產(chǎn)果膠酶曲霉菌株的篩選、果膠酶酶學性質(zhì)及在香蕉果汁生產(chǎn)中的應用

摘要 本研究從土壤中分離篩選得到一株產(chǎn)果膠酶的絲狀真菌XYYWZSP4，用以橘子皮粉為碳源的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后，培養(yǎng)液中的果膠酶活力為0.78±0.01 U/mL。觀察該菌株在察氏培養(yǎng)基平板上的形態(tài)和分生孢子梗的形態(tài)，鑒定其為曲霉。測得該菌株液體培養(yǎng)產(chǎn)生果膠酶的酶學性質(zhì)：最適作用pH值為4.5，最適作用溫度為60 ℃，在pH值3.0～8.0范圍內(nèi)穩(wěn)定（殘余酶活力高于90%），在不高于40 ℃環(huán)境下穩(wěn)定。該果膠酶具有優(yōu)良的金屬離子相容性，在所有供試金屬離子中，僅5 mM鈣離子抑制該酶的酶活力。將該果膠酶應用于實驗室試驗香蕉果汁生產(chǎn)中，得到果汁產(chǎn)率達（89.85±1.57）%，果汁中還原性物質(zhì)含量達（11.53±0.09） g/L。

關(guān)鍵詞 果膠酶；曲霉；酶學性質(zhì)；香蕉果汁

中圖分類號 TS255.44? ?文獻標識碼 A

文章編號 1007-7731（2024）08-0101-06

Screening of pectinase producing Aspergillus strain， enzymatic properties of pectinase and its application in banana juice production

XIAN Yingying

（Wuzhou University， Wuzhou 543002， China）

Abstract A filamentous fugal strain XYYWZSP4 producing pectinase was isolated from soil sample， and （0.78±0.01） U/mL of pectinase activity in culture broth was produced by using orange peel powder as sole carbon source. It was identified as Aspergillus sp. by observation of colony characters on Czapek medium plate and conidiophore. The enzyme property of its pectinase was determined as following： optimal pH at 4.5， optimal temperature at 60 ℃， stable at pH range of 3.0-8.0 （with residual enzyme activity higher than 90%）; stable at temperature not higher than 40 ℃. The pectinase had excellent metal ions compatibility with only inhibition effect of calcium at 5 mM among all tested metal ions. When the pectinase was applied in banana juice production， the juice yield of （89.85±1.57）% and reducing material concentration of （11.53±0.09） g/L were obtained.

Keywords pectinase; Aspergillus; enzyme property; banana juice

果膠是一種來自植物的生物大分子，又稱聚半乳糖醛酸，其主鏈為通過α-（1，4）糖苷鍵連接的半乳糖醛酸聚合體，部分半乳糖醛酸可能會被甲酯化或被小分子單糖糖基化[1]。果膠在植物體內(nèi)具有極其重要的作用，其主要存在于中膠層，可以將相鄰細胞黏連；亦存在于細胞壁中，參與構(gòu)成細胞壁[2]。果膠酶是降解果膠的酶的統(tǒng)稱，主要分為降解修飾半乳糖醛酸殘基的基團的酶和降解主鏈上α-（1，4）糖苷鍵的酶，其中，降解主鏈上α-（1，4）糖苷鍵的酶被分為隨機降解內(nèi)部鍵和降解外部鍵的酶，隨機降解內(nèi)部鍵的酶按照降解方式被分為以水解方式降解的內(nèi)切聚半乳糖醛酸酶和以裂解方式降解的果膠裂合酶[3]。

在水果果汁生產(chǎn)中起主要作用的果膠酶為內(nèi)切聚半乳糖醛酸酶，因為其最適作用pH值為酸性，而水果果汁的自然pH值亦為酸性[4]。在果汁中加入果膠酶可以促進水解果膠，以降低果汁黏度和提高果汁的產(chǎn)率，因此，果汁工業(yè)生產(chǎn)中常廣泛加入工業(yè)果膠酶制劑[5]。目前的工業(yè)果膠酶制劑是用黑曲霉菌株生產(chǎn)的Pectinex XXL和Pectinex color[6]，可供果汁企業(yè)選擇的工業(yè)果膠酶制劑品種較少。由于各種水果果汁的pH值不一致，因而無法完全保證工業(yè)果膠酶制劑能適用于所有水果果汁的生產(chǎn)[5]。

本研究從土壤中分離絲狀真菌，并將菌株進行液態(tài)培養(yǎng)。通過測定培養(yǎng)液中的果膠酶活力獲得產(chǎn)果膠酶的菌株，并鑒定其為曲霉屬真菌。測定菌株所產(chǎn)果膠酶的酶學性質(zhì)，并檢驗其在果汁生產(chǎn)中的應用效果。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 試驗藥品與試劑? 聚半乳糖醛酸和半乳糖醛酸均購買自上海源葉生物科技有限公司（化學純）。橘子皮粉為沙糖橘果皮經(jīng)烘箱烘干，用小型植物組織粉碎機粉碎，過60目篩子分離后所得粉末。

1.1.2 試驗儀器? 往復式恒溫搖床（上海智城分析儀器制造有限公司），數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠），超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），低溫冰箱（中科美菱低溫科技股份有限公司），Olympus Cx21光學顯微鏡（Olympus株式會社），微波爐（青島膠南海爾微波制品有限公司），離心機（德國Eppendorf有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集與微生物分離? 在梧州學院內(nèi)采集花圃土壤樣品，將土壤置于滅菌后的水中充分震蕩獲得菌懸液。將菌懸液用滅菌后的水以10倍為梯度進行稀釋，每個稀釋梯度所得菌懸液取50 μL涂布于僅以橘子皮粉為碳源的分離培養(yǎng)基平板上，在28 ℃溫度下培養(yǎng)5 d后觀察微生物的生長情況。

培養(yǎng)基配方：橘子皮粉10 g/L，胰蛋白胨5 g/L，K2HPO4 3 g/L，（NH4）2SO4 2.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，F(xiàn)eSO4 0.025 5 g/L，pH 5.5，瓊脂粉2%。

1.2.2 微生物復篩? 將能在分離培養(yǎng)基平板上生長的微生物接種至篩選培養(yǎng)基中（篩選培養(yǎng)基為不含瓊脂粉的分離培養(yǎng)基），在28 ℃、180 rpm的搖床中培養(yǎng)5 d，測定培養(yǎng)液中的果膠酶活力，篩選出產(chǎn)果膠酶的微生物。

1.2.3 形態(tài)觀察? 將該菌株接種于察氏培養(yǎng)基平板，在28 ℃培養(yǎng)5 d后觀察。用光學顯微鏡采用10倍目鏡和40倍物鏡檢查孢子梗和孢子形態(tài)。

1.2.4 果膠酶活力的測定? 使用3，5-二硝基水楊酸法測定果膠酶活力，試劑配方參考文獻[7]。酶活力的測定體系為350 μL含有0.5%（W/V）聚半乳糖醛酸的0.1 M檸檬酸-Na2HPO4緩沖液+50 μL待測果膠酶，反應30 min后加入800 μL 3，5-二硝基水楊酸試劑，沸水浴顯色5 min后用自來水冷卻，11 000 rpm離心1 min，使殘余的聚半乳糖醛酸沉淀，取上清液選擇540 nm波長比色。以半乳糖醛酸單體為標準物建立標準曲線，1 U酶活力定義為1 min內(nèi)，使底物水解釋放出1 μmol還原性物質(zhì)（以半乳糖醛酸計）所需的酶量。

1.2.5 酶學性質(zhì)的測定? 最適作用條件：（1）最適作用酸堿度為在pH值3.0～6.5范圍內(nèi)測定果膠酶的酶活力。酶活力最高處則為最適作用酸堿度。（2）最適作用溫度為在不同溫度下測定果膠酶的酶活力，酶活力最高處的溫度即為最適作用溫度。

耐受性測試具體如下。（1）酸堿耐受性。將果膠酶置于0.1 M不同酸堿度下，在25 ℃保溫24 h后再測定殘余酶活力，以未受酸堿處理的果膠酶的酶活力作為完整酶活力，受酸堿處理的果膠酶的剩余酶活力折算為百分比。所用緩沖液為檸檬酸-Na2HPO4（pH 3.0～7.0）、Tris-HCl（pH 7.0～9.0）和甘氨酸-NaOH（pH 8.5～12.0）。（2）溫度耐受性。將果膠酶置于不同溫度下保溫15、30、45和60 min后測定殘余酶活力，以未受熱處理的果膠酶的酶活力作為完整酶活力，受熱處理的果膠酶的剩余酶活力折算為百分比。（3）金屬離子對酶活力的影響。將不同濃度的不同金屬離子加入反應體系，測定果膠酶在額外添加金屬離子情況下的酶活力。將沒有額外添加金屬離子時的酶活力作為標準，有額外添加金屬離子時的酶活力作為相對酶活力。

1.2.6 果膠酶在香蕉果汁中的應用效果測定? 將香蕉剝皮，果肉切碎后與2倍于果肉重量的滅菌水混合，用果漿機制漿30 s。在果漿中加入0.25 U/mL果膠酶后混勻，靜置于50 ℃環(huán)境下，保溫1和12 h后所得果漿用于分析。對照組為以等量體積的滅菌水代替果膠酶，亦在50 ℃環(huán)境下保溫1和12 h。保溫后，將果漿在11 000 rpm離心2 min，使未被果膠酶水解的成分沉淀，上清液即為制得的果汁。測量果汁的體積，將果汁的體積除以果漿的體積即為出汁率；測定果漿和果汁中還原性物質(zhì)的量。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物的分離、篩選與鑒定

從土壤樣品中分離得到一株能在以橘子皮粉為唯一碳源的培養(yǎng)基平板上生長的絲狀真菌（編號XYYWZSP4），在將其接種至液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，測定得出其培養(yǎng)液中含有果膠酶（0.78±0.01） U/mL。

該菌株形態(tài)學觀察結(jié)果如圖1所示。由圖1可見，該菌株在察氏培養(yǎng)基平板上生長10 d后菌落為圓形，直徑為3.0 cm（圖1A）。培養(yǎng)10 d后的菌落表面平整，質(zhì)地均勻，較為疏松。菌株產(chǎn)生的黃色色素擴散到平板中，把平板染成黃色。菌落邊緣整齊，無鋸齒、褶皺和隆起等形狀。菌落邊緣為白色，為生長期較短的菌絲體；菌落內(nèi)部為黃色，為生長期較長的菌絲體。通過顯微觀察，菌株的氣生菌絲末端膨大成球形，球面著生分生孢子瓶梗，瓶梗末端產(chǎn)生圓形的分生孢子（圖1B），這是曲霉屬的顯著特征之一[8]。結(jié)合菌株培養(yǎng)形態(tài)和孢子、孢子梗形態(tài)可以鑒定XYYWZSP4為曲霉屬真菌

2.2 果膠酶酶學活力與性質(zhì)的測定

該果膠酶最適作用pH值如圖2所示。當環(huán)境中pH值在3.0時，酶活力僅為（4.92±0.42）%，其pH值在4.5時酶活力最高，并且在pH值4.0和5.0時相對酶活力分別為（92.52±2.72）%和（92.06±1.95）%。結(jié)果顯示該果膠酶可在酸性環(huán)境中發(fā)揮作用。同時，聚半乳糖醛酸酶的催化氨基酸的解離環(huán)境為酸性，而果膠裂合酶則與之相反為堿性，因此可以確定該菌株可產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶。

該果膠酶最適作用溫度如圖3所示。當環(huán)境溫度為30 ℃時，酶活力僅為（14.68±1.48）%。當溫度上升到60 ℃時酶活力達到最高值，因而其最適作用溫度為60 ℃。這說明該果膠酶適宜在中溫環(huán)境下發(fā)揮作用，可用于果汁生產(chǎn)；不適用于需要在室溫乃至低于20 ℃環(huán)境下進行的以果汁為原料的果酒發(fā)酵。

該果膠酶pH值耐受性如圖4所示。該果膠酶在酸性下的pH耐受性較好。在pH值3.0～8.0保溫24 h后（25 ℃下），其剩余酶活力高達90%。對于用途為生產(chǎn)果汁的果膠酶，在酸性環(huán)境下保持酶活力穩(wěn)定是一項非常重要的特性，因為果汁的自然pH值為酸性。該果膠酶的酸穩(wěn)定特性可確保其在果汁生產(chǎn)中穩(wěn)定發(fā)揮作用。

該果膠酶溫度耐受性如圖5所示。該果膠酶在40 ℃環(huán)境下穩(wěn)定性較好，保溫1 h后酶活力無損失。在45 ℃環(huán)境下穩(wěn)定性稍差，保溫1 h后酶活力剩余（82.19±2.02）%。在50 ℃環(huán)境下保溫1 h后酶活力剩余（43.37±3.43）%。這說明該果膠酶可以在不高于40 ℃的環(huán)境下長期發(fā)揮作用，但在40 ℃時不能發(fā)揮全部酶活力（圖3），因此在實際應用中可根據(jù)用酶成本來適當調(diào)整使用溫度。同時，貨架期是酶制劑生產(chǎn)中需要考慮的因素，該果膠酶可以在不高于40 ℃的環(huán)境下保持穩(wěn)定，即其可以室溫保存，無須置于冷庫中保存，有利于節(jié)省成本。

金屬離子對果膠酶活力的影響如表1所示。Na2EDTA不影響該果膠酶的酶活力，表明該果膠酶發(fā)揮酶活力時不需要金屬離子作為輔助。在所有供試金屬離子中，僅5 mM鈣離子抑制該酶活力。1.0、2.5和5.0 mM的Co2+、Fe2+、Fe2+和Mn2+均促進該果膠酶的酶活力，而K+、Li+、Mg2+和Na+在1.0、2.5和5.0 mM時均對酶活力無影響。這說明該果膠酶對多數(shù)受試金屬離子均有較好的相容度。對于果膠酶來說，與金屬離子有好的相容度是非常重要的優(yōu)點，因為水果是植物的一部分，而金屬離子是植物生長的必要元素，存在于植物體內(nèi)。

2.3 果膠酶應用于香蕉果汁脫膠分析

果膠酶應用于香蕉果汁脫膠結(jié)果如圖6所示。對照組經(jīng)過離心后沉淀的表面質(zhì)地疏松，有明顯的膠狀物質(zhì)（圖6A、C），此時的果汁產(chǎn)率為（79.81±2.74）%，還原性物質(zhì)濃度為（9.48±0.21） g/L。加果膠酶處理1 h后離心所得沉淀的表面已經(jīng)沒有疏松物質(zhì)，說明果膠開始被降解（圖6B），此時果汁產(chǎn)率為（82.60±0.64）%，還原性物質(zhì)濃度為（9.78±0.02） g/L。加果膠酶處理12 h后（圖6D）離心所得沉淀的體積非常小，此時果汁產(chǎn)率為（89.85±1.57）%，還原性物質(zhì)的濃度為（11.53±0.09） g/L。這說明該酶可用于果汁的水解，不僅可以實現(xiàn)對果汁的增產(chǎn)，還可以將膠體水解和促進細胞崩解、釋放細胞內(nèi)成分，以增加果汁的營養(yǎng)。

3 結(jié)論與討論

該果膠酶在pH值4.0～5.0范圍內(nèi)發(fā)揮出高于90%的相對酶活力，符合酸堿度處于該區(qū)間內(nèi)的水果果汁制造要求，如梨（pH值4.8）[9]、蘋果（pH值4.0）[10]、芭蕉（pH值4.71）[11]、火龍果（pH值4.56）[11]和芒果（pH值4.52）[11]等。大多數(shù)水果果汁的酸堿度處于pH值4.0～5.0，因此該研究對象果膠酶比一個來自Achaetomium sp. Xz8的果膠酶（最適作用pH值6.0）[12]有更廣闊的應用范圍。該果膠酶在pH值3.0～8.0范圍內(nèi)的穩(wěn)定性較好，可確保該酶能在酸性范圍內(nèi)應用。該果膠酶的最適作用溫度（60 ℃）與一個來自釀酒酵母的果膠酶[13]相同。該果膠酶的熱穩(wěn)定性優(yōu)于一個來自黑曲霉的果膠酶[9]。

研究表明，果膠酶的酶活力廣泛被鈣離子（Ca2+）抑制，例如，1 mM的Ca2+將來自Bispora sp. MEY-1的果膠酶的酶活力抑制至（56.2±1.7）%，5 mM的Ca2+將酶活力抑制至（4.6±2.9）%[10]。此外，一個來自Achaetomium sp. Xz8的果膠酶[12]、鐮刀菌Q7-31T果膠酶[14]、皮落青霉GYS-6果膠酶[15]亦可被Ca2+抑制。相對來說，XYYWZSP4果膠酶具有更好的Ca2+相容性。Cu2+在1.0、2.5和5.0 mM時均不抑制XYYWZSP4果膠酶的酶活力，這明顯優(yōu)于來自Bispora sp. MEY-1的果膠酶［（1 mM的Cu2+將果膠酶的酶活力抑制至（22.2±2.9）%，5 mM時完全抑制）］[9]和來自草酸青霉的果膠酶（1和2 mM的Cu2+分別將果膠酶的酶活力抑制至（25.0±0.9）%和（19.7±4.6%）[11]。K+、Li+、Mg2+和Na+在1.0、2.5和5.0 mM時均對該果膠酶酶活力無影響，亦是優(yōu)良的性質(zhì)，因為金屬離子廣泛存在于植物體內(nèi)，例如，香蕉含有多種金屬離子，因此果膠酶需要優(yōu)良的金屬離子相容性[16]。

獲得果膠酶的目的是將其應用于水果果汁脫膠[17-18]。在測定酶活力時使用的底物聚半乳糖醛酸是經(jīng)過提純所得的，并且測定系統(tǒng)內(nèi)化學成分簡單，因此不能充分表明果膠酶的應用潛力[19-20]。實際上，果汁中的多種因素都有可能影響果膠酶的應用效果，例如，果汁的起始pH值、金屬離子或其他物質(zhì)以及果膠的結(jié)構(gòu)等。目前已有研究將果膠酶應用于香蕉果汁的生產(chǎn)試驗，但暫未報道果膠酶對其還原性物質(zhì)增量的影響，故本研究對香蕉果汁的生產(chǎn)有一定的參考意義[4，11]。

綜上，本研究從土壤中獲得了一株產(chǎn)果膠酶的曲霉菌，并測定了該果膠酶的多項酶學性質(zhì)，最終將該果膠酶應用于香蕉果汁的脫膠中。試驗結(jié)果表明，該果膠酶的加入可以使果汁的產(chǎn)率提升至（89.85±1.57）%，還原性物質(zhì)含量提升至（11.53±0.09） g/L，這表明該果膠酶在果汁生產(chǎn)中有一定的應用前景。

參考文獻

[1] SAKAI T，SAKAMOTO T，HALLAERT J，et al. Pectin，pectinase and protopectinase：production，properties，and applications[J]. Advances in applied microbiology，1993，39：213-294.

[2] RIDLEY B L，ONEILL M A，MOHNEN D. Pectins：structure，biosynthesis，and oligogalacturonide-related signaling[J]. Phytochemistry，2001，57（6）：929-967.

[3] PEDROLLI D B，MONTEIRO A C，GOMES E，et al. Pectin and pectinases：production，characterization and industrial application of microbial pectinolytic enzymes[J]. The open biotechnology journal，2009，3（1）：9-18.

[4] CHENG Z，XIAN L，CHEN D，et al. Development of an innovative process for high-temperature fruit juice extraction using a novel thermophilic endo-polygalacturonase from Penicillium oxalicum[J]. Frontiers in microbiology，2020，11：1200.

[5] LOZANO J E. Fruit manufacturing：scientific basis，engineering properties，and deteriorative reactions of technological importance[M]. New York：Springer，2006.

[6] PARK S I，ZHAO Y Y. Development and characterization of edible films from cranberry pomace extracts[J]. Journal of food science，2006，71（2）：505-518.

[7] MILLER G L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar[J]. Analytical chemistry，1959，31（3）：426-428.

[8] 向玉萍，邱樹毅，曹文濤，等. 醬香型白酒核心產(chǎn)區(qū)大曲中霉菌的分離及鑒定[J]. 食品與發(fā)酵科技，2021，57（2）：56-65.

[9] WANG J J，ZHANG Y H，QIN X，et al. Efficient expression of an acidic endo-polygalacturonase from Aspergillus niger and its application in juice production[J]. Journal of agricultural and food chemistry，2017，65（13）：2730-2736.

[10] YANG J，LUO H Y，LI J，et al. Cloning，expression and characterization of an acidic endo-polygalacturonase from Bispora sp. MEY-1 and its potential application in juice clarification[J]. Process biochemistry，2011，46（1）：272-277.

[11] CHENG Z，CHEN D，WANG Q Y，et al. Identification of an acidic endo-polygalacturonase from Penicillium oxalicum CZ1028 and its broad use in major tropical and subtropical fruit juices production[J]. Journal of bioscience and bioengineering，2017，123（6）：665-672.

[12] TU T，MENG K，BAI Y G，et al. High-yield production of a low-temperature-active polygalacturonase for papaya juice clarification[J]. Food chemistry，2013，141（3）：2974-2981.

[13] HIROSE N，KISHIDA M，KAWASAKI H，et al. Purification and characterization of an endo-polygalacturonase from a mutant of Saccharomyces cerevisiae[J]. Bioscience，biotechnology，and biochemistry，1999，63（6）：1100-1103.

[14] 秦日甜，謝占玲. 鐮刀菌Q7-31T果膠酶PGL1的分離純化、酶學性質(zhì)鑒定及結(jié)構(gòu)分析[J]. 生物技術(shù)通報，2018，34（4）：151-160.

[15] 郭莉，談安群，譚祥，等. 皮落青霉產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶酶學性質(zhì)及其應用研究[J]. 西南大學學報（自然科學版），2021，43（11）：1-8.

[16] KYAMUHANGIRE W，MYHRE H，S?RENSEN H T，et al. Yield，characteristics and composition of banana juice extracted by the enzymatic and mechanical methods[J]. Journal of the science of food and agriculture，2002，82（4）：478-482.

[17] MARTINS E D，LEITE R S R，DA SILVA R，et al. Purification and properties of polygalacturonase produced by thermophilic fungus Thermoascus aurantiacus CBMAI-756 on solid-state fermentation[J]. Enzyme research，2013，2013：438645.

[18] ZHOU H X，LI X，GUO M Y，et al. Secretory expression and characterization of an acidic endo-polygalacturonase gene from Aspergillus niger SC323 in Saccharomyces cerevisiae[J]. Journal of microbiology and biotechnology，2015，25（7）：999-1006.

[19] PENG X B，CHEN G J，HAN Z G，et al. High-level secretive expression of a novel achieved Talaromyces cellulolyticus endo-polygalacturonase in Pichia pastoris by improving gene dosage for hydrolysis of natural pectin[J]. World journal of microbiology & biotechnology，2019，35（6）：84.

[20] IBRAHIM E，JONES K D，TAYLOR K E，et al. Molecular and biochemical characterization of recombinant cel12B，cel8C，and peh28 overexpressed in Escherichia coli and their potential in biofuel production[J]. Biotechnology for biofuels，2017，10：52.

（責編：楊 歡）

基金項目 廣西高校中青年教師科研基礎(chǔ)能力提升項目（2022KY0674）。

作者簡介 冼瑩瑩（1987—），女，廣西梧州人，碩士，從事功能性食品及用酶開發(fā)研究。

收稿日期 2024-01-10