FOXC1人表皮干細(xì)胞向汗腺細(xì)胞分化的影響

趙亞平 劉坤坤 高瑋 高慧 謝淼

人體嚴(yán)重?zé)齻騽?chuàng)傷常引發(fā)皮膚的大面積缺損,而創(chuàng)面修復(fù)后患者常因汗腺缺失、分泌管道被瘢痕組織阻塞而無法分泌汗液,引發(fā)體溫調(diào)節(jié)障礙[1]。如何實現(xiàn)汗腺修復(fù)和皮膚重建是目前醫(yī)學(xué)界關(guān)注的重點(diǎn)內(nèi)容。表皮干細(xì)胞與汗腺均來源于外胚層,已有研究顯示表皮干細(xì)胞能在特定環(huán)境及關(guān)鍵因子的誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)化為毛囊或皮脂腺,對改善創(chuàng)傷后皮膚重建和排汗功能具有重要意義[2]。叉頭框C1(FOXC1)蛋白是轉(zhuǎn)錄因子FOX家族重要成員,其可參與調(diào)控毛囊干細(xì)胞和造血干細(xì)胞干性[3,4],但其在表皮干細(xì)胞中作用尚不明確。本次研究通過設(shè)計合成FOXC1模擬物,通過轉(zhuǎn)染導(dǎo)入表皮干細(xì)胞,探究其對表皮干細(xì)胞向汗腺細(xì)胞分化的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2021年1月至2022年6月于我院泌尿外科行包皮環(huán)切術(shù)7例患者的正常包皮組織,年齡18～41歲,本研究取得患者知情同意和醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。將包皮組織修剪成約1 cm×1 cm大小,加入0.25%胰酶+EDTA消化分離表皮和真皮層,Ⅳ型膠原黏附法分離表皮干細(xì)胞,然后在含人重組表皮生長因子(EGF)、K-SFM的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),定期換液,觀察細(xì)胞生長情況,待生長至90%融合時消化下來,取二代表皮干細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗,并根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征及免疫組化檢測細(xì)胞表型結(jié)果以鑒定表皮干細(xì)胞,免疫組化檢測角蛋白(CK)19、CK18、癌胚抗原(CEA)、β1整合素(ITGB1),以CK19、ITGB1棕黃陽性表達(dá),CK18、CEA陰性表達(dá)作為符合表皮干細(xì)胞。取處于生長對數(shù)期的表皮干細(xì)胞,按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將FOXC1 shRNA干擾質(zhì)粒、pCMV-FOXC1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中,并采用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定干擾FOXC1 表達(dá)和穩(wěn)定過表達(dá)FOXC1 的細(xì)胞,分別作為過表達(dá)組和干擾組,另取一組細(xì)胞不做處理作為對照組,

1.2 試劑與儀器 胰酶-EDTA、人重組表皮生長因子(EGF)、膠質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(K-SFM)、Ⅳ型膠原(均購自美國Gibco公司),FOXC1 shRNA干擾質(zhì)粒、pCMV-FOXC1過表達(dá)質(zhì)粒(購自美國Origene公司),Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、Trizol試劑(美國賽默飛公司),TTBS液(上海欽誠生物科技有限公司),兔抗人CK19、CK18、CEA、ITGB1、β-actin一抗及IgG-HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(購自美國Abgent公司),MTT試劑盒(上海超研生物科技有限公司),吉姆薩染液(上海鈺博生物科技有限公司);酶標(biāo)儀(美國賽默飛公司Multiskan FC型),激光共聚焦顯微鏡(德國徠卡M525 F40型),電泳儀(上海譜振生物科技有限公司JY-1000C型),PCR儀(美國ABI公司9700型)。

1.3 RT-PCR檢測細(xì)胞FOXC1 mRNA表達(dá) 取轉(zhuǎn)染72 h后細(xì)胞采用Trizol試劑提取總RNA,并進(jìn)行純化和定量。每個樣本取2 μg逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,設(shè)計FOXC1及內(nèi)參β-actin引物,隨后進(jìn)行RT-PCR,反應(yīng)條件:95℃ 10 min,95℃ 15 s,60℃ 1 min,40 cycles。每個樣本重復(fù)測定2次,并以2-ΔΔCt法計算FOXC1 mRNA相對表達(dá)量。

1.4 Western blot檢測細(xì)胞目的蛋白表達(dá) 取3組轉(zhuǎn)染72 h后細(xì)胞中總蛋白,并進(jìn)行定量。每個樣本取50 μg進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,隨后轉(zhuǎn)膜、封閉,分別加入一抗(兔抗人CK19、CK18、CEA、ITGB1、β-actin,稀釋比例均為1∶200)并4℃孵育過夜,次日用TTBS將其沖洗后加入IgG-HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶5 000)37℃孵育2 h,TTBS沖洗后曝光,系統(tǒng)掃描呈現(xiàn),采用Image Pro-plus 6.0軟件分析灰度值,并以β-actin對比計算目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.5 MTT實驗檢測細(xì)胞增殖水平 將細(xì)胞接種在96孔板中,每隔3天取3孔進(jìn)行MTT實驗,實驗前換成新鮮培養(yǎng)液,并加入10% MTT,25℃孵育4 h,用移液槍移去培養(yǎng)基,用PBS洗滌2次,隨后加入150 μL二甲基亞砜,震蕩5 min,最后用酶標(biāo)儀測定570 nm處的OD值。

1.6 吉姆薩染色檢測細(xì)胞克隆形成 轉(zhuǎn)染72h后將細(xì)胞消化下來并計數(shù),將細(xì)胞接種到6孔板中(每孔約200個),每組設(shè)置3個重復(fù)孔,在37℃ 5%CO2中培養(yǎng)14 d,然后移液槍移去培養(yǎng)基,甲醇固定10 min后PBS沖洗2次,隨后進(jìn)行吉姆薩染色10 min,將染液沖洗干凈后晾干,在顯微鏡下隨機(jī)選擇10個視野,并計算克隆形成率。

1.7 激光共聚焦顯微鏡檢測Ca2+濃度 采用激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞中Ca2+濃度,分別于轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染72 h將孔板上細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液,采用Ca2+探針STDIn負(fù)載表皮干細(xì)胞后在顯微鏡下觀察,每孔隨機(jī)選擇5個視野,每個視野中取10個細(xì)胞,測定細(xì)胞Ca2+平均熒光像素值。

1.8 ELISA檢測培養(yǎng)基上清液中MMP-2、MMP-9表達(dá) 收集各組細(xì)胞上清液,按照ELISA試劑盒說明書檢測培養(yǎng)基上清液中MMP-2、MMP-9濃度,并在450 nm處測得OD值,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線及方程(MMP-2:Y=3898.4X-299.6,MMP-7:Y=2010.4X-217.5),并據(jù)此計算MMP-2、MMP-9濃度。

2 結(jié)果

2.1 3組RT-PCR、Western blot檢測FOXC1 mRNA及蛋白表達(dá)比較 RT-PCR、Western blot檢測顯示,與對照組比較,過表達(dá)組細(xì)胞中FOXC1 mRNA及蛋白相對表達(dá)量升高,干擾組中FOXC1 mRNA及蛋白相對表達(dá)量降低(P<0.05)。見表1。

表1 3組細(xì)胞FOXC1 mRNA及蛋白表達(dá)

2.2 3組MTT實驗及吉姆薩染色檢測細(xì)胞增殖、克隆形成率比較 通過觀察細(xì)胞增殖情況可見,表皮干細(xì)胞在接種后第3天進(jìn)入快速生長期,約第6天到達(dá)穩(wěn)定期,故選擇轉(zhuǎn)染時及第3、6、9 天時測定細(xì)胞增殖情況。MTT實驗及吉姆薩染色結(jié)果顯示,與對照組比較,過表達(dá)組細(xì)胞增殖水平、克隆形成率升高,干擾組細(xì)胞增殖水平、克隆形成率降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組細(xì)胞增殖及克隆形成率比較

2.3 3組ELISA檢測培養(yǎng)基中MMP-2、MMP-9表達(dá)比較 ELISA檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,過表達(dá)組細(xì)胞MMP-2、MMP-9表達(dá)量升高(P<0.05),干擾組中MMP-2、MMP-9表達(dá)量降低(P<0.05)。見表3。

表3 3組細(xì)胞MMP-2、MMP-9表達(dá)

2.4 3組激光共聚焦檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度比較 激光共聚焦顯微鏡檢測顯示,與對照組比較,過表達(dá)組細(xì)胞中Ca2+熒光強(qiáng)度升高,干擾組中Ca2+熒光強(qiáng)度降低(P<0.05)。見表3。

2.5 3組Western blot檢測表皮干細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)記蛋白表達(dá)比較 Western blot檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,過表達(dá)組CK18、CEA蛋白表達(dá)量升高,ITGB1、CK19蛋白表達(dá)量降低(P<0.05),干擾組CK18、CEA蛋白表達(dá)量降低,ITGB1、CK19蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)。見表4。

表4 3組Western blot檢測表皮干細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)記蛋白表達(dá)

3 討論

大面積燒傷患者創(chuàng)面愈合后其皮膚功能重建問題依然是醫(yī)學(xué)界關(guān)注的重點(diǎn)問題,而干細(xì)胞移植以誘發(fā)汗腺再生是臨床皮膚修復(fù)重建的新方向[5]。從胚胎發(fā)育角度來看,外胚層上皮細(xì)胞是表皮干細(xì)胞與汗腺細(xì)胞的共同起源,能通過不斷分裂在表皮嵴形成上皮細(xì)胞索,而該細(xì)胞索逐漸發(fā)育為導(dǎo)管和分泌部,構(gòu)成汗腺[6]。相關(guān)研究顯示,汗腺細(xì)胞可由表皮干細(xì)胞在特定環(huán)境下分化而來[7],提示可通過表皮干細(xì)胞向汗腺細(xì)胞分化來實現(xiàn)汗腺再生。

FOXC1位于人6號染色體上,其結(jié)構(gòu)擁有一個與DNA結(jié)合的叉頭區(qū)域,是一種對器官發(fā)育具有重要作用的轉(zhuǎn)錄因子[8]。隨著近年來分子生物學(xué)的進(jìn)展,通過全基因組大范圍篩查轉(zhuǎn)錄因子作用規(guī)律,已經(jīng)證實了部分轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控細(xì)胞分化中的作用[8]。此外,對細(xì)胞分化起決定性作用的DNA甲基化、組蛋白修飾等表觀遺傳學(xué)修飾,也受到轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合影響,故認(rèn)為轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞重編中具有重要作用[9]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)FOXC1能通過上調(diào)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)來增強(qiáng)腫瘤干細(xì)胞活性,還能抑制單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化,同時促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的克隆形成[10]。有研究顯示,FOXC1在汗腺細(xì)胞中表達(dá)明顯高于表皮干細(xì)胞[11],但關(guān)于FOXC1在表皮干細(xì)胞中作用及對維持腫瘤干細(xì)胞異常增殖的作用機(jī)制仍未確定。本次根據(jù)FOXC1序列設(shè)計模擬物,通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將FOXC1到離體的表皮干細(xì)胞中,通過RT-PCR及Western blot測定各組FOXC1表達(dá),且提示轉(zhuǎn)染成功。本次研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染后過表達(dá)組細(xì)胞增殖水平、克隆形成率高于對照組,干擾組增殖水平、克隆形成率低于對照組,提示FOXC1可提高表皮干細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞干性,這對于細(xì)胞分化具有重要意義。此外,汗腺的產(chǎn)生除細(xì)胞外基質(zhì)重建和細(xì)胞運(yùn)動兩個部分,腺體胚芽細(xì)胞下陷生長的同時還能分泌MMP-2、MMP-9等金屬基質(zhì)蛋白酶,從而介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)降解,促進(jìn)下陷生長細(xì)胞向表皮層深入生長,最終形成腺體[12,13]。本次研究中過表達(dá)組轉(zhuǎn)染后MMP-2、MMP-9水平明顯高于對照組,而干擾組MMP-2、MMP-9低于對照組,提示FOXC1可能在促進(jìn)表皮干細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)降解和下陷生長中起作用。表皮干細(xì)胞在個體生長發(fā)育的各個階段廣泛存在,具有一定的定向分化能力,而Ca2+濃度升高提示細(xì)胞活化,這對細(xì)胞生長及分化過程也起到重要作用[14]。轉(zhuǎn)染后過表達(dá)組Ca2+熒光強(qiáng)度的提高,提示在FOXC1作用下,表皮干細(xì)胞具備了發(fā)生部分功能轉(zhuǎn)化的分子基礎(chǔ)[15]。ITGB1、CK19是主要在表皮干細(xì)胞表達(dá)的標(biāo)記物,而CK18、CEA僅在汗腺中表達(dá)[16],本次研究結(jié)果顯示,過表達(dá)組表皮干細(xì)胞標(biāo)記物CK18、CEA蛋白表達(dá)量明顯高于對照組,在汗腺表達(dá)的ITGB1、CK19表達(dá)量低于對照組,而干擾組反之,提示FOXC1可在體外促進(jìn)表皮干細(xì)胞向汗腺細(xì)胞表型變化。此外,還有研究顯示ITGB1、CK19表達(dá)上調(diào)提示細(xì)胞克隆形成及增殖能力的提高[17],這與MTT實驗及吉姆薩染色結(jié)果一致。相關(guān)動物實驗顯示,在小鼠汗腺發(fā)育后期,FOX家族多種蛋白(FOXC a1～a3)能通過Shh通路和EDA通路促進(jìn)汗腺分泌部的發(fā)育和汗液分泌[18],提示FOXC1可能也通過上述通路參與表皮干細(xì)胞向汗腺細(xì)胞的定向分化,但具體情況有待進(jìn)一步研究和論證。