EDC/NHS交聯(lián)重組膠原蛋白水凝膠修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損

黃長(zhǎng)瑾，雷 桓，唐曉軍

(1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 整形外科醫(yī)院，北京 100144)

(2. 西北大學(xué)化工學(xué)院，陜西 西安 710069)

(3. 西北大學(xué) 生物醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710069)

1 前 言

關(guān)節(jié)軟骨是一種無(wú)血管、無(wú)淋巴和無(wú)網(wǎng)膜的分層結(jié)締組織，由膠原蛋白和蛋白多糖組成。隨著人年齡增長(zhǎng)，這種極易退化的組織更容易磨損[1-2]。關(guān)節(jié)軟骨損傷、缺損已成為骨科常見(jiàn)疾病。關(guān)節(jié)軟骨缺損會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重疼痛、活動(dòng)受限，甚至造成全關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)或永久性關(guān)節(jié)殘疾。此外，由于軟骨的無(wú)血管結(jié)構(gòu)，其自我再生能力有限。因此，關(guān)節(jié)軟骨再生仍是再生醫(yī)學(xué)中一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的問(wèn)題[3]。

膠原蛋白在關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[4，5]。目前，已有報(bào)道稱，多種動(dòng)物源膠原蛋白可用于構(gòu)建軟骨修復(fù)的組織工程支架或水凝膠[6，7]。在關(guān)節(jié)軟骨中，I型膠原和III型膠原均能促進(jìn)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)[8，9]。然而，動(dòng)物源膠原蛋白具有低機(jī)械強(qiáng)度、免疫原性風(fēng)險(xiǎn)、易產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)和病毒隱患等缺點(diǎn)[10，11]。

近年來(lái)，重組膠原蛋白因具有良好的水溶性、非免疫原性和優(yōu)異的生物學(xué)特性，在傷口敷料和止血海綿等生物材料領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，但其力學(xué)性能較弱且降解速率較快[12]。用于骨修復(fù)的生物材料的機(jī)械性能直接影響材料在骨和關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)過(guò)程中的穩(wěn)定性和支撐性，而降解率影響材料體內(nèi)修復(fù)的可持續(xù)性和有效性[13-16]。研究表明，可通過(guò)交聯(lián)增強(qiáng)重組膠原蛋白的機(jī)械性能及降低其降解速率[17]。由于重組膠原蛋白的分子特性，高溫和輻射強(qiáng)度往往會(huì)使蛋白質(zhì)失活或降解[18]。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)/N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)試劑也通常用于蛋白質(zhì)交聯(lián)，該方法交聯(lián)效果穩(wěn)定，EDC和NHS不與凝膠產(chǎn)生連接，細(xì)胞毒性小[19]。

因此，在本研究中，通過(guò)EDC/NHS試劑交聯(lián)不同類型重組膠原蛋白制備水凝膠，并比較2種水凝膠對(duì)軟骨缺損的修復(fù)效果，為后期應(yīng)用于軟骨修復(fù)領(lǐng)域提供依據(jù)。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 主要儀器與試劑

所用儀器包括：KZ-II型高速組織研磨儀(武漢Servicebio)；D3024R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(北京大龍興創(chuàng))；掃描電子顯微鏡(Zeiss Ultra 55，德國(guó)卡爾蔡司公司)；通用材料壓縮機(jī)(WDW3020，Interstrom Inc.)；Sorvall ST8型臺(tái)式離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)。

所用材料包括：純化的重組I型人源化膠原蛋白([HPLC]≥99%，Mr=97 kDa)和重組III型人源化膠原蛋白([HPLC]≥99%，Mr=130 kDa)(由陜西省生物材料與發(fā)酵工程技術(shù)研究中心提供)；EDC/NHS試劑(上海阿拉丁生物技術(shù)有限公司)；CCK-8試劑盒(南京建成生物公司)；TRIzol試劑(賽默飛世爾科技公司)；人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone-marrow mesenchymal stem cells，HBMSCs)(武漢普諾賽生命科技有限公司)；HBMSCs成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(武漢普諾賽生命科技有限公司)。

2.2 重組膠原蛋白水凝膠的制備

在37 ℃和300 r·min-1攪拌條件下，將定量的EDC緩慢溶解在300 mmol·L-1的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)中，使得EDC最終濃度為1.0 g·mL-1。將溶液的pH值調(diào)節(jié)至4.7后，繼續(xù)攪拌，將凍干后的重組膠原蛋白固體加入到溶液中并充分混合。EDC可作為重組膠原蛋白鏈上的羧基活化劑。在相同的條件下，將NHS試劑加入到上述完全混合的溶液中，其中n(EDC)∶n(NHS)=4∶1，并在300 r·min-1下攪拌6 h，得到凝膠狀固體[20]。進(jìn)行冷凍干燥后，粉碎成直徑為0.2～1 mm的顆粒，置于50～1200倍體積的PBS清洗5次，每次60 min，以去除凝膠中的殘留EDC/NHS試劑。將洗好的顆粒溶脹于PBS中，分別得到重組I型膠原蛋白水凝膠(Gel-Ⅰ)和重組Ⅲ型膠原蛋白水凝膠(Gel-Ⅲ)，重組膠原蛋白含量均為20 mg·mL-1，進(jìn)而灌裝于注射器中。

2.3 重組膠原蛋白水凝膠的表征

2.3.1 結(jié)構(gòu)表征

為了觀察水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)，使用液氮將重組膠原蛋白水凝膠冷凍干燥后，涂覆7 nm厚的金層，放置于掃描電子顯微鏡下觀察。

2.3.2 力學(xué)性能測(cè)試

使用通用材料壓縮機(jī)測(cè)試重組膠原蛋白水凝膠的壓縮強(qiáng)度及推擠力[21]。

壓縮強(qiáng)度：將水凝膠切割成高度為10 mm、直徑為10 mm的圓柱，以1 mm·min-1的速度施加200 g的負(fù)荷研究其壓縮應(yīng)力，每組至少測(cè)試3次。

推擠力：將填充有重組膠原蛋白水凝膠的注射器安裝于通用材料壓縮機(jī)，設(shè)置推擠速度為30 mm·min-1，檢測(cè)并記錄推擠力曲線。

2.3.3 降解性能測(cè)試

用pH值為7.4的PBS溶液配制濃度為50%的I型膠原酶溶液，過(guò)濾除菌后放于4 ℃?zhèn)溆?。先?duì)干燥后的水凝膠材料稱重(W0)，然后用60 Co射線照射。在無(wú)菌條件下，將所有樣品置于相同體積的酶溶液中，用封口膜封住瓶口。放于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中，分別在1，2，3，4，5和6周取樣，用超純水沖洗酶解后的樣品3次，然后用真空冷凍干燥機(jī)干燥后稱重(W1)。根據(jù)公式WL=(W0-W1)/W0×100%計(jì)算水凝膠的降解率(WL)。

2.3.4 溶脹性能測(cè)試

記錄冷凍干燥后的重組膠原蛋白水凝膠初始質(zhì)量，記錄為Wi。隨后，在37 ℃下，將其置于PBS中(pH=7.4)，在固定的時(shí)間點(diǎn)(5，10，30，60，90，120，180 min)取出，稱重并記錄為Wt，直至質(zhì)量沒(méi)有變化。溶脹度SR按式(1)計(jì)算：

(1)

交聯(lián)度按式(2)[22]計(jì)算：

(2)

其中，ρx為樣品在37 ℃下由彈性模量和溶脹率所確定的交聯(lián)度，G為樣品的彈性模量，Q為樣品在37 ℃下的溶脹度，T為絕對(duì)溫度(310 K)，R為平衡常數(shù)(8.314×103kPa·cm3·mol-1·K-1)。

2.4 體外生物活性研究

2.4.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

將2種水凝膠以100 mg·mL-1的濃度浸入到HBMSCs成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中，在37 ℃下浸提72 h，過(guò)濾后得到浸提液備用。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HBMSCs接種于96孔板上(接種密度為1×104個(gè)/孔)并于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將2種水凝膠的浸提液分別加入到孔板中(100 μL/孔)作為試驗(yàn)組，另外一組僅加入培養(yǎng)基作為對(duì)照組。分別培養(yǎng)24，48和72 h后加入含有CCK-8試劑的培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)2～4 h。使用450 nm波長(zhǎng)光測(cè)量每個(gè)孔的吸光度A。細(xì)胞存活率用式(3)計(jì)算：

2.4.2 黏附試驗(yàn)

將冷凍干燥后的重組膠原蛋白水凝膠置于12孔板中。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HBMSCs經(jīng)消化、離心、重懸、計(jì)數(shù)操作后，滴加100 μL含有1×105個(gè)HBMSCs的懸浮液于水凝膠上，使HBMSCs完全粘附在凝膠上生長(zhǎng)。6 h后，加入1.5 mL HBMSCs成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基于孔板中，并在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。使用戊二醛固定水凝膠，通過(guò)SEM觀察水凝膠中的HBMSCs。

2.4.3 甲苯胺藍(lán)染色

按照2.4.1中的方法得到2種水凝膠浸提液備用。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好并經(jīng)過(guò)稀釋的HBMSCs接種于12孔板上(接種密度為3×105個(gè)/孔)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿孔底部80%以上后，將原有培養(yǎng)液移除。將2種水凝膠的浸提液分別加入到孔板中(1 mL/孔)作為試驗(yàn)組。對(duì)照組加入1 mL的HBMSCs成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，使用4%多聚甲醛將HBMSCs固定，將定量甲苯胺藍(lán)染色溶液加入孔中，并在37 ℃下孵育1 h。染色結(jié)束后，用PBS洗滌2次。拍攝記錄圖像，并使用ImageJ軟件分析藍(lán)色染色區(qū)域的面積。

2.4.4 免疫熒光染色

細(xì)胞固定后與特定抗體(Ⅱ型膠原蛋白COLⅡ)在室溫下孵育，使用 DAPI 染色觀察細(xì)胞核。孵育結(jié)束后，使用尼康 A1 激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行拍攝。

2.4.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)

按2.4.3相同的方法使用浸提液處理HBMSCs 24 h后，使用TRIzol法提取細(xì)胞RNA[23]。隨后，使用從Thermo Fisher Scientific(USA)獲得的逆轉(zhuǎn)錄互補(bǔ)DNA(cDNA)合成試劑盒進(jìn)行cDNA合成。利用cDNA進(jìn)行RT-qPCR試驗(yàn)[24]。以β-actin基因作為內(nèi)參基因。表1列出了實(shí)驗(yàn)中使用的詳細(xì)引物信息。

表1 RT-qPCR 所用引物序列

2.5 體內(nèi)軟骨修復(fù)功效探究

2.5.1 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過(guò)西北大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與倫理委員會(huì)審查，實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物倫理機(jī)構(gòu)相關(guān)的要求(倫理批號(hào)：NWU-AWC-20220904M)。將12只健康的新西蘭兔子適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，將12只兔子分為2組，每組6只。一組為Gel-Ⅰ組，用Gel-Ⅰ填充兔子左側(cè)關(guān)節(jié)軟骨缺損處，右側(cè)關(guān)節(jié)軟骨穿孔作為缺損對(duì)照。另一組為Gel-Ⅲ組，用Gel-Ⅲ樣品填充兔子左側(cè)關(guān)節(jié)軟骨缺損，右側(cè)關(guān)節(jié)軟骨穿孔作為缺損對(duì)照[25]。

2.5.2 關(guān)節(jié)軟骨缺損動(dòng)物模型建立

將麻醉后的兔子固定在解剖臺(tái)上，覆蓋無(wú)菌洞巾，使用碘伏對(duì)手術(shù)區(qū)域進(jìn)行消毒。在膝蓋外側(cè)做一個(gè)縱向切口打開(kāi)關(guān)節(jié)，在髕骨脫位并暴露出關(guān)節(jié)軟骨，使用鉆孔器在左腿脛骨關(guān)節(jié)面鉆孔(直徑4 mm，深度2 mm)建立關(guān)節(jié)軟骨缺損模型，并將水凝膠緩慢注射到軟骨缺損處。右側(cè)只進(jìn)行缺損造模作為缺損對(duì)照。術(shù)畢逐層縫合傷口，對(duì)皮膚傷口進(jìn)行消毒，術(shù)后3 d內(nèi)每天肌肉注射8萬(wàn)單位青霉素。術(shù)后恢復(fù)期間，每天監(jiān)測(cè)兔子2次，持續(xù)5 d。實(shí)驗(yàn)過(guò)程及手術(shù)過(guò)程示意圖見(jiàn)圖1。

圖1 關(guān)節(jié)軟骨缺損動(dòng)物模型建立：(a)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程圖，(b)關(guān)節(jié)軟骨缺損手術(shù)前后Fig.1 Establishment of an animal model for articular cartilage defect：(a)animal experiment flowchart，(b) articular cartilage before and after surgery

2.5.3 軟骨缺陷觀察和組織學(xué)分析

術(shù)后第4周和第8周取出兔子膝關(guān)節(jié)骨組織，并拍攝缺陷修復(fù)情況，記錄修復(fù)處的覆蓋范圍、與周圍正常軟骨組織的融合程度，根據(jù)ICRS軟骨修復(fù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估修復(fù)組織[26]。膝關(guān)節(jié)標(biāo)本固定2 d后，通過(guò)Micro-CT掃描缺損區(qū)修復(fù)的骨組織，并使用VGS Studio Max軟件生成三維結(jié)構(gòu)，觀察冠狀和軸向位置的新骨組織，計(jì)算骨體積/組織體積(BV/TV)、小梁數(shù)量(Tb.N)、小梁分離度(Tb.Sp)和小梁厚度(Tb.Th)以評(píng)估骨修復(fù)效果。

使用EDTA對(duì)關(guān)節(jié)標(biāo)本脫鈣2個(gè)月，石蠟包埋，制備5 μm厚的切片用于后續(xù)染色實(shí)驗(yàn)，包括蘇木精染色(H&E)、甲苯胺藍(lán)染色(T-B)和番紅固綠染色(S-F)，以觀察骨軟骨缺損處新修復(fù)的軟骨組織。根據(jù)GB/T 16886.6-2022《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第6部分：植入后局部反應(yīng)試驗(yàn)》對(duì)組織進(jìn)行觀察和評(píng)分。使用ImageJ軟件測(cè)量H&E染色切片新生軟骨的厚度、缺損處S-F染色和T-B陽(yáng)性區(qū)域的面積。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Origin和IBM SPSS Statistics 21.0(SPSS Inc. USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以“平均值(mean)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation，SD)”的形式表示。以下情況認(rèn)為有顯著性，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：P<0.05(*)，P<0.01(**)，P<0.001(***)。

3 結(jié)果與討論

3.1 交聯(lián)機(jī)理

EDC/NHS交聯(lián)劑與重組膠原蛋白的羧基反應(yīng)，偶聯(lián)到O-異酰基脲結(jié)構(gòu)上，這種活化的中間體與重組膠原的氨基交聯(lián)，形成酰胺鍵[27]。在交聯(lián)過(guò)程中，EDC和NHS催化膠原鏈中的羧基和氨基之間形成酰胺鍵，本身并不產(chǎn)生交聯(lián)[28]，如圖2所示。因此，EDC和NHS不與凝膠產(chǎn)生連接，細(xì)胞毒性小[29]。

圖2 EDC/NHS交聯(lián)重組膠原蛋白凝膠的制備機(jī)理示意圖Fig.2 Mechanism schematic of recombinant collagen gel preparation by EDC/NHS cross-linking

3.2 水凝膠微觀結(jié)構(gòu)

圖3a和3b是Gel-Ⅰ和Gel-Ⅲ 2種水凝膠的SEM形貌，可以觀察到不規(guī)則的多孔結(jié)構(gòu)，孔連通性較好，孔徑在50～200 μm之間(圖3c)。水凝膠的孔徑受交聯(lián)度的影響，進(jìn)而影響水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以及溶脹特性[30]。在骨軟骨再生過(guò)程中，孔徑較小(100～200 μm)的支架更有利于軟骨形成[31，32]。在含小孔(150 μm)更多的水凝膠上，軟骨細(xì)胞表達(dá)更高水平的COL2A1，而750 μm孔大小的水凝膠中的軟骨生成細(xì)胞大多呈現(xiàn)肥大表型，更高水平表達(dá)COL10A1[33，34]。在本研究中，Gel-Ⅰ和Gel-Ⅲ的孔徑都在50～200 μm之間，均可更好地誘導(dǎo)HBMSCs分化為軟骨細(xì)胞。

圖3 水凝膠的SEM形貌(a，b)和孔徑分布(c)Fig.3 SEM morphologies (a，b) and pore size distributions (c) of gels

3.3 水凝膠可注射性能及降解性能

2種水凝膠填充于注射器中均能均勻推出，且推擠力小于10 N(圖4b)，表明2種水凝膠均具有可注射性，可以滿足治療時(shí)的操作便捷性要求[35]。

圖4 水凝膠的可注射性(a)、推擠力-位移曲線(b)和降解曲線(c)Fig.4 Injectability (a)，pushing force-displacement curves (b) and degradation curves (c) of gels

此外，重組膠原蛋白水凝膠用于人體，那就必需被人體內(nèi)的酶液降解，因此實(shí)驗(yàn)選用膠原酶來(lái)代替人體內(nèi)能夠產(chǎn)生的酶液進(jìn)行降解性能研究。如圖4c所示，Gel-Ⅰ和Gel-Ⅲ的降解曲線沒(méi)有顯著性差異。水凝膠在降解過(guò)程中存在分子鏈的變化，降解行為來(lái)源于水凝膠網(wǎng)絡(luò)以及基質(zhì)本身的降解。

3.4 水凝膠力學(xué)性能及溶脹性能

在原料方面，與重組Ⅲ型膠原蛋白相比，重組I型膠原蛋白具有更強(qiáng)的拉伸強(qiáng)度，制成水凝膠后，Gel-Ⅰ亦表現(xiàn)出比Gel-Ⅲ更大的抗壓能力(圖5a，P<0.05)。在日常生活中，關(guān)節(jié)軟骨需要承受關(guān)節(jié)區(qū)域的壓力[36]。因此，機(jī)械強(qiáng)度是影響植入材料在關(guān)節(jié)骨軟骨缺損修復(fù)應(yīng)用的關(guān)鍵因素?，F(xiàn)有研究表明，兔和人關(guān)節(jié)軟骨的壓縮模量值分別約為0.8 MPa和(1.03±0.48) MPa[37，38]。本研究制備的Gel-Ⅰ和Gel-Ⅲ的最大壓縮強(qiáng)度均大于1.5 MPa，因此，Gel-Ⅰ和Gel-Ⅲ均能滿足人體和兔關(guān)節(jié)軟骨的力學(xué)性能。

圖5 水凝膠壓縮強(qiáng)度(a)、溶脹性能(b)和交聯(lián)度(c)Fig.5 Compressive strength (a)，swelling property (b)，and cross-linking degree (c) of gels

2種水凝膠的吸水率迅速增加并逐漸趨于平穩(wěn)，在120 min內(nèi)可達(dá)到溶脹平衡(圖5b)。交聯(lián)度與水凝膠機(jī)械強(qiáng)度、孔徑、溶脹行為之間存在密切關(guān)系。穩(wěn)定的分子鏈和更多的交聯(lián)位點(diǎn)可以增加水凝膠的交聯(lián)度，促使較高的壓縮強(qiáng)度。2種水凝膠的交聯(lián)度和壓縮強(qiáng)度成正比關(guān)系，推測(cè)可能是由于EDC/NHS主要作用于重組膠原蛋白的氨基和羧基，而Col Ⅰ的酸性氨基酸數(shù)量多于Col Ⅲ(酸性氨基酸：Col Ⅰ141個(gè)，Col Ⅲ129個(gè)；堿性氨基酸：Col Ⅰ 137個(gè)，Col Ⅲ 137個(gè))，因此Gel-Ⅰ相比Gel-Ⅲ具有相對(duì)較大的交聯(lián)度(圖5c)、更高的機(jī)械強(qiáng)度(圖5a)和較小的孔徑(圖3a)。

3.5 水凝膠細(xì)胞相容性

圖6a的細(xì)胞增殖率數(shù)據(jù)表明，與對(duì)照組相比，Gel-Ⅰ組在培養(yǎng)第3 d和第7 d顯著促進(jìn)了HBMSCs的增殖(P<0.05，P<0.01)。盡管Gel-Ⅲ組沒(méi)有觀察到促細(xì)胞增殖作用，但與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異，表明無(wú)細(xì)胞毒性作用。通過(guò)SEM進(jìn)一步觀察了HBMSCs在重組膠原蛋白水凝膠上的黏附作用，結(jié)果表明，Gel-Ⅰ和Gel-Ⅲ上均有HBMSCs的聚集生長(zhǎng)(圖6b)。上述結(jié)果表明，用重組膠原蛋白制備的Gel-Ⅰ和Gel-Ⅲ具有良好的生物相容性。

圖6 水凝膠體外生物活性研究結(jié)果：(a)細(xì)胞增殖率實(shí)驗(yàn)結(jié)果，(b)細(xì)胞黏附的微觀形貌Fig.6 In vitro bioactivity evaluation of hydrogels：(a)cell survival rate results，(b) SEM morphologies of cell adhension

3.6 水凝膠促HBMSCs成軟骨分化作用

誘導(dǎo)HBMSCs成軟骨分化表征結(jié)果顯示，Gel-Ⅰ組和Gel-Ⅲ組的T-B染色均呈陽(yáng)性(圖7a)，表明2種凝膠都能促進(jìn)糖胺聚糖的分泌，且Gel-Ⅰ的促進(jìn)作用優(yōu)于Gel-Ⅲ。COLⅡ是軟骨組織的主要成分，由軟骨細(xì)胞分泌，有助于維持軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能[39]。通過(guò)免疫熒光染色進(jìn)一步反映軟骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)COL Ⅱ的分泌(圖7b)。

圖7 重組膠原蛋白水凝膠促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone-marrow mesenchymal stem cells，HBMSCs)向軟骨細(xì)胞分化的效果表征：甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果(a)及COLⅡ免疫熒光染色結(jié)果(b)；(c，d)甲苯胺藍(lán)染色和免疫熒光染色量化分析；(e)軟骨細(xì)胞標(biāo)記基因的相對(duì)表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)Fig.7 Effect of recombinant collagen hydrogel on promoting differentiation of HBMSCs into chondrocytes：toluidine blue staining results (a) and COLⅡ immunofluorescence staining results (b)；(c，d) quantitative analysis of toluidine blue staining and immunofluorescence staining；(e) statistics of relative expression level of chondrocyte marker genes

Gel-Ⅰ干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)綠色熒光區(qū)域的強(qiáng)度和面積增加，表明細(xì)胞分泌的COLⅡ增加(圖7d)，細(xì)胞有從HBMSCs向軟骨細(xì)胞分化的趨勢(shì)。糖胺聚糖和COLⅡ是軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵成分，在軟骨修復(fù)中起到重要作用。上述結(jié)果表明，Gel-Ⅰ干預(yù)后，HBMSCs分泌的糖胺聚糖與COLⅡ表達(dá)的比例高于Gel-Ⅲ，表明Gel-Ⅰ 促進(jìn)HBMSCs向軟骨細(xì)胞分化的能力優(yōu)于Gel-Ⅲ。

進(jìn)一步測(cè)定各組HBMSCs中軟骨標(biāo)記基因的相對(duì)表達(dá)量[40]。結(jié)果如圖7e所示，與對(duì)照組相比，Gel-Ⅰ組的COLⅡ基因和SRY轉(zhuǎn)錄因子9(SRY-box transcription factor 9，SOX9)基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05，P<0.01)。Gel-Ⅲ組的COLⅡ基因表達(dá)沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，SOX9基因的表達(dá)顯著升高(P<0.05)。這些結(jié)果表明，Gel-Ⅰ具有促進(jìn)HBMSCs向軟骨細(xì)胞分化的優(yōu)越能力，并且促進(jìn)分化的效果優(yōu)于Gel-Ⅲ。

3.7 重組膠原蛋白水凝膠促進(jìn)體內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的效果

通過(guò)建立兔關(guān)節(jié)軟骨缺損模型評(píng)價(jià)重組膠原蛋白水凝膠的體內(nèi)修復(fù)效果[41]。在整個(gè)過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物狀態(tài)良好，無(wú)死亡現(xiàn)象，且傷口未發(fā)生感染。術(shù)后4周，3組動(dòng)物軟骨缺損部位新生組織的形態(tài)和外觀與周圍正常軟骨均有差異，并有明顯邊界(圖8)。對(duì)術(shù)后8周的關(guān)節(jié)軟骨缺損處及修復(fù)效果，根據(jù)ICRS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。結(jié)果顯示，Gel-Ⅰ組軟骨缺損已基本完全修復(fù)，缺損處新生組織表面光滑透明，與周圍正常軟骨在形態(tài)和顏色上無(wú)明顯差異，未見(jiàn)明顯邊界。Gel-Ⅲ組大部分軟骨缺損已被修復(fù)，但缺損修復(fù)后的組織顏色為乳白色，與正常軟骨之間有明顯的邊界。對(duì)照組軟骨缺損部位仍有較大缺損。與對(duì)照組相比，Gel-Ⅰ和Gel-Ⅲ組的填充水凝膠均表現(xiàn)出良好的軟骨修復(fù)能力(P<0.001，P<0.01)，且Gel-Ⅰ的修復(fù)能力優(yōu)于Gel-Ⅲ(P<0.05)。

圖8 不同類型重組膠原蛋白水凝膠對(duì)兔子體內(nèi)軟骨缺損修復(fù)效果的照片和ICRS評(píng)分Fig.8 Images and ICRS evaluation of in vivo cartilage repair by different types of recombinant collagen prepared hydrogels

通過(guò)顯微CT觀察各組水凝膠促進(jìn)軟骨缺損內(nèi)部生長(zhǎng)的情況[42]。結(jié)果如圖9所示，對(duì)照組軟骨和軟骨下層仍有明顯缺損，未形成有效修復(fù)；Gel-Ⅰ組植入材料與周圍骨骼和軟骨融合良好，Gel-Ⅲ組仍有部分內(nèi)部間隙，且該組的軟骨修復(fù)效果略差于Gel-Ⅰ組。通過(guò)VGS Studio Max軟件分析了骨體積/組織體積(BV/TV)、小梁數(shù)量(Tb.N)、小梁分離度(Tb.Sp)和小梁厚度(Tb.Th)。術(shù)后8周，Gel-Ⅰ組在骨體積大小方面表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)(P<0.05)，表明軟骨下骨已形成并有效恢復(fù)，小梁的數(shù)量和厚度最高，小梁間距最小，即小梁分布更均勻。

圖9 軟骨缺損修復(fù)術(shù)后8周顯微CT掃描圖像及數(shù)據(jù)分析Fig.9 Micro-CT scan images and data analysis after 8 weeks of cartilage defect repair surgery

術(shù)后8周的組織學(xué)染色結(jié)果如圖10所示。從新組織切片的細(xì)胞形態(tài)來(lái)看，對(duì)照組細(xì)胞分散，且缺損表面可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞，軟骨下骨重建程度小于50%。Gel-Ⅰ組新生組織可見(jiàn)軟骨細(xì)胞。細(xì)胞呈圓形，排列整齊，結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞，且軟骨下骨修復(fù)程度良好，缺損處新軟骨厚度與相鄰軟骨厚度相同。Gel-Ⅲ組缺損處有新生組織，其厚度略低于鄰近軟骨，新組織表面有大量排列規(guī)則的纖維細(xì)胞，表明新組織主要為纖維組織。根據(jù)GB/T 16886.6-2022 《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第6部分：植入后局部反應(yīng)試驗(yàn)》[43]，從3個(gè)角度對(duì)每組組織進(jìn)行評(píng)分：新生血管、纖維化和脂肪浸潤(rùn)。結(jié)果顯示，對(duì)照組的組織中存在大量新生血管，缺損處出現(xiàn)明顯的脂肪細(xì)胞堆積，組織反應(yīng)評(píng)分較高。Gel-Ⅰ組幾乎沒(méi)有明顯的組織反應(yīng)，組織反應(yīng)評(píng)分在0～1之間。植入Gel-Ⅲ后，組織中表現(xiàn)出較寬條帶形式的纖維化反應(yīng)，其組織反應(yīng)評(píng)分與對(duì)照組和Gel-Ⅰ組均有顯著差異。 H&E染色結(jié)果顯示，缺損處新生軟骨厚度Gel-Ⅰ>Gel-Ⅲ>對(duì)照組，3組之間存在顯著差異(P<0.001)。S-F染色與T-B染色結(jié)果顯示，在Gel-Ⅰ組中觀察到更大面積的陽(yáng)性區(qū)域面積，表明該組的軟骨覆蓋率更高；且其厚度與鄰近軟骨組織的厚度一致，并且分布均勻，沒(méi)有明顯的間隔。針對(duì)Gel-Ⅰ和Gel-Ⅲ在軟骨修復(fù)效果之間的差異，推測(cè)原因如下：在原材料方面，與重組III型膠原相比，重組I型膠原具有良好的張力和強(qiáng)度，可以為組織提供結(jié)構(gòu)支撐，并保持其彈性和穩(wěn)定性。在結(jié)構(gòu)上，Gel-Ⅰ具有更均勻的多孔結(jié)構(gòu)，有助于軟骨細(xì)胞在凝膠上生長(zhǎng)，加速軟骨修復(fù)。從生物學(xué)角度來(lái)看，與Gel-Ⅲ對(duì)比，Gel-Ⅰ更能顯著促進(jìn)HBMSCs向軟骨細(xì)胞分化，從而釋放糖胺聚糖和COLⅡ，促進(jìn)軟骨組織修復(fù)。

圖10 軟骨缺損修復(fù)術(shù)后8周組織學(xué)染色及分析：(a)軟骨缺損部位的組織病理學(xué)染色，(b)軟骨缺損部位新生軟骨厚度分析，(c)對(duì)組織切片的組織反應(yīng)的評(píng)分結(jié)果，(d)軟骨缺損部位番紅固綠染色陽(yáng)性的面積比例，(e)軟骨缺損部位甲苯胺藍(lán)染色陽(yáng)性的面積比例(數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Fig.10 Histological staining and analysis after 8 weeks of cartilage defect repair surgery：(a) histopathological staining of cartilage defect sites，(b) thickness analysis of newborn cartilage at cartilage defects sites，(c) tissue response scoring，(d) the area ratio of positive staining of Safranin O/solid green at cartilage defect sites，(e) the area ratio of positive toluidine blue staining at cartilage defect sites (Data were expressed as the mean±standard deviation)

4 結(jié) 論

(1)使用EDC/NHS試劑交聯(lián)重組膠原蛋白制備可注射水凝膠Gel-Ⅰ和Gel-Ⅲ，比較了兩者的孔徑、壓縮強(qiáng)度、推擠力、溶脹性能/交聯(lián)度、降解性能，結(jié)果顯示Gel-Ⅰ具有更優(yōu)的力學(xué)性能。

(2)在體外細(xì)胞研究中，2種凝膠均表現(xiàn)出良好的生物相容性，在誘導(dǎo)HBMSCs分化成軟骨細(xì)胞的試驗(yàn)中Gel-Ⅰ的誘導(dǎo)分化能力優(yōu)于Gel-Ⅲ。

(3)在兔膝關(guān)節(jié)軟骨損傷模型中，Gel-Ⅰ和Gel-Ⅲ對(duì)比對(duì)照組均顯示出顯著的軟骨缺損修復(fù)效果，Gel-Ⅰ比Gel-Ⅲ具有更強(qiáng)的軟骨修復(fù)潛力。一方面，Gel-Ⅰ的力學(xué)性能和良好的生物相容性可以保護(hù)軟骨缺損免受二次損傷。另一方面，Gel-Ⅰ可以更大程度地促進(jìn)HBMSCs向軟骨細(xì)胞的分化，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成，減緩膠原蛋白的降解，從而更好地修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨。本研究展現(xiàn)了Gel-Ⅰ在軟骨修復(fù)中的潛力，但還需要進(jìn)一步的研究來(lái)闡明其機(jī)制。