抑制miRNA-376c-3p對腎透明細(xì)胞癌生長的影響

鐔云輝 趙蓉 劉志明 卓奧 劉唐興

腎癌是常見的泌尿系統(tǒng)癌癥之一,腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是最常見的腎癌類型,約占所有原發(fā)病例的60%～80%,世界范圍內(nèi)每年有大量人死于該疾病,是威脅人類生命安全的全球性惡性疾病[1-3]。微小RNA(microRNA,miRNA)表達(dá)失調(diào)是ccRCC的重要致病因素,可通過干擾細(xì)胞周期來介導(dǎo)ccRCC的進(jìn)展[4],miR-376c-3p是一種具有抑癌作用的微小RNA,在胃癌組織中顯著表達(dá)不足并可作為其有效的生物標(biāo)記物[5]。研究顯示miR-376c-3p在乳腺癌組織、乳腺癌干細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞系中均下調(diào),能阻礙乳腺癌干細(xì)胞的自我更新、增殖和侵襲,降低乳腺癌細(xì)胞增殖及遷移能力并抑制其在異種移植瘤小鼠體內(nèi)生長[6-7];miR-376c-3p的異位表達(dá)可通過降低細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)而導(dǎo)致神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞周期阻滯及其細(xì)胞活力抑制[8],miR-376c-3p在口腔癌中下調(diào)并具有診斷和預(yù)測預(yù)后的潛力[9],因此推測miR-376c-3p可能成為ccRCC的診療靶點。本文通過體外培養(yǎng)人ccRCC細(xì)胞786-O并建立其裸鼠移植瘤模型,探究miRNA-376c-3對ccRCC的腫瘤細(xì)胞生長的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及細(xì)胞株:①SPF級BALB/c裸鼠購于湖北貝恩特生物科技有限公司[SCXK(鄂)2021-0027],雌性,7～8周,體重18～21 g,適應(yīng)飼養(yǎng)在濕度55%～60%、溫度22～25℃的屏障環(huán)境動物房內(nèi),1周后用于后續(xù)實驗,所有操作符合3R原則。②人ccRCC細(xì)胞系786-O、Caki-1、SN12-PM6、ACHN及正常人近段腎小管上皮細(xì)胞系HKC均購于國家實驗細(xì)胞資源共享平臺。

1.1.2 主要試劑與儀器:①miR-376c-3p inhibitor、miR-376c-3p mimics、miR-376c-3p陰性對照、miR-376c-3p與U6引物購于江蘇賽索飛生物科技有限公司;TRI試劑、一步法實時熒光定量PCR(real time quantitative PCR,RT-PCR)試劑盒購于西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;TUNEL檢測試劑盒、兔抗人Bax及Ki67一抗、吉姆薩染液、小鼠抗人Bcl-2一抗、Alexa Fluor?680偶聯(lián)驢抗兔二抗、Alexa Fluor?594偶聯(lián)驢抗小鼠二抗購于美國Abcam公司等。②ABI7500實時熒光定量PCR儀購于美國Applied Biosystems公司;CFM-200落射熒光顯微鏡購于成都市蘇凈科學(xué)器材有限公司;QP-04全自動冷凍切片機(jī)購于湖北泉林醫(yī)療設(shè)備有限公司等。

1.2 方法

1.2.1 以RT-PCR檢測HKC細(xì)胞與786-O、Caki-1、SN12-PM6、ACHN細(xì)胞系miRNA-376c-3p表達(dá):HKC細(xì)胞與786-O、Caki-1、SN12-PM6、ACHN細(xì)胞系均以39.7℃水浴快速解凍復(fù)蘇,用含10%胎牛血清的 PRMI-1640(786-O、Caki-1、SN12-PM6細(xì)胞)或DMEM培養(yǎng)基(ACHN、HKC細(xì)胞)分別進(jìn)行培養(yǎng),傳代后收集其細(xì)胞沉淀,置于TRI試劑內(nèi)混勻,遵照其試劑說明書中方法提取各細(xì)胞總RNA,以一步法RT-PCR試劑盒內(nèi)預(yù)混液、引物及PCR級水制備反應(yīng)體系,遵照試劑盒說明書中方法進(jìn)行RT-PCR反應(yīng),得到各細(xì)胞miRNA-376c-3p及U6 循環(huán)閾值后,采用2-ΔΔCt方法分析其相對表達(dá),確定miRNA-376c-3p及U6引物序列。見表1。

表1 基因引物序列

1.2.2 分組轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞:于24孔板中傳代培養(yǎng)786-O細(xì)胞至對數(shù)生長期,隨機(jī)分為對照組、miR-376c-3p inhibitor組、miR-376c-3p mimics組、陰性對照組,采用脂質(zhì)體2000進(jìn)行分組轉(zhuǎn)染:miR-376c-3p inhibitor組轉(zhuǎn)染miR-376c-3p inhibitor,miR-376c-3p mimics組轉(zhuǎn)染miR-376c-3p mimics,陰性對照組轉(zhuǎn)染miR-376c-3p陰性對照,轉(zhuǎn)染劑量及步驟均參照各自說明書中指導(dǎo),對照組以等劑量脂質(zhì)體2000處理,均于處理24 h后對4組細(xì)胞進(jìn)行檢測。

1.2.3 以RT-PCR檢測4組786-O細(xì)胞miRNA-376c-3p表達(dá):1.2.2中轉(zhuǎn)染后的4組細(xì)胞使用TRI試劑提取其中總RNA,進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)檢測4組miRNA-376c-3p相對表達(dá),具體方法見1.2.1。

1.2.4 以Ki67免疫熒光染色、集落生成實驗檢測4組786-O細(xì)胞增殖

1.2.4.1 Ki67免疫熒光染色:1.2.2中轉(zhuǎn)染后的4組細(xì)胞經(jīng)PBS漂洗、10%甲醛固定、抗原修復(fù)、5%山羊血清封閉后,孵育兔抗人Ki67一抗(以5%山羊血清稀釋100倍)、漂洗、避光孵育Alexa Fluor?680偶聯(lián)驢抗兔二抗(以5%山羊血清稀釋200倍)、避光漂洗后使用熒光顯微鏡觀察4組細(xì)胞,拍攝其圖像后運用Image J軟件定量各組細(xì)胞總數(shù)與Ki67陽性數(shù),根據(jù)公式:增殖率=Ki67陽性數(shù)/總數(shù)×100%算出各組細(xì)胞增殖率。

1.2.4.2 集落生成實驗:收集1.2.2中轉(zhuǎn)染后的4組細(xì)胞,經(jīng)PBS漂洗后計數(shù),每組取約60個細(xì)胞接種在12孔板中乘相應(yīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周,以PBS漂洗、10%甲醛固定4組形成的細(xì)胞集落,孵育吉姆薩染液后漂洗,使用顯微鏡觀察4組細(xì)胞,拍攝其圖像后運用Image J軟件定量4組集落總數(shù),根據(jù)公式:集落形成率=轉(zhuǎn)染組集落總數(shù)/對照組集落總數(shù)×100%算出4組細(xì)胞集落形成率。

1.2.5 以TUNEL染色檢測4組786-O細(xì)胞凋亡:1.2.2中轉(zhuǎn)染后的4組細(xì)胞經(jīng)PBS漂洗、10%甲醛固定后,孵育TUNEL染液、漂洗后用顯微鏡觀察各組細(xì)胞,拍攝其圖像后運用Image J軟件定量各組細(xì)胞總數(shù)與凋亡數(shù),根據(jù)公式:凋亡率=凋亡數(shù)/總數(shù)×100%計算4組細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 以免疫熒光染色檢測4組786-O細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)并比較其Bax/Bcl-2:1.2.2中轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞經(jīng)PBS漂洗、10%甲醛固定、抗原修復(fù)、5%山羊血清封閉后,孵育兔抗人Bax一抗及小鼠抗人Bcl-2一抗(均以5%山羊血清稀釋100倍)、漂洗、避光孵育Alexa Fluor?680偶聯(lián)驢抗兔二抗及Alexa Fluor?594偶聯(lián)驢抗小鼠二抗(均以5%山羊血清稀釋200倍)、避光漂洗后使用熒光顯微鏡觀察4組細(xì)胞,拍攝其圖像后運用Image J軟件定量4組細(xì)胞Bax、Bcl-2陽性表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度,根據(jù)公式:Bax/Bcl-2=Bax陽性表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度/Bcl-2陽性表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度算出各組細(xì)胞Bax/Bcl-2。

1.2.7 建立786-O裸鼠移植瘤模型并測定其腫瘤體積與質(zhì)量:參考文獻(xiàn)[10]建立786-O裸鼠移植瘤模型:取1.2.2中轉(zhuǎn)染后的4組細(xì)胞,經(jīng)PBS漂洗后計數(shù),以PBS制成密度為1×107個/mL的細(xì)胞懸液,每組取200 μL與基質(zhì)膠以5∶1的體積比混勻后接種在裸鼠右腋窩皮下,1周后觀察到裸鼠皮下有米粒大小硬塊產(chǎn)生表明造模成功,每組成功造模6只,繼續(xù)飼養(yǎng)2周后頸椎脫臼處死,剪開右腋皮膚取出腫瘤塊,使用游標(biāo)卡尺測量各組腫瘤塊最長和最短徑,分別作為腫瘤長度和寬度,根據(jù)公式:體積=長度×短度2/2計算4組裸鼠腫瘤體積,然后以電子天平測量各組裸鼠腫瘤質(zhì)量。

1.2.8 以Ki67免疫熒光染色及TUNEL染色分別檢測各組裸鼠腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡。

1.2.8.1 Ki67免疫熒光染色:1.2.7中的腫瘤塊以蒸餾水清洗、10%甲醛固定后液氮內(nèi)速凍,修剪為方塊后置于全自動冷凍切片機(jī)內(nèi)切為5 μm厚的切片,以預(yù)冷甲醇固定后進(jìn)行抗原修復(fù),然后按照1.2.4中方法進(jìn)行Ki67免疫熒光染色后用熒光顯微鏡觀察、拍攝各組細(xì)胞,用Image J軟件定量4組圖像中細(xì)胞總數(shù)與Ki67陽性數(shù),根據(jù)公式:Ki67陽性比=Ki67陽性數(shù)/總數(shù)×100%算出4組細(xì)胞Ki67陽性比。

1.2.8.2 TUNEL染色:上述腫瘤組織冷凍切片以預(yù)冷甲醇固定后按照1.2.5中方法進(jìn)行TUNEL染色,用熒光顯微鏡觀察、拍攝各組細(xì)胞后以Image J軟件定量各組圖像中細(xì)胞總數(shù)與TUNEL陽性數(shù),根據(jù)公式:TUNEL陽性比=TUNEL陽性數(shù)/總數(shù)×100%算出4組細(xì)胞TUNEL陽性比。

2 結(jié)果

2.1 ccRCC細(xì)胞系786-O、Caki-1、SN12-PM6、ACHN及HKC細(xì)胞miR-376c-3p表達(dá) 與HKC細(xì)胞比較,ccRCC細(xì)胞系786-O、Caki-1、SN12-PM6、ACHN中miR-376c-3p表達(dá)降低(P<0.05)。見表2。

表2 5細(xì)胞miR-376c-3p相對表達(dá) n=6,

2.2 4組786-O細(xì)胞miR-376c-3p表達(dá) 與對照組比較,miR-376c-3p inhibitor組細(xì)胞miR-376c-3p相對表達(dá)降低(P<0.05);miR-376c-3p mimics組細(xì)胞miR-376c-3p相對表達(dá)升高(P<0.05),陰性對照組細(xì)胞miR-376c-3p相對表達(dá)無明顯變化(P>0.05)。見表3。

表3 4組786-O細(xì)胞miR-376c-3p相對表達(dá) n=6,

2.3 miR-376c-3p對786-O細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較,miR-376c-3p inhibitor組細(xì)胞Bax/Bcl-2降低(P<0.05);miR-376c-3p mimics組細(xì)胞Bax/Bcl-2升高(P<0.05);陰性對照組細(xì)胞Bax/Bcl-2無明顯變化(P>0.05)。見表4,圖1。

圖1 免疫熒光染色檢測4組786-O細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)(×1 000)

表4 4組786-O細(xì)胞Bax/Bcl-2 n=6,

2.4 miR-376c-3p對786-O細(xì)胞增殖凋亡的影響 與對照組比較,miR-376c-3p inhibitor組細(xì)胞增殖率、集落形成率升高(P<0.05),凋亡率降低(P<0.05);miR-376c-3p mimics組細(xì)胞增殖率、集落形成率降低(P<0.05),凋亡率升高(P<0.05);陰性對照組細(xì)胞增殖率、集落形成率、凋亡率無明顯變化(P>0.05)。見圖2～4,表5。

圖2 4組786-O細(xì)胞增殖(Ki67免疫熒光染色×200)

圖3 4組786-O細(xì)胞集落生成(吉姆薩染色×200)

圖4 4組786-O細(xì)胞凋亡(TUNEL染色×200)

表5 4組786-O細(xì)胞增殖率、集落形成率、凋亡率 n=6,%,

2.5 miR-376c-3p對786-O裸鼠腫瘤生長的影響 與對照組比較,miR-376c-3p inhibitor組裸鼠腫瘤體積與質(zhì)量升高(P<0.05);miR-376c-3p mimics組裸鼠腫瘤體積與質(zhì)量降低(P<0.05);陰性對照組裸鼠腫瘤體積與質(zhì)量無明顯變化(P>0.05)。見表6。

表6 4組裸鼠腫瘤體積與質(zhì)量 n=6,

2.6 miR-376c-3p對786-O裸鼠腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響 與對照組比較,miR-376c-3p inhibitor組裸鼠腫瘤組織Ki67陽性比升高(P<0.05),TUNEL陽性比降低(P<0.05);miR-376c-3p mimics組裸鼠腫瘤組織Ki67陽性比降低(P<0.05),TUNEL陽性比升高(P<0.05);陰性對照組裸鼠腫瘤組織Ki67陽性比、TUNEL陽性比無明顯變化(P>0.05)。見圖5、6,表7。

圖5 4組裸鼠腫瘤細(xì)胞增殖(Ki67免疫熒光染色×200)

圖6 4組裸鼠腫瘤細(xì)胞凋亡(TUNEL染色×200)

表7 4組裸鼠腫瘤細(xì)胞Ki67與TUNEL陽性比

3 討論

ccRCC的發(fā)病率每年都在增加,手術(shù)切除腫瘤后輔助化療、放療、靶向治療和免疫檢查點抑制劑治療等是目前臨床中主流治療手段,對著ccRCC分子生物學(xué)和遺傳學(xué)研究的廣泛深入,ccRCC的治療取得了突破和巨大進(jìn)展,但很多患者因進(jìn)展到晚期且發(fā)生了轉(zhuǎn)移,其預(yù)后的提升仍然非常有限,因此還需深入探究ccRCC發(fā)生發(fā)展機(jī)制來改進(jìn)其診療技術(shù)[11-13]。

miRNA是一種內(nèi)源性表達(dá)的非編碼RNA,可通過調(diào)控抑癌或致癌基因表達(dá)而參與癌細(xì)胞增殖、生長、轉(zhuǎn)移等各種惡性生物學(xué)行為,在許多不同類型的惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[14-15],miR-376c-3p作為一種腫瘤調(diào)控miRNA在甲狀腺癌、胃癌等多種癌癥中明顯低表達(dá),上調(diào)其表達(dá)可抑制乳頭狀甲狀腺癌癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲并減弱胃癌細(xì)胞的體內(nèi)外惡性行為[16-17],miR-376c-3p可對甲狀腺髓樣癌細(xì)胞的生存、遷移和侵襲起到抑制作用[18],降低miR-376c-3p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)hsa_circ_0014130下調(diào)對胃癌惡性進(jìn)展的抑制作用[19],由此預(yù)測miR-376c-3p可能是ccRCC的新型治療靶點。

本文結(jié)果顯示,人ccRCC細(xì)胞系786-O、Caki-1、SN12-PM6、ACHN中miRNA-376c-3p表達(dá)相比正常人近段腎小管上皮細(xì)胞系HKC降低,表明miR-376c-3p參與ccRCC的發(fā)生過程;以miR-376c-3p模擬物miR-376c-3p mimics上調(diào)786-O細(xì)胞miR-376c-3p表達(dá),可降低其增殖率、集落形成率,并升高其凋亡率,其抑制劑miRNA-376c-3 inhibitorp轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞起到相反作用,表明過表達(dá)miR-376c-3p可抑制ccRCC細(xì)胞增殖、集落生成,并促進(jìn)其凋亡,而抑制miR-376c-3p表達(dá)對ccRCC細(xì)胞發(fā)揮促增殖及抗凋亡作用;Bax、Bcl-2是重要的凋亡調(diào)控蛋白,分別起到促凋亡與抗凋亡作用,在ccRCC惡性進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20],本文以miR-376c-3p mimics轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞可降低其裸鼠移植瘤模型腫瘤組織Ki67陽性比、腫瘤體積與質(zhì)量,升高其腫瘤組織TUNEL陽性比,miRNA-376c-3 inhibitor轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞起到相反作用,表明上調(diào)miR-376c-3p表達(dá)可抑制ccRCC裸鼠移植瘤模型體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長并誘導(dǎo)其凋亡,而抑制miR-376c-3p表達(dá)能促進(jìn)裸鼠移植瘤模型體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長并減弱其凋亡,揭示miR-376c-3p能成為潛在的ccRCC新型治療靶點,在其臨床治療中具有廣大研發(fā)前景。

綜上所述,本文證實了miRNA-376c-3p可參與介導(dǎo)ccRCC細(xì)胞的生長過程,抑制miR-376c-3p表達(dá)可促進(jìn)ccRCC細(xì)胞增殖、集落生成及在其裸鼠移植瘤內(nèi)的生長,并削弱其體內(nèi)外凋亡,上調(diào)miR-376c-3p表達(dá)起到與上述相反的作用并發(fā)揮明顯抗癌功效,本文為深入研討ccRCC的致病機(jī)制提供了新型作用靶點,有助于研發(fā)及改進(jìn)ccRCC臨床治療技術(shù)。