPP溶液后，食量、皮膚顏色、活動(dòng)均正常，無明顯的毒性反應(yīng)。結(jié)果表明，CPP對(duì)雄性和雌性大鼠的經(jīng)口LD50均高于20 g·kg-1 bw，按照急性毒性的劑量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 35823—2018）判定CPP為無毒級(jí)物質(zhì)。

2.2 遺傳毒性試驗(yàn)

2.2.1 骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

由表2可知，所有實(shí)驗(yàn)小組的小鼠PCE/NCE都在正常的范圍之內(nèi)（0.70～0.78），這證明了CCP對(duì)生物體沒有明顯的致死作用。與陰性對(duì)照組相比，不同劑量CPP的微核比率并無明顯差別，說明CCP在測(cè)試階段的安全性能良好且并未導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞發(fā)生異常變化。

2.2.2 小鼠精子畸形試驗(yàn)

由表3可知，陰性對(duì)照組的精子畸形率是2.00‰。與陰性對(duì)照組相比，高、中、低劑量組均無明顯的差別（P＞0.05）。陽性對(duì)照組小鼠精子的畸形率為13.60‰。相較于陰性對(duì)照組，陽性對(duì)照組有顯著不同（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CPP對(duì)于小鼠精子沒有明確的導(dǎo)致畸形的效用。

2.3 28 d亞急性口服毒理學(xué)試驗(yàn)

在動(dòng)物的安全評(píng)估實(shí)驗(yàn)中，臟體比是一個(gè)常用的衡量標(biāo)準(zhǔn)，它可以揭示被測(cè)試物質(zhì)對(duì)于生物組織的損害情況。由表4可知，劑量組和對(duì)照組之間，心臟、肝臟、脾臟、肺部和腎臟等器官的臟體比并沒有顯著差異（P＞0.05），說明CPP不會(huì)對(duì)大鼠的各臟器造成損傷。

2.4 小鼠免疫功能試驗(yàn)分析

通過DTH試驗(yàn)、小鼠廓清試驗(yàn)、巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)、NK細(xì)胞活性試驗(yàn)等評(píng)價(jià)小鼠的細(xì)胞免疫功能，試驗(yàn)結(jié)果見表5。與對(duì)照組相比，中劑量組CPP能顯著增強(qiáng)小鼠耳廓腫脹度、廓清試驗(yàn)吞噬指數(shù)、巨噬細(xì)胞吞噬率、巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)以及NK細(xì)胞活力，高劑量組CPP能顯著增強(qiáng)小鼠的耳廓腫脹度、廓清試驗(yàn)吞噬指數(shù)，說明中劑量組CPP能夠顯著增強(qiáng)小鼠的免疫功能。

3 結(jié)論

本研究對(duì)CPP的安全性和免疫功能進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)。急性經(jīng)口毒性、遺傳毒性和28 d亞急性口服毒理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果顯示，CPP是安全的，其對(duì)雄性和雌性大鼠的經(jīng)口LD50均高于20 g·kg-1 bw，按照急性毒性的劑量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通用要求》（GB/T 35823—2018）判定為無毒級(jí)物質(zhì)。免疫功能試驗(yàn)結(jié)果表明，中劑量組CPP能夠顯著增強(qiáng)小鼠耳廓腫脹度、廓清試驗(yàn)吞噬指數(shù)、巨噬細(xì)胞吞噬率、巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)以及NK細(xì)胞活性，說明中劑量組CPP能夠顯著增強(qiáng)小鼠的免疫功能。

參考文獻(xiàn)

[1]柏金霞，張彩雯，王蕓芳，等.復(fù)方濃縮乳清蛋白粉增強(qiáng)免疫力功能研究[J].食品界，2023（10）：111-113.

[2]郭月逸，郭豫，趙建，等.復(fù)合乳清蛋白粉改善小鼠記憶力功能研究[J].中國乳品工業(yè)，2022，50（12）：10-16.

[3]王冠宇.濃縮乳清蛋白粉對(duì)提升籃球運(yùn)動(dòng)員體能的作用[J].食品研究與開發(fā)，2023，44（20）：7-8.

[4]李云亮，劉曉霜，徐雅宣，等.乳清蛋白在臨床腸內(nèi)營養(yǎng)中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國乳品工業(yè)，2023，51（7）：45-51.

[5]HA D J，KIM J，KIM S，et al.Dietary whey protein supplementation increases immunoglobulin g production by affecting helper t cell populations after antigen exposure[J].Foods，2021，10（1）：194.

[6]SUPERTI F.Lactoferrin from bovine milk：a protective companion for life [J].Nutrients，2020，12（9）：2562.

[7]李翠芳，張釗，王才立，等.大豆分離蛋白在面包中的應(yīng)用研究[J].大豆科技，2020（1）：21-27.

[8]劉燕，李思瑤.大豆在預(yù)防和控制肥胖中的作用 [J].大豆科技，2022（5）：24-27.

[9]程建軍，劉麗，江連洲，等.大豆分離蛋白冰淇淋對(duì)維甲酸致小鼠骨質(zhì)疏松的防治作用[J].大豆科技，2013（4）：38-43.

[10]范玲慧，郭順堂.嬰兒豆基粉的發(fā)展與存在的問題[J].大豆科技，2015（3）：8-13.

基金項(xiàng)目：黑龍江省“揭榜掛帥”科技攻關(guān)（GY2021ZB0204）。

作者簡(jiǎn)介：史雅瑋（1992—），女，黑龍江佳木斯人，碩士，工程師。研究方向：糧食、農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)等。

通信作者：周麟依（1987—），女，黑龍江哈爾濱人，博士，副教授。研究方向：糧食加工、大豆資源開發(fā)利用。E-mail： dorisneau@126.com。