ESBLs陽性肺炎克雷伯菌的研究進展

丁嘉雯 李娜

濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，濱州 256600

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KPN）是目前臨床上重要的條件致病菌之一［1］。它在自然界中廣泛存在，不僅可以在水和土壤中單獨存在，還可以與植物、昆蟲或各種哺乳動物等以共生生物或潛在病原體的形式共同存在，引起人類廣泛感染。20世紀80年代，一名德國醫(yī)生首次發(fā)現(xiàn)了超廣譜β-內酰胺酶（extended-spectrum β-lactamases，ESBLs）基因；他在1例ICU患者身上分離出了具有超廣譜活性的β-內酰胺酶基因SHV-2［2］。研究者分析發(fā)現(xiàn)，SHV-2是SHV-1在氨基酸序列的238位點由甘氨酸序列突變成了絲氨酸序列，發(fā)生了點突變。近年來，隨著廣譜抗菌藥物的大量應用，導致KPN引起的耐藥性及醫(yī)院感染的比例明顯上升。因為產(chǎn)ESBLs KPN經(jīng)常攜帶不止一種耐藥基因，所以引起的細菌感染往往表現(xiàn)為更強的耐藥性。因此，對KPN的深入研究具有重要意義［3］。

ESBLs陽性KPN的耐藥基因分析

1.檢測β-內酰胺類［TEM、SHV、OXA、CTX-M］、喹諾酮類［aac（6’）-Ib-cr］的耐藥基因

KPN最常見的耐藥機制是產(chǎn)ESBLs，可水解青霉素及頭孢菌素類抗生素，造成多藥耐藥，而ESBLs是β-內酰胺酶中重要的一類，它主要是質粒介導的衍生物，通過改變活性位點構型的突變而產(chǎn)生，從而擴大酶的水解譜［4］。目前，發(fā)現(xiàn)的ESBLs依據(jù)其結構和功能主要包括TEM、SHV、鄰氯青霉素水解酶（OXA）、CTX-M和其他一些少見類別［5］。根據(jù)CTX-M型ESBLs氨基酸殘基序列相似性，將其大致分為4類：CTX-M-1型（CTX-M-1、CTX-M-3、CTX-M-15及CTX-M-55等）、CTX-M-2型（CTX-M-2、CTX-M-4、CTX-M-5、CTX-M-6等）、CTX-M-9型（CTX-M-9、CTX-M-13、CTX-M-14、CTX-M-27等）及CTX-M-8/CTX-M-25組［6］。此外，ESBLs的流行類型在不同的國家和地區(qū)也不盡相同，這是抗菌藥物的使用觀念和使用策略不同以及細菌對于不同抗菌藥物的自身選擇壓力不同導致的［7］。有研究顯示，北美及西歐地區(qū)主要以TEM型和SHV型為主，南美地區(qū)和東歐地區(qū)則以CTX-M型為主［8］。而在我國，CTX-M型是主要的耐藥基因，同時還兼有SHV型和TEM型的存在。

CTX-M是我國最常見的ESBLs耐藥基因。有研究表明，染色體DNA上β-內酰胺類CTX-M-9耐藥基因在ESBLs（+）的KPN中陽性率為70%，但在ESBLs（-）KPN中的檢出率為0。其次，喹諾酮類aac（6’）-Ib-cr耐藥基因在ESBLs（+）KPN中的檢出率也明顯高于ESBLs（-）的KPN菌株，其陽性率為40%［9］。因此，KPN染色體DNA所攜帶的β-內酰胺類CTX-M-9基因和喹諾酮類aac（6’）-Ib-cr等多種耐藥基因均與產(chǎn)ESBLs的垂直遺傳傳播有關。

同時，由于抗生素的濫用導致細菌對于抗菌藥物產(chǎn)生耐藥，使得越來越多的產(chǎn)ESBLsKPN攜帶多種耐藥基因，這讓我們對其耐藥基因的研究變得更加復雜也更加困難。

2.整合子

整合子是近年來新發(fā)現(xiàn)的可移動基因元件，是一種潛在的移動端遺傳元件，能夠捕獲和傳遞特定的外源基因盒［10］。其本身無法移動，通常位于質粒、轉座子和致病島嶼上，捕獲并整合耐藥基因從而形成巨大的多基因座，并隨著細菌的不斷復制進行傳播，促進它們在不同細菌之間轉移［11］。根據(jù)整合酶基因的核苷酸序列不同，現(xiàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了5類整合子［12］，其中對I、Ⅱ、Ⅲ類整合子研究較多，且明確與耐藥性有關。在革蘭陰性菌株中，I類整合子更為常見，且有較高的耐藥基因攜帶率，是KPN最常見的整合子類型。研究表明，ESBLs（+）KPN中，整合子的攜帶率較ESBLs（-）KPN高［13］，且其含有的ESBLs基因型別越多，該菌攜帶I類整合子的可能性也越大［14］。I類整合子已被鑒定為耐藥基因的主要來源，并被懷疑是多種革蘭陰性菌耐藥基因的宿主和交換平臺，因此了解KPN I類整合子的流行病學和分子特征對實施干預策略至關重要［15］。

多位點序列分型

首先參照多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）數(shù)據(jù)庫確定MLST的7個管家基因（gapA、rpoB、mdh、pgi、phoE、infB、tonB）［16］。采用水煮法粗提DNA，將得到的聚合酶鏈式反應（PCR）模板進行擴增。PCR擴增在50 ℃的退火溫度下進行，除了gapA（60 ℃）和tonB（45 ℃）以外。純化的PCR產(chǎn)物用焦磷酸測序法進行測序［17］，并使用SnapGene對序列進行校對，用在線工具（https：//bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/）分配等位基因編號和序列類型。根據(jù)pubMLST得到的ST結果，將pubMLST數(shù)據(jù)庫中相應ST類型的等位基因按相同順序串聯(lián)，得到不同ST類型的串聯(lián)序列［18］。MLST的結果可以通過聚類技術進行分析，使用最嚴格定義的eBURST V3（http：//eburst.mlst.net）分析［19］；基于ST型，可以把不同菌株歸于不同克隆群中，高遺產(chǎn)相似性的分離株歸為一個克隆群［20］。

同源性分析

分子分型在流行病學研究中起著重要作用，可以確定分離株和感染源之間的遺傳相似性，這種方法也可以用于監(jiān)測醫(yī)院病原體的傳播和遺傳多樣性。KPN的同源性分析的方法有多種，如脈沖場凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）［21］和質譜儀（MALDI-TOF MS）［22］。

1.PFGE

PFGE使用脈沖場電泳室分離限制性DNA條帶，然后根據(jù)PFGE條帶模式對細菌進行克隆分配。其結果具有極高的分辨率和再現(xiàn)性，因此被認為是流行病學研究的分子金標準［23］。它可以根據(jù)基因組指紋圖譜的變化來區(qū)分臨床和環(huán)境分離株，對親緣相近菌株進行細致區(qū)分。PFGE分型用于感染控制，追蹤醫(yī)院內病原體的傳播。比較從患者、醫(yī)護人員和病房環(huán)境中分離的細菌PFGE條帶，有助于感染控制團隊確定感染源和傳播途徑［24］。

將篩選出的ESBLs陽性KPN菌株進行裂解、洗膠、酶切、上樣，通過電泳獲得圖像，利用BioNumerics軟件進行同源性分析［25］。用該軟件分析宏觀限制性片段模式，采用算術平均的非加權對組方法進行樹狀圖分析。當菌株的宏觀限制模式的3個條帶的差異最大時（即相似性水平約為80%），菌株可被聚為群。采用皮爾遜雙側卡方檢驗，如果任何單元格中的期望計數(shù)低于要求，則使用Fisher精確檢驗來比較這些數(shù)據(jù)［26］。

2.MALDI-TOF MS

近10年來，MALDI-TOF MS作為一種快速、可靠的微生物鑒定方法得到了廣泛的應用［27］。它的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在通量高、時效高、誤差小、性價比高等［28］，已被納入許多臨床微生物實驗室的工作流程，在流行病學領域有較好的應用前景。這種方法的實施使實驗室能夠在以前無法想象的時間尺度上為臨床醫(yī)生提供最終的生物鑒定。MALDI-TOF MS主要檢測的蛋白是核糖體蛋白，分析檢測蛋白質指紋圖譜，但也能檢測到其他高度豐富的胞質蛋白（如DNA結合蛋白和冷休克蛋白）。然后使用軟件將未知生物的光譜剖面與參考數(shù)據(jù)庫進行比較，通過分析病原菌菌株間蛋白豐度的細小差異，自動確定被測試生物的身份［29］。

MALDI-TOF MS檢測結果與MLST檢測結果具有良好的相關性，可建立各醫(yī)院流通的產(chǎn)ESBLs KPN克隆體的數(shù)據(jù)庫，有利于疫情的快速識別［30］。但是，MALDI-TOF MS仍然存在許多挑戰(zhàn)，包括參考譜的主要局限性。微生物的質譜鑒定依賴于鑒定每個物種的特征譜，并與MALDI-TOF MS中的大型數(shù)據(jù)庫（也稱為參考譜）進行比較。

綜上所述，ESBLs陽性KPN由于其強大且復雜的耐藥機制，給臨床抗菌治療帶來了很大的困難，其暴發(fā)也對不同地區(qū)乃至國家的醫(yī)療衛(wèi)生安全帶來極大威脅。因此，明確其具體的耐藥機制、分子分型及同源性，有助于科學制定抗感染治療方案，對防止或減慢耐藥基因、耐藥菌株的產(chǎn)生、播散和流行具有重要意義［31］。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明丁嘉雯：試驗實施與研究，數(shù)據(jù)采集與分析，文章撰寫；李娜：設計并指導試驗，數(shù)據(jù)分析，對文章的知識性內容作批評性審閱