吳茱萸堿調(diào)節(jié)SDF-1α/CXCR4信號通路對顱內(nèi)動(dòng)脈瘤血管平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

饒重賢 胡姍姍 譚偉 王軍民 金勝昔 周游

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤(intracranial aneurysm,IA)是發(fā)生在顱內(nèi)動(dòng)脈壁上的一種疾病,使動(dòng)脈發(fā)生永久性擴(kuò)張。如果IA破裂會(huì)導(dǎo)致很高的死亡率發(fā)生。臨床上主要采用手術(shù)來進(jìn)行預(yù)防及治療,嚴(yán)重缺乏有效的藥物對IA進(jìn)行治療[1-2]。IA的發(fā)病機(jī)制包括血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的過度凋亡、血管內(nèi)膜增生等,其中VSMCs的增殖和凋亡與IA有密切關(guān)聯(lián)[3]。因此,本文對IA相關(guān)的小鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(aortic vascular smovoth muscle cells,MOVAS)的藥物作用機(jī)制進(jìn)行研究,促進(jìn)人類對于IA的有效治療。吳茱萸堿來自于中藥吳茱萸,經(jīng)過現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),其具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤作用外,還可以保護(hù)心腦血管[4-5]?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子1α(stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α)是一種趨化因子,參與細(xì)胞的增殖和凋亡,應(yīng)激誘導(dǎo)后表達(dá)增多。CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4,CXCR4)則是一種G蛋白偶聯(lián)受體,是SDF-1α的受體,同樣在多種細(xì)胞中表達(dá)[6]。有研究發(fā)現(xiàn),SDF-1α/CXCR4通路也參與血管的生成和延伸[7]。而筆者發(fā)現(xiàn)對于吳茱萸堿能否通過調(diào)控SDF-1α/CXCR4信號通路對IA VSMCs的增殖和凋亡產(chǎn)生影響研究的還比較少。因此,本研究旨在探究吳茱萸堿與SDF-1α/CXCR4信號通路對IA VSMCs的影響以及其相互作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及動(dòng)物 (1)小鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(MOVAS)來自杭州杰西摩生物科技有限公司。(2)24只雄性BALB/c小鼠,體重為18～22 g,購自湖北貝恩特生物科技有限公司,生產(chǎn)許可證號為SCXK(鄂)2021-0027,該研究已得到本院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 平滑肌22α(SM22α)抗體來自上海煊翎生物科技有限公司;平滑肌α肌動(dòng)蛋白(α-SMA)抗體來自武漢華美生物工程有限公司;吳茱萸堿來自湖北惠擇普醫(yī)藥科技有限公司;MTT來自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司;DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液購自上海和序生物科技有限公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒購自廈門研科生物技術(shù)有限公司;凋亡試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司;胎牛血清購自上海躍騰生物技術(shù)有限公司;CTCE-0214購自上海鴻肽生物科技有限公司;兔源一抗SDF-1α、GAPDH購自上海鴻肽生物科技有限公司;兔源一抗BAX、CXCR4來自普健生物(武漢)科技有限公司;兔源一抗PCNA購自上海澤葉生物科技有限公司;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自鎮(zhèn)江厚普生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠顱動(dòng)脈瘤模型構(gòu)建:取24只小鼠,隨機(jī)分為對照組以及IA組,每組12只。腹腔注射3%的戊巴比妥鈉麻醉小鼠,用絲線結(jié)扎IA小鼠頸總動(dòng)脈,采用立體定位注射手術(shù)將10 μL彈性蛋白酶注射入定位點(diǎn),消毒,縫合,再注射血管緊張素溶液[8],對照組小鼠采用相同方法注射等體積的0.9%氯化鈉溶液。造模成功后,取小鼠顱內(nèi)動(dòng)脈瘤組織以及顱內(nèi)正常動(dòng)脈組織備用。將取出的動(dòng)脈瘤組織以及正常動(dòng)脈組織分別在4%多聚甲醛中固定、脫水、包埋和切片后,進(jìn)行HE染色,最后在顯微鏡下觀察。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng):將MOVAS在含有10%FBS、1%青霉素/鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)液中培養(yǎng),并置于37℃、5% CO2的濕潤培養(yǎng)箱中。細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后則可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 MTT法檢測吳茱萸堿濃度對細(xì)胞的活性影響:將參考文獻(xiàn)[9]中方法由0.5 mmol/L過氧化氫(H2O2)培養(yǎng)以誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的MOVAS,以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的濃度接種到96孔板中,相應(yīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后,加入不同濃度的吳茱萸堿(0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 μmol/L),另外剩余一部分不加任何吳茱萸堿,作為空白組[10]。培養(yǎng)24 h后,向每個(gè)孔中加入10 μL的MTT試劑。孵育2 h后,再加入三聯(lián)液過夜,然后使用多功能酶標(biāo)儀在570 nm處監(jiān)測光密度值并分析其細(xì)胞存活率。

1.3.4 細(xì)胞分組:進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí),將MOVAS分為ctrl組、Model組、低濃度吳茱萸堿組、高濃度吳茱萸堿組、高濃度吳茱萸堿+CTCE-0214組,除ctrl組正常培養(yǎng)外,其余組均用0.5 mmol/L H2O2培養(yǎng)以誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。Model組不作其他特殊處理。其他組則分別再用低濃度吳茱萸堿(0.50 μmol/L)、高濃度吳茱萸堿(1.00 μmol/L)、高濃度吳茱萸堿(1.00 μmol/L)+CTCE-0214(10 μmol/L)[11]進(jìn)行干預(yù)處理,在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3.5 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)檢測細(xì)胞增殖:將MOVAS進(jìn)行孵育處理,分別培養(yǎng)24、48、72 h后,向每個(gè)孔中加入10 μL的CCK-8試劑。孵育2 h后,使用多功能酶標(biāo)儀在450 nm處監(jiān)測光密度值并分析其細(xì)胞存活率。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡:將MOVAS接種至6孔板(3×104個(gè)/mL)中,培養(yǎng)24 h。根據(jù)試劑盒說明書要求,將細(xì)胞固定,然后用FITC膜連蛋白V/碘化丙啶對細(xì)胞進(jìn)行雙重染色,使用流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur)檢測并分析,最后使用相關(guān)軟件處理得到細(xì)胞凋亡率。

1.3.7 Western blot檢測細(xì)胞中SDF-1α、CXCR4、BAX、PCNA、SM22α、α-SMA蛋白表達(dá):將培養(yǎng)的MOVAS在RIPA緩沖液中裂解,提取總蛋白。使用蛋白質(zhì)分析試劑對蛋白質(zhì)進(jìn)行量化、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)移到PVDF膜上、用脫脂乳阻斷封閉,然后將膜與稀釋的一抗SDF-1α(1∶1 000)、CXCR4(1∶1 000)、BAX(1∶1 000)、PCNA(1∶1 000)、SM22α(1∶400)、α-SMA(1∶200)、GAPDH(1∶5 000)在4℃下孵育過夜,然后將膜與HRP標(biāo)記的二抗孵育1 h。然后用ECL試劑觀察免疫反應(yīng)蛋白。使用Image LabTM軟件分析目標(biāo)蛋白的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 HE染色對比IA組織以及正常動(dòng)脈組織 與對照組正常動(dòng)脈組織相比,IA組的IA組織中VSMCs的數(shù)量大幅減少,動(dòng)脈的內(nèi)膜和外膜都有一定程度的損傷,細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂,并且出現(xiàn)炎性浸潤。見圖1。

圖1 IA組織和正常動(dòng)脈組織(HE×400)

2.2 吳茱萸堿濃度對細(xì)胞活性影響 受損傷的MOVAS以不同濃度的吳茱萸堿處理后,細(xì)胞存活率也不同,根據(jù)結(jié)果數(shù)據(jù)顯示,隨著吳茱萸堿濃度的增加,與空白組比較,細(xì)胞的存活率呈上升趨勢(P<0.05)。且當(dāng)吳茱萸堿的濃度為1.00 μmol/L時(shí),細(xì)胞存活率升至50%左右,所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)選定低濃度吳茱萸堿為0.50 μmol/L,高濃度吳茱萸堿為1.00 μmol/L。見表1。

表1 6組損傷MOVAS存活率比較 n=5,%,

2.3 5組MOVAS增殖能力比較 Model組比ctrl組細(xì)胞存活率明顯減小(P<0.05);低濃度吳茱萸堿組、高濃度吳茱萸堿組與Model組比較,細(xì)胞存活率出現(xiàn)上升趨勢(P<0.05);高濃度吳茱萸堿組與低濃度吳茱萸堿組相比,細(xì)胞存活率有更加明顯地上升(P<0.05);高濃度吳茱萸堿+CTCE-0214組與高濃度吳茱萸堿組比較,細(xì)胞存活率下降(P<0.05)。見表2。

表2 5組MOVAS存活率比較 n=5,%,

2.4 5組損傷MOVAS凋亡比較 Model組MOVAS細(xì)胞凋亡率與ctrl組比較明顯增加(P<0.05);低濃度吳茱萸堿組、高濃度吳茱萸堿組與Model組比較,MOVAS凋亡率降低(P<0.05);高濃度吳茱萸堿組與低濃度吳茱萸堿組相比,細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05);而高濃度吳茱萸堿+CTCE-0214組與高濃度吳茱萸堿組比較,細(xì)胞凋亡率又出現(xiàn)增高趨勢(P<0.05)。見表3,圖2。

表3 5組MOVAS凋亡率比較 n=5,%,

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測5組MOVAS凋亡水平

2.5 5組MOVAS中SDF-1α、CXCR4、BAX、PCNA、SM22α、α-SMA相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與ctrl組比較,Model組PCNA、SM22α、α-SMA蛋白表達(dá)降低,BAX、SDF-1α、CXCR4蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與Model組比較,低濃度吳茱萸堿組、高濃度吳茱萸堿組PCNA、SM22α、α-SMA蛋白表達(dá)升高,BAX、SDF-1α、CXCR4蛋白表達(dá)降低(P<0.05);與低濃度吳茱萸堿組比較,高濃度吳茱萸堿組PCNA、SM22α、α-SMA蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高,BAX、SDF-1α、CXCR4蛋白表達(dá)則更低(P<0.05);與高濃度吳茱萸堿組比較,高濃度吳茱萸堿+CTCE-0214組PCNA、SM22α、α-SMA蛋白表達(dá)出現(xiàn)降

低現(xiàn)象,而BAX、SDF-1α、CXCR4蛋白表達(dá)則升高(P<0.05)。見表4,圖3。

表4 5組MOVAS中SDF-1α、CXCR4、BAX、PCNA、SM22α、α-SMA蛋白表達(dá)比較 n=6,

圖3 western blot檢測MOVAS中SDF-1α、CXCR4、BAX、PCNA蛋白表達(dá);A ctrl組;B Model組;C 低濃度吳茱萸堿組;D 高濃度吳茱萸堿組;E 高濃度吳茱萸堿+CTCE-0214組

3 討論

IA有著很高的致殘率和死亡率,臨床上科技的發(fā)展使IA可以被及時(shí)檢查出來,但是治療仍然受限。IA的發(fā)生發(fā)展就與VSMCs有著緊密的聯(lián)系[12]。因?yàn)閂SMCs可以調(diào)節(jié)血管張力,當(dāng)VSMCs受到損傷后,會(huì)失去收縮或放松能力,從而導(dǎo)致病理變化產(chǎn)生疾病[13]。因此本文就以MOVAS為研究對象,檢測吳茱萸堿對于MOVAS增殖和凋亡的影響。結(jié)果顯示,與ctrl組比較,Model組細(xì)胞存活率、PCNA蛋白表達(dá)降低(P<0.05);細(xì)胞凋亡率以及相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)升高(P<0.05),表明MOVAS受到損傷影響,細(xì)胞凋亡增強(qiáng),增殖減少。

吳茱萸作為中藥早就得到了廣泛的應(yīng)用,而其中的有效物質(zhì)之一吳茱萸堿屬于喹諾酮類生物堿,具有很多藥理作用?；诖擞邢嚓P(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,吳茱萸堿可以對大鼠的VSMCs遷移產(chǎn)生影響;還對動(dòng)脈粥樣硬化中的VSMCs有抑制作用[14-15]。因?yàn)镮A的發(fā)生發(fā)展與VSMCs密切相關(guān),吳茱萸堿對VSMCs有影響,所以本研究選取吳茱萸堿對MOVAS的作用進(jìn)行探索。結(jié)果顯示,低、高濃度吳茱萸堿處理的損傷MOVAS均可降低細(xì)胞的凋亡率,凋亡相關(guān)蛋白BAX表達(dá)減少,增殖相關(guān)蛋白PCNA以及VSMCs相關(guān)蛋白SM22α、α-SMA表達(dá)增加。改善其存活率,減輕細(xì)胞的損傷,且吳茱萸堿濃度越高,對應(yīng)指標(biāo)的變化趨勢越明顯。表明吳茱萸堿可抑制損傷MOVAS的凋亡,使其趨于正常。

SDF-1α作為一種趨化因子,可以誘導(dǎo)毛細(xì)血管的形成,在造血、免疫中也有作用。研究稱,引入SDF-1α可以改善血管移植物中VEGF作用與性質(zhì)[16-17]。而作為SDF-1α的唯一一個(gè)同源受體CXCR4同樣參與細(xì)胞生長、血管病變、炎癥等過程[18-19]。對于SDF-1α/CXCR4信號通路早已有團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn),其可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞的發(fā)展而發(fā)揮作用,可以影響VEGF的功能[20];另有研究稱SDF-1α/CXCR4會(huì)參與血管應(yīng)激后過程,它可以改善血管炎癥,維持血管穩(wěn)態(tài)[21]。本研究結(jié)果顯示,誘導(dǎo)損傷的MOVAS Model組SDF-1α、CXCR4蛋白表達(dá)升高;低、高濃度吳茱萸堿處理均可降低誘導(dǎo)損傷的MOVAS中SDF-1α、CXCR4蛋白表達(dá),且吳茱萸堿濃度越高,對SDF-1α、CXCR4蛋白表達(dá)的抑制作用越明顯,推測吳茱萸堿可能通過抑制SDF-1α/CXCR4信號通路減少對誘導(dǎo)損傷的MOVAS的凋亡。為了驗(yàn)證該猜想,本研究利用通路激活劑來干預(yù)高濃度吳茱萸堿處理的損傷的MOVAS,結(jié)果顯示, CTCE-0214減弱了高濃度吳茱萸堿對損傷的MOVAS的凋亡抑制作用。證實(shí)了吳茱萸堿可能通過抑制SDF-1α/CXCR4通路抑制顱內(nèi)IA VSMCs的凋亡。

綜上所述,吳茱萸堿可能通過抑制SDF-1α/CXCR4通路抑制損傷的MOVAS的凋亡,為開發(fā)新的治療IA的藥物提供了理論基礎(chǔ)以及治療方法。然而本研究尚存在不足之處,即吳茱萸堿在體內(nèi)對于SDF-1α/CXCR4信號通路的影響尚未進(jìn)行,而且可能吳茱萸堿對IA的作用在體內(nèi)會(huì)有所不同,有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)對吳茱萸堿的深入探究。