滋腎通關(guān)方對糖尿病大鼠腎損傷的改善作用及其機制

梁國強 蔣春波 王健生

(1 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院,蘇州,215009; 2 蘇州市吳江區(qū)中醫(yī)醫(yī)院〔蘇州市吳江區(qū)第二人民醫(yī)院〕,蘇州,215220)

糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy,DN)是一種以持續(xù)性蛋白尿和腎功能逐漸下降為特征的臨床綜合征,是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一,目前影響了40%以上的糖尿病患者,是全球終末期腎病的主要病因之一。DN的發(fā)病機制涉及血流動力學(xué)和代謝因素,如慢性高血糖、高胰島素血癥、胰島素抵抗和高脂血癥導(dǎo)致代謝失衡與DN的發(fā)生密切相關(guān),病理學(xué)認為腎纖維化是DN進行性加重的重要因素,因此早期預(yù)防治療是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)面臨的重要科學(xué)問題和挑戰(zhàn)[1]。

滋腎通關(guān)方記載于金元醫(yī)學(xué)著作《蘭室秘藏》(李東垣),由黃柏、知母、肉桂組成。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)該方能有效改善老年糖尿病前期患者餐后2小時血糖以及血清胰島素和脂聯(lián)素水平,調(diào)節(jié)血脂等[2];實驗研究證實其抑制腎盂腎炎大鼠腎臟Toll樣受體和核因子κB的表達,降低炎癥介質(zhì)白細胞介素-4(Interleukin-4,IL-4),IL-6和IL-10的水平[3]。提示滋腎通關(guān)方具有改善血糖、抗炎癥反應(yīng)以及抑制腎損傷的潛在作用。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)/Smads通路在腎纖維化發(fā)展進程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,其可通過轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴增炎癥和纖維化信號促進腎病的進展[4]。本實驗通過制備糖尿病大鼠早期腎損傷模型,在觀察不同劑量滋腎通關(guān)方對其腎組織病理改變、血清生化指標及炎癥介質(zhì)水平的變化基礎(chǔ)上,觀察其對TGF-β1/Smads通路蛋白表達的影響,確定滋腎通關(guān)方對糖尿病大鼠腎損傷的調(diào)節(jié)作用及其可能的通路,為中醫(yī)藥防治DN提供科學(xué)依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 50只雄性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠,8周齡,體質(zhì)量180～220 g,購于昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司,許可證號:SCXK(蘇)2018-0006。飼養(yǎng)溫度21～24 ℃,濕度55%～65%,在12 h自然光照交替的屏障系統(tǒng)內(nèi)。動物研究是按照南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院機構(gòu)動物護理和使用委員會批準的方案進行(倫理審批號:2021倫動批062)。

1.1.2 藥物 滋腎通關(guān)方(黃柏30 g、知母30 g、肉桂2 g)中藥飲片均由本院藥學(xué)部提供(購于蘇州市春暉堂飲片廠,批號:210314、210104、210427)。參考前期基礎(chǔ)設(shè)低劑量(7.0 g生藥/kg大鼠),按2倍比例擴大設(shè)中劑量、高劑量(14.0 g、28.0 g生藥/kg大鼠)[5]。由本院中心實驗室專業(yè)人員制取低、中和高濃度滋腎通關(guān)方水煎液0.7 g生藥/L、1.4 g生藥/mL和2.8 g生藥/mL備用。戊巴比妥鈉(Sigma公司,美國,貨號:57-33-0)。

1.1.3 試劑與儀器 血糖檢測儀(強生醫(yī)療器材有限公司,型號:ONE TOUCH UltraEasy)及試紙(批號:4795582),尿蛋白定量(CBB法)試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號:C035-2-1);大鼠腫瘤壞死因子α(Tumor Necrosis Factor-alpha,TNF-α)、IL-6、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司,貨號:BYE20040、BYE20064、BYE20024);蘇木精-伊紅(Hematoxylin and Eosin,HE)染色試劑盒和BCA蛋白檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號:C0105M和P0012S);TGF-β1抗體、Smad3抗體、Smad7抗體、α-平滑肌肌動蛋白(Alpha-smooth Muscle Actin,α-SMA)抗體、波形蛋白(Vimentin)抗體和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase,GAPDH)抗體(Abcam,英國,貨號:ab215715、ab208182、ab272928、ab7817、ab92547、ab9485);全自動生化分析儀(日立,日本,型號:7600),低溫冷凍離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司,型號:TG-16M);酶標儀(雷勃,芬蘭,型號:MK3);顯微鏡(Olympus,日本,型號:CX23)等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 50只SD大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,將其隨機分為5組(每組10只):對照組、模型組和滋腎通關(guān)方低劑量、中劑量、高劑量(ZSTGF-L、ZSTGF-M、ZSTGF-H)組。模型組和ZSTGF-L、ZSTGF-M、ZSTGF-H組采用在高脂高糖飲食4周后,腹腔一次性注射STZ溶液,注射體積10 mL/kg,注射劑量35 mg/kg。參考文獻模型制備72 h后尾靜脈取血測定血糖(血糖試紙測定),當(dāng)空腹血糖(Fasting Blood Glucose,FBG)>13.9 mmol/L或隨機血糖>16.7 mmol/L,即為糖尿病大鼠模型制備成功,7 d后檢測24 h尿蛋白定量(CCB法),當(dāng)濃度>20 mg/24 h,即為糖尿病腎損傷模型大鼠構(gòu)建成功[6]。經(jīng)檢測各造模大鼠均符合要求。

1.2.2 干預(yù)方法 模型制備成功后,ZSTGF-L、ZSTGF-M和ZSTGF-H組大鼠每天分別灌胃滋腎通關(guān)方水煎液7.0 g生藥/kg、14.0 g生藥/kg和28.0 g生藥/kg,對照組和模型組的大鼠灌胃等量生理鹽水。每天灌胃1次,連續(xù)4周,每周檢測各組FBG 1次。末次給藥后停止食物供給,于24 h后以戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉取血,放入10 mL離心管中,靜置2 h后分離血清后備用。然后立即安樂處死大鼠,取左腎組織用于4%多聚甲醛溶液固定,右腎組織置液氮速凍,于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 檢測指標與方法 HE染色檢測腎組織病理改變,將收集的腎組織用4%多聚甲醛固定,然后用梯度乙醇脫水,用二甲苯去除梯度乙醇,最后用石蠟包埋切片(尺寸:50 μm)、染色,在生物光鏡下觀察腎臟組織損傷和形態(tài)紊亂病變。采用全自動生化分析儀測定大鼠血清腎功能指標血尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN)、肌酐(Creatinine,Cr)、總膽固醇(Total Cholesterol,TC)、三酰甘油(Triacylglycerol,TG)水平;同步采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定血清腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)和白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)。蛋白質(zhì)印跡法檢測腎組織相關(guān)蛋白表達水平,將腎組織放入蛋白酶抑制劑PMSF的裂解緩沖液中裂解,4 ℃,13 000 r/min離心15 min,離心半徑10 cm。然后用BCA蛋白檢測試劑盒測定上清液中的蛋白濃度。蛋白裂解液與樣品蛋白分離緩沖液混合,95 ℃變性5 min,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)分離20 μg蛋白,轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜上。用5%脫脂牛奶在室溫下封膜2 h,然后用特異性一抗在4 ℃下孵育過夜。最后,將膜和相應(yīng)的二抗在室溫下孵育2 h,增強化學(xué)發(fā)光、曝光顯影后,利用ImageJ軟件對蛋白條帶的灰度值進行分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠FBG的比較 與對照組比較,模型組FBG水平明顯升高(P<0.05),4次(1次/周)檢測到FBG水平均高于16.7 mmol/L,均值達到23.0 mmol/L。滋腎通關(guān)方不同劑量干預(yù)后,大鼠FBG水平均有不同程度下降。在第4周時,ZSTGF-L、M和H組FBG濃度均值分別為19.0 mmol/L、18.0 mmol/L和15.0 mmol/L,與模型組比較,滋腎通關(guān)方各組大鼠FBG水平明顯降低(均P<0.05)。見圖1。

圖1 滋腎通關(guān)方(ZSTGF)對糖尿病腎損傷大鼠FBG水平的影響

2.2 病理學(xué)觀察腎組織病理變化 對照組大鼠的腎組織HE染色未見病理改變,而模型組大鼠腎組織損傷明顯,表現(xiàn)為腎小管上皮細胞脫離水腫,腎小球系膜細胞增殖,腎小球基底膜擴張,腎小管擴張萎縮,局灶性炎癥細胞浸潤和纖維增生,糖原豐富。滋腎通關(guān)方治療可減輕上述損傷,其中滋腎通關(guān)方中劑量、高劑量組對DN大鼠的腎組織保護作用顯著。滋腎通關(guān)方可改善DN大鼠的腎損傷,且隨著劑量的增加,作用更為顯著。見圖2。

圖2 滋腎通關(guān)方(ZSTGF)對糖尿病腎損傷大鼠腎組織病理學(xué)改變的影響(HE染色,×400)

2.3 對糖尿病大鼠腎功能損傷的影響 與對照組比較,模型組BUN、Cr、TC和TG水平均顯著升高(均P<0.05)。與模型組比較,滋腎通關(guān)方低劑量、中劑量、高劑量組大鼠血清的BUN、Cr、TC、TG水平均顯著降低(P<0.05),且隨劑量增加下降更顯著。提示滋腎通關(guān)方可明顯改善糖尿病大鼠腎功能損害。見圖3。

圖3 滋腎通關(guān)方(ZSTGF)對糖尿病腎損傷大鼠腎功能的影響

2.4 各組大鼠血清炎癥介質(zhì)水平比較 與對照組比較,模型組的大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均顯著升高(均P<0.05)。與模型組比較,滋腎通關(guān)方低劑量、中劑量、高劑量組的大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均顯著降低(均P<0.05),且隨其劑量的增加下降更明顯。見圖4。

圖4 滋腎通關(guān)方(ZSTGF)對糖尿病腎損傷大鼠血清炎癥介質(zhì)水平的影響

2.5 各組腎臟TGF-β1/Smads信號通路蛋白表達比較 與對照組比較,模型組TGF-β1、Smad3、α-SMA、波形蛋白表達水平顯著升高,Smad7蛋白表達水平顯著降低(均P<0.05)。滋腎通關(guān)方低劑量組與模型組比較,蛋白表達水平TGF-β1和α-SMA具有下調(diào)趨勢且Smad3和波形蛋白顯著下調(diào)(均P<0.05),而Smad7顯著升高(P<0.05)。滋腎通關(guān)方中劑量、高劑量組與模型組比較,TGF-β1、Smad3、α-SMA、波形蛋白表達水平顯著下調(diào)(均P<0.05),Smad7蛋白表達水平顯著上調(diào)(P<0.05),且呈一定的濃度依賴性。見圖5。

圖5 滋腎通關(guān)方(ZSTGF)對糖尿病腎損傷大鼠腎臟TGF-β1/Smads通路表達的影響

3 討論

中醫(yī)藥在防治腎纖維化方面積累了豐富的經(jīng)驗,腎纖維化信號通路研究也成為篩選和研究中藥作用機制和靶點手段[7]。中醫(yī)藥對DN防治的療效確切,研究表明,中醫(yī)藥能干預(yù)糖尿病腎損傷的炎癥反應(yīng)[8],通過抑制腎小管上皮細胞的焦亡、間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等多種作用機制發(fā)揮治療作用[9]。

基于“滋陰清熱”立論的滋腎通關(guān)方以黃柏、知母等量配伍,少佐肉桂。黃柏清熱燥濕,瀉火除蒸為君,知母清熱瀉火,滋陰潤燥為臣,二者相須為用,有補水瀉火、滋陰清熱之功,主治陰虛內(nèi)熱、骨蒸盜汗,是典型的治療消渴的藥對;肉桂補火助陽,引火歸元,散寒止痛,溫通經(jīng)脈為佐藥,既能溫補腎陽、行氣利水,又有緩和知母黃柏甘寒苦寒之效,三者共奏“滋補陰液、清利內(nèi)熱”標本兼治之功效,又無甘寒苦寒傷脾胃之弊。臨床上近代名醫(yī)施今墨以藥對形式將其應(yīng)用于糖尿病之“下消”,證見小便混濁、如膏如脂者[10],臨床觀察發(fā)現(xiàn)以該方為主聯(lián)合西藥口服顯著降低早期DN患者24 h尿蛋白定量、尿微量白蛋白,并提高血漿白蛋白水平,總有效率明顯優(yōu)于單用西藥患者[11];另外在減輕腎損傷、縮短術(shù)后臨床癥狀和提高療效等方面取得了較為滿意的療效[12]。

當(dāng)前循證醫(yī)學(xué)研究已經(jīng)證實了降糖藥物通過調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂對糖尿病腎臟的保護作用,但是長期預(yù)后及安全性尚待進一步考察,藥物不良反應(yīng)也有所報道[13]。本研究采用高脂高糖飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)糖尿病早期腎損傷大鼠模型,與對照組比較,FBG水平和BUN、Cr、TC、TG水平均顯著升高,且出現(xiàn)腎病理學(xué)損傷情況。通過滋腎通關(guān)方治療4周后,發(fā)現(xiàn)糖尿病腎損傷大鼠FBG水平和BUN、Cr、TC、TG水平均明顯降低,腎病理學(xué)損傷得到有效改善且隨著劑量的增加效果更加顯著。表明滋腎通關(guān)方對脂高糖飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟損傷有潛在的治療作用。

炎癥是DN發(fā)病的主要因素。在糖尿病情況下,巨噬細胞等炎癥細胞浸潤腎臟,并創(chuàng)造一種炎癥環(huán)境,幾乎對所有的腎細胞產(chǎn)生有害影響,導(dǎo)致細胞外基質(zhì)沉積、間質(zhì)纖維化和細胞功能障礙,最終導(dǎo)致蛋白尿,不同的炎癥成分,包括脂肪因子、Toll樣受體、趨化因子、黏附分子和炎癥介質(zhì),可能是DN等并發(fā)癥發(fā)生的關(guān)鍵因素[14]。研究表明,腎病患者藥物治療后血清炎癥標志物TNF-α、IL-6、IL-18水平顯著降低,抗炎細胞因子IL-10水平顯著升高[15]。近年來中醫(yī)藥醫(yī)家針對DN的炎癥反應(yīng)探討其病機特點,認為熱邪與DN早期炎癥反應(yīng)密切相關(guān),如腎小球血流量大、流速快、濾過功能亢進與中醫(yī)“陽熱亢進、熱迫血行”表現(xiàn)相符合[16];結(jié)合微觀辨證理論分析DN早期為腎絡(luò)癥瘕形成的早期,熱入腎絡(luò),邪正相爭于腎之脈絡(luò),熱傷氣陰,腎絡(luò)受損,炎癥通路和炎癥介質(zhì)被激活[17]?？梢婈幪摓槠洳≈?內(nèi)熱為其病之標,本虛標實。傳統(tǒng)中醫(yī)常以“滋陰清熱”立法,滋陰扶正,清熱祛邪,以求標本兼治。滋腎通關(guān)方原方主治“不渴而小便閉,熱在下焦血分”,方中黃柏色黃味苦,入腎經(jīng)血分,瀉下焦火;知母性寒,滋腎水以瀉熱;肉桂辛熱,色赤入血,用以反佐,取中醫(yī)“寒因熱用”與“甘苦合化”之意,其主證與糖尿病腎損傷早期炎癥反應(yīng)的中醫(yī)病機相符。本研究發(fā)現(xiàn)與對照組比較,模型組的大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平均顯著升高,而滋腎通關(guān)方明顯降低了糖尿病大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥指標的水平,且隨劑量的增加下降更明顯。提示滋腎通關(guān)方治療可能通過改善腎臟炎癥環(huán)境而對腎臟起到保護作用。

TGF-β是一種多功能細胞因子,具有多種生理功能,TGF-β被認為是參與血管系統(tǒng)和腎臟纖維化疾病的關(guān)鍵纖維化細胞因子之一,其可通過轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴增炎癥和纖維化信號促進腎病的進展[18]。TGF-β1/Smads信號通路被認為是腎纖維化發(fā)展的關(guān)鍵途徑,TGF-β1與TGF-β Ⅱ型受體結(jié)合激活TGF-β Ⅰ型受體,導(dǎo)致Smad2和Smad3磷酸化,激活的Smad2和Smad3與Smad4形成復(fù)合物,從細胞質(zhì)移動到細胞核,并在纖維化基因表達中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用[19]。Smad3在纖維形成過程中高度激活,抑制性Smad7的表達顯著下調(diào)。Smad3和Smad7之間平衡的改變導(dǎo)致肌成纖維細胞的積累和激活、細胞外基質(zhì)的過度產(chǎn)生以及細胞外基質(zhì)降解的減少。有研究認為,同時下調(diào)Smad3和上調(diào)Smad7表達有助于腎病模型中腎纖維化的治療[20]。本研究中,與對照組比較,模型組大鼠的腎臟中TGF-β1和Smad3過表達,而Smad7的表達明顯降低,提示了糖尿病大鼠腎臟可能發(fā)生纖維化。經(jīng)過滋腎通關(guān)方治療4周后,糖尿病大鼠腎臟TGF-β1/Smad信號明顯減弱,提示滋腎通關(guān)方可能通過介導(dǎo)TGF-β/Smad信號,抑制了腎臟纖維化進程。另外肌成纖維細胞是引起膠原過度沉積、促進腎纖維化的主要細胞類型,α-SMA是肌成纖維細胞的標志,波形蛋白是肌成纖維細胞的標志成纖維細胞和平滑肌細胞骨架形成的基礎(chǔ)。研究表明,抑制波形蛋白的表達有助于減少與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的腎纖維化的發(fā)展[21]。我們進一步檢測了α-SMA和波形蛋白的表達,發(fā)現(xiàn)滋腎通關(guān)方明顯降低了糖尿病大鼠腎臟中α-SMA和波形蛋白的過表達水平,進一步證明滋腎通關(guān)方可能抑制糖尿病大鼠腎臟纖維化的進展。

綜上所述,滋腎通關(guān)方可明顯減輕糖尿病大鼠腎臟損傷,改善腎功能,且呈濃度依賴性,其機制可能與滋腎通關(guān)方通過抑制TGF-β1/Smad信號通路降低炎癥反應(yīng)有關(guān),從而阻止糖尿病大鼠腎纖維化進程,最終改善腎功能損害。

利益沖突聲明:無。