苦參堿調(diào)節(jié)Notch信號通路對高糖誘導的滋養(yǎng)層細胞增殖和凋亡的影響

李艷蓉 鄒余糧

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)會導致胎盤異常,嚴重者會導致妊娠受損以及新生兒出生缺陷[1]。而近幾年GDM的發(fā)病率逐漸升高,也大幅增加了兒童在生命早期患肥胖、代謝綜合征等疾病的幾率[2-3]。研究顯示,苦參的干燥根用于痢疾和濕疹等,在臨床上應用廣泛[4]。苦參中的主要活性成分就是苦參堿(C15H24N2O),具有治療癌癥、抗炎、抗糖尿病、改善心血管疾病等雙重藥理活性[5-6]。此外,Notch信號通路在胚胎和器官發(fā)育以及調(diào)控細胞生長方面具有重要作用,包括細胞增殖和凋亡;例如有研究顯示Notch通路參與肝臟生長發(fā)育以及病理變化過程,可以抑制肝臟纖維化[7-8]。隨后發(fā)現(xiàn)Notch信號通路誘導會導致細胞死亡并損傷組織,而且Notch通路被證明對糖尿病造成的腎損傷有關(guān),通過抑制Notch通路可以有效緩解[9]。而筆者發(fā)現(xiàn)對于苦參堿能否通過調(diào)控Notch信號通路對高糖誘導的人滋養(yǎng)層細胞的增殖和凋亡產(chǎn)生的影響研究較少。本文探究苦參堿對高糖誘導的人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞HTR-8/SVneo的增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞HTR-8/SVneo來自上海雅吉生物科技有限公司。

1.2 主要試劑 苦參堿來自成都普思生物科技股份有限公司;RPMI-1640細胞培養(yǎng)液購自上海浩洋生物科技有限公司;細胞計數(shù)試劑盒購自北京奧秘佳得醫(yī)藥科技有限公司;凋亡試劑盒、兔源一抗Notch1、PCNA、β-Tubulin購自愛必信(上海)生物科技有限公司;胎牛血清購自成都化夏化學試劑有限公司;Notch通路激活劑Jagged1購自上海研卉生物科技有限公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒購自上海一研生物科技有限公司;丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒購自上海研卉生物科技有限公司;二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測定試劑盒來自上?？道噬锟萍加邢薰?兔源一抗BAX、Bcl-2購自上海鈺博生物科技有限公司;辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗購自上海莼試生物技術(shù)有限公司。

1.3 細胞培養(yǎng) 將HTR-8/SVneo細胞在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)基補充添加10%FBS和1%的青霉素-鏈霉素。然后將細胞維持在37℃和5% CO2/95%空氣的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 CCK-8法檢測苦參堿對高糖誘導損傷的HTR-8/SVneo的活性影響及分組

1.4.1 細胞處理:將對數(shù)期生長的HTR-8/SVneo細胞消化、計數(shù),以4×105個/mL的細胞密度接種在96孔板中。然后用25 mmol/L高糖誘導損傷[10],再用不同劑量的苦參堿(0.50、1.00、1.50、2.00 mmol/L)處理細胞[11],對照組(苦參堿0.00 mmol/L)不進行其他特殊處理。培養(yǎng)48 h后,每孔加入10 μL CCK-8試劑,然后將細胞繼續(xù)培養(yǎng)2 h后,用多功能酶標儀檢測細胞在450 nm處的吸光度值計算細胞的存活率。

1.4.2 細胞分組:取對數(shù)期的HTR-8/SVneo細胞,分為ctrl組、HG組、低濃度苦參堿組、高濃度苦參堿組、高濃度苦參堿+Jagged1組。除ctrl組用正常5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng),其余組均用25 mmol/L高糖濃度培養(yǎng)以誘導損傷。HG組細胞不再作其他特殊處理,根據(jù)上述CCK-8實驗結(jié)果將其他組則分別再用1.00 μmol/L苦參堿、1.50 μmol/L高濃度苦參堿處理,而高濃度苦參堿+Jagged1組則在用1.5 μmol/L苦參堿處理的基礎上,再加入500 μg/L Jagged1處理[12]。上述5組細胞置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),以供后續(xù)實驗使用。

1.5 CCK-8試劑盒檢測HTR-8/SVneo細胞增殖能力 將5組HTR-8/SVneo以4×105個細胞/mL的濃度接種到96孔板中,根據(jù)1.4中相似的操作步驟孵育細胞,最后使用多功能酶標儀在450 nm處監(jiān)測光密度值,處理計算5組細胞存活率。

1.6 流式細胞術(shù)檢測HTR-8/SVneo細胞凋亡 將5組細胞消化處理、計數(shù),先用ArmexinV-FITC避光孵育,然后加入碘化丙啶(PI)避光孵育。離心、PBS洗滌并混勻,在流式細胞儀(BD FACSCalibur)中檢測細胞凋亡并處理分析細胞凋亡率。

1.7 5組HTR-8/SVneo細胞氧化應激指標檢測 將5組細胞培養(yǎng)消化處理,然后裂解細胞,離心,取細胞上清液按照試劑盒說明書分別檢測HTR-8/SVneo細胞中SOD、MDA水平。

1.8 Western blot檢測5組HTR-8/SVneo細胞中Notch1、PCNA、BAX、Bcl-2蛋白表達 向收集處理的5組HTR-8/SVneo細胞中加入RIPA蛋白裂解緩沖液,再加入蛋白酶抑制劑,提取細胞總蛋白。將蛋白質(zhì)用BCA檢測試劑盒進行定量、凝膠電泳,轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上、用5%的脫脂乳室溫封閉,加入一抗Notch1(1∶1 000)、PCNA(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、BAX(1∶1 000)、β-Tubulin(1∶1 000),4℃下孵育過夜,漂洗,然后將膜中加入二抗室溫孵育2 h。漂洗并加入ECL顯色試劑觀察免疫反應蛋白,在成像儀中檢測,最后使用Image Lab軟件分析目標蛋白的表達。

2 結(jié)果

2.1 苦參堿對HG誘導損傷的HTR-8/SVneo細胞活性影響 隨著苦參堿濃度的增加,與0.00 mmol/L苦參堿組比較,其他不同濃度苦參堿處理的HG損傷細胞的存活率不斷升高(P<0.05)。因此在后續(xù)實驗中選定1.50 mmol/L作為高濃度苦參堿組,而低濃度苦參堿組則為1.00 mmol/L。見表1。

表1 苦參堿對HG誘導的HTR-8/SVneo細胞活性影響 n=5,%,

2.2 5組HTR-8/SVneo細胞增殖能力比較 HG組比ctrl組細胞存活率明顯下降(P<0.05);低濃度苦參堿組、高濃度苦參堿組與HG組比較,細胞存活率上升(P<0.05);高濃度苦參堿組與低濃度苦參堿比較,細胞存活率有更加明顯的上升(P>0.05);高濃度苦參堿+Jagged1組與高濃度苦參堿組比較,細胞存活率下降(P>0.05)。見表2。

表2 5組HTR-8/SVneo細胞存活率、凋亡率比較 n=5,%,

2.3 5組HTR-8/SVneo細胞凋亡率比較 采用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況。HG組HTR-8/SVneo細胞凋亡率與ctrl組比較明顯升高(P<0.05);低濃度苦參堿組、高濃度苦參堿組與HG組比較,HTR-8/SVneo細胞凋亡率降低(P<0.05);高濃度苦參堿組與低濃度苦參堿比較,細胞凋亡率進一步降低(P<0.05);而高濃度苦參堿+Jagged1組與高濃度苦參堿組比較,細胞凋亡率上升,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2,圖1。

圖1 流式細胞術(shù)檢測5組HTR-8/SVneo細胞凋亡水平

2.4 5組HTR-8/SVneo細胞中氧化應激指標SOD、MDA比較 與ctrl組比較,HG組SOD水平降低,MDA水平升高(P<0.05);與HG組比較,低劑量苦參堿組、高劑量苦參堿組SOD水平升高,MDA水平降低(P<0.05);與低劑量苦參堿組比較,高劑量苦參堿組SOD水平升高,MDA水平降低(P<0.05);與高劑量苦參堿組比較,高劑量苦參堿+MSU組SOD水平降低,MDA水平升高(P<0.05)。見表3。

表3 5組HTR-8/SVneo細胞中SOD、MDA水平比較 n=5,

2.5 5組HTR-8/SVneo細胞中Notch1、PCNA、BAX、Bcl-2相關(guān)蛋白表達比較 與ctrl組比較,HG組PCNA、Bcl-2蛋白表達降低,Notch1、BAX蛋白表達升高(P<0.05);與HG組比較,低濃度苦參堿組、高濃度苦參堿組的PCNA、Bcl-2蛋白表達升高,Notch1、BAX蛋白表達降低(P<0.05);與低濃度苦參堿組比較,高濃度苦參堿組PCNA、Bcl-2蛋白表達進一步升高,Notch1、BAX蛋白表達則更低(P<0.05);與高濃度苦參堿組比較,高濃度苦參堿+Jagged1組PCNA、Bcl-2蛋白表達出現(xiàn)降低現(xiàn)象,而Notch1、BAX蛋白表達則升高(P<0.05)。見圖2,表4。

圖2 Western blot檢測HTR-8/SVneo細胞中Notch1、PCNA、BAX、Bcl-2蛋白表達;A ctrl組;B HG組;C 低濃度苦參堿組;D 高濃度苦參堿組;E 高濃度苦參堿+Jagged1組

表4 5組HTR-8/SVneo細胞中Notch、PCNA、BAX、Bcl-2蛋白表達比較 n=5,

3 討論

妊娠期很容易發(fā)生糖尿病而導致GDM,使GDM的發(fā)病幾率較高。而且GDM會使胎兒健康受到威脅[13]。胎盤作為母體與胎兒之間聯(lián)系的重要器官,GDM的發(fā)生會使胎盤受到影響,使其形態(tài)以及功能都發(fā)生異常。胎盤中的絨毛滋養(yǎng)層細胞是重要的母胎交換屏障細胞,影響營養(yǎng)物質(zhì)的交換,GDM發(fā)生時會導致絨毛滋養(yǎng)層細胞發(fā)生變化[14-15]。因此本文以高糖誘導人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞HTR-8/SVneo,造成細胞損傷進行后續(xù)研究,期望改善高糖對滋養(yǎng)層細胞的損傷,為臨床GDM治療提供基礎。結(jié)果顯示,與ctrl組比較,HG組細胞多項實驗結(jié)果異常,表明用高糖誘導的HTR-8/SVneo受到損傷,細胞增殖減少,凋亡增強。以上證實高糖誘導的HTR-8/SVneo細胞損傷可用作研究GDM的細胞模型。

苦參堿是天然的喹啉類生物堿,具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗病毒等多種生物學作用,相關(guān)研究表明苦參堿可以減輕異丙腎上腺素誘導的大鼠心臟毒性;減輕阿霉素治療引起的腎病;可作用于大鼠關(guān)節(jié)炎降低關(guān)節(jié)炎指數(shù)等,表明苦參堿是應用潛力很大的藥物[16]。許多研究顯示,苦參堿可以通過PI3K/AKT/mTOR通路誘導肺癌細胞凋亡;抑制NF-κB信號通路抑制乳腺癌細胞增殖等,參與細胞的增殖、凋亡、分化等過程[17]。所以本研究選取苦參堿探究其在除了抗腫瘤以外的作用,期望能擴大苦參堿的臨床應用。本研究結(jié)果顯示,不同濃度的苦參堿可以改善高糖誘導損傷的HTR-8/SVneo的活性,而且可以減輕HTR-8/SVneo的損傷,且隨著苦參堿濃度升高,其效用也在逐漸增高。表明苦參堿可以增強高糖誘導的滋養(yǎng)層細胞的活性并抑制HTR-8/SVneo細胞的凋亡,從而發(fā)揮藥物治療作用。

Notch信號通路的關(guān)鍵部分包括Notch受體(Notch1、2、3)和Notch配體以及靶基因[18]。Notch受體與配體的結(jié)合使Notch發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞生長的作用,這一作用在胎盤血管系統(tǒng)以及胎盤形成中至關(guān)重要;有報道顯示,Notch信號通路在缺氧導致的滋養(yǎng)層遷移和侵襲過程有重要意義,會對先兆子癇的發(fā)生與發(fā)展有一定的促進作用[19-20]。本研究中通過對Notch信號通路的研究發(fā)現(xiàn),高糖誘導的HTR-8/SVneo細胞中,HG組PCNA、Bcl-2蛋白表達降低,Notch1、BAX蛋白表達升高;低、高濃度苦參堿處理組均可改善高糖誘導的HTR-8/SVneo中以上蛋白的表達,并且苦參堿濃度越高,對上述蛋白的影響越明顯。推測苦參堿可能通過抑制Notch信號通路降低對高糖誘導損傷的HTR-8/SVneo的凋亡,增加其細胞活性。為了驗證該猜想,本研究利用Notch通路激活劑Jagged1來干預高濃度苦參堿處理的高糖誘導的HTR-8/SVneo細胞,結(jié)果提示,Jagged1減弱了高濃度苦參堿對高糖誘導的HTR-8/SVneo的損傷的影響,證實了苦參堿可能通過抑制Notch信號通路改善高糖誘導HTR-8/SVneo細胞造成的損傷,進而可能對GDM發(fā)揮一定的治療作用。

綜上所述,苦參堿可能通過抑制Notch信號通路抑制高糖誘導的HTR-8/SVneo細胞凋亡并提高細胞活性。該研究為擴大苦參堿的臨床應用以及針對GDM的新型治療方法治療提供了理論基礎。但是本研究尚存在不足之處,因為本文中對于苦參堿以及Notch通路的研究僅在細胞層面,而未進行體內(nèi)研究,所以有待后續(xù)進行體內(nèi)深入實驗,進一步探究苦參堿的作用。