HPLC法同時測定健腰密骨片浸膏粉中5種指標成分

商曉慧 趙曉玲 詹常森

摘 要 目的：建立健腰密骨片浸膏粉的多成分定量分析方法，為評價浸膏粉中間體的質(zhì)量提供依據(jù)。方法：采用HPLC法，以乙腈-磷酸鹽緩沖液為流動相，梯度洗脫，測定健腰密骨片浸膏粉中5種成分的含量。結(jié)果：木蘭花堿、丹酚酸B、朝藿定C、淫羊藿苷和寶藿苷Ⅰ5種成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，r≥0.999 7；5種化合物的平均回收率分別為100.47%、104.37%、95.38%、95.93%、96.66%。該方法的專屬性、重復性均良好。結(jié)論：該分析方法準確、重復性好，可作為健腰密骨片浸膏粉的質(zhì)量控制方法。

關(guān)鍵詞 健腰密骨片浸膏粉 HPLC 多成分定量分析

中圖分類號：O657.72； R286 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2024）03-0071-05

引用本文 商曉慧， 趙曉玲， 詹常森. HPLC法同時測定健腰密骨片浸膏粉中5種指標成分[J]. 上海醫(yī)藥， 2024， 45（3）： 71-75.

基金項目：上海市2021年度“科技創(chuàng)新行動計劃”生物醫(yī)藥科技支撐專項項目（21S21903100）

Simultaneous determination of five constituents in Jianyao Migu tablets by HPLC

SHANG Xiaohui， ZHAO Xiaoling， ZHAN Changsen

（Shanghai Hutchison Pharmaceuticals/Shanghai Engineering Research Center for Innovation of Solid Preparation of TCM， Shanghai 201401， China）

ABSTRACT Objective： To establish a multi-component quantitative analysis method for the extract powder of Jianyao Migu tablets and provide a basis for comprehensive evaluation of the quality of extract powder. Methods： The contents of five components in the extract powder of Jianyao Migu tablets were determined by HPLC method with acetonitrile-phosphate buffer as mobile phase and gradient elution. Results： The five components including magnoflorine， salvianolic acid B， epimedin C， icariin and baohuosideⅠshowed a good linear relationship in their respective concentration ranges （r≥0.999 7）. The average recovery rates of 5 compounds were 100.47%， 104.37%， 95.38%， 95.93% and 96.66%， respectively. The specificity and reproducibility of this method were good. Conclusion： The established analytical method is accurate and reproducible， and can be used for the quality control of extract powder in Jianyao Migu tablets.

KEY WORDS extract powder of Jianyao Migu tablets； HPLC； multi-component quantitative analysis

健腰密骨片是上海和黃藥業(yè)有限公司研發(fā)的中藥1類新藥，于2020年底獲得國家藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的臨床試驗許可。處方由黃芪、淫羊藿、墨旱蓮、丹參等6味中藥經(jīng)提取、純化、濃縮、干燥等一系列工藝制備而成。該方為國醫(yī)大師施杞教授的經(jīng)驗方，具有益氣健腰補腎、化痰通絡(luò)止痛的功效[1]，臨床擬用于治療腎虛血瘀型老年骨質(zhì)疏松性腰痛。方中黃芪具有補氣升陽、固表止汗等功效，含有黃酮、皂苷等活性成分[2]；淫羊藿具有補腎陽、強筋骨、祛風濕等功效，含有黃酮、木脂素、生物堿等活性成分[3]；墨旱蓮具有滋補肝腎、涼血止血等功效，含有黃酮類、三萜類等活性成分[4]；丹參具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩等功效，含有丹酚酸類、丹參酮類等活性成分[5]；青風藤具有祛風濕、通經(jīng)絡(luò)、利小便等功效，含有生物堿[6]、揮發(fā)油[7]等活性成分；牛膝具有逐瘀通經(jīng)，補肝腎，強筋骨等功效，含有三萜皂苷、甾酮類等活性成分[8]。

現(xiàn)有的健腰密骨片成品質(zhì)量標準中規(guī)定了黃芪甲苷、淫羊藿苷和丹酚酸B的含量限度，為了更好地控制成品質(zhì)量，需對浸膏粉中間體進行相關(guān)性研究，探索量質(zhì)傳遞規(guī)律，因此需對中間體指標成分建立含量測定方法。前期參照健腰密骨片黃芪甲苷含量測定方法[9]建立了浸膏粉黃芪甲苷含量測定方法，本研究建立浸膏粉其它主要成分含量的同時測定方法。

1 材料和方法

1.1 儀器與試藥

ACQUITY Arc高效液相色譜儀（沃特斯中國有限公司）；實驗室專用超純水機（重慶利迪現(xiàn)代水技術(shù)設(shè)備有限公司）；AL204天平、XS205天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；SK7210HP型超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）。

木蘭花堿對照品（批號10555，含量≥98.0%計），購自上海詩丹德標準技術(shù)服務(wù)有限公司；丹酚酸B對照品（批號111562-201917，供含量測定用，含量以96.6%計）、朝藿定C對照品（批號111780-201905，供含量測定用，含量以94.3%計）、淫羊藿苷對照品（批號110737-202017，供含量測定用，含量以98.1%計）、寶藿苷Ⅰ對照品（批號111852-202104，供含量測定用，含量以99.2%計）均購自中國食品藥品檢定研究院；健腰密骨片浸膏粉（批號S190201、211001和S220801）為上海和黃藥業(yè)有限公司自制商業(yè)規(guī)模樣品；乙腈為色譜純試劑；水為超純水；磷酸二氫鉀和磷酸為色譜純試劑；其他試劑均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 溶液制備

1）混合對照品溶液 精密稱取對照品木蘭花堿、丹酚酸B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ適量，加80%甲醇溶解制成每毫升分別含500.03、1 003.0、1 002.0、501.7、202.5 mg的混合溶液。

2）供試品溶液 精密稱定健腰密骨片浸膏粉0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇溶液40 mL，稱定重量。超聲處理（功率350 W，頻率53 kHz）30 min，取出，放冷，再稱定重量，用80%甲醇溶液補足減失的量，搖勻，取上清液用有機微孔濾膜（0.22 mm）濾過，取續(xù)濾液。

3）陰性樣品溶液 根據(jù)處方比例和制劑工藝，分別制得缺淫羊藿藥材、丹參藥材、青風藤藥材的單陰性樣品和缺淫羊藿和青風藤藥材的雙陰性樣品。按供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。

1.2.2 色譜條件

Agilent ZORBAX SB C18柱（4.6 mm×250 mm，5 mm）；以乙腈（A）-磷酸鹽緩沖液（B）（0.02 mol/L的磷酸二氫鉀溶液，以磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5）為流動相，按表1的規(guī)定進行梯度洗脫，流速1.0 mL/min；進樣量10 mL；紫外檢測波長 270 nm（木蘭花堿、朝藿定C、淫羊藿苷和寶藿苷Ⅰ，保留時間0～80 min），286 nm（丹酚酸B，保留時間30～40 min）。

2 結(jié)果

2.1 專屬性試驗

分別取混合對照品溶液、供試品溶液、單陰性樣品（分別缺淫羊藿、缺丹參、缺青風藤）及雙陰性樣品（同時缺青風藤和淫羊藿）溶液10 mL進樣分析，結(jié)果見圖1。在木蘭花堿對照品出峰位置上缺青風藤、缺淫羊藿的單陰性樣品溶液上分別出現(xiàn)干擾峰，而在同時缺青風藤和淫羊藿的雙陰性樣品溶液上未見干擾峰，說明木蘭花堿同時存在于青風藤和淫羊藿藥材中，其他藥材中各成分對木蘭花堿的含量測定無干擾；在丹酚酸B對照品出峰位置上缺丹參陰性樣品溶液未見干擾峰，在朝藿定C、淫羊藿苷和寶藿苷Ⅰ的3個對照品出峰位置上缺淫羊藿陰性樣品溶液未見干擾峰，說明各陰性樣品無干擾。

2.2 線性關(guān)系、檢出限及定量限

精密吸取適量混合對照品溶液，加入適量80%甲醇稀釋，使木蘭花堿質(zhì)量濃度分別為12.51、25.02、50.03、100.06、250.15、500.30 mg/mL；丹酚酸B質(zhì)量濃度為25.08、50.15、100.30、200.60、501.50、1 003.0 mg/mL；朝藿定C質(zhì)量濃度為25.05、50.10、100.20、200.40、501.0、1 002.0 mg/mL；淫羊藿苷質(zhì)量濃度為12.54、25.09、50.17、100.34、250.85、501.70 mg/mL；寶藿苷Ⅰ質(zhì)量濃度為5.06、10.13、20.25、40.50、101.25、202.50 mg/mL。取各個質(zhì)量濃度的混合對照品溶液進行液相色譜分析。以峰面積為縱坐標（Y），對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)（r）。以信噪比S/N=10時對照品的含量為定量限，以信噪比S/N=3時對照品的含量為檢測限，結(jié)果顯示，各成分在各自的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（表2）。

2.3 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液適量，連續(xù)進樣6次，進行液相色譜分析。結(jié)果顯示，木蘭花堿、丹酚酸B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ色譜峰面積相對標準偏差RSD分別為0.40%、0.04%、0.05%、0.15%、0.16%，RSD均小于2.0%，符合2020版中國藥典要求[10]，表明儀器精密度良好。

2.4 重復性試驗

平行制備6份樣品（批號211001），進行液相色譜檢測。結(jié)果顯示，木蘭花堿、丹酚酸B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ含量相對標準偏差RSD分別為0.52%、0.69%、0.79%、0.86%、0.78%，RSD均小于3.0%，符合2020版中國藥典要求[10]，表明該方法重復性較好。

2.5 加樣回收率試驗

精密稱定9份各成分含量已知的樣品（批號211001）0.25 g，分別加入相當于樣品中各成分含量的80%、100%、120%的對照品，進行液相色譜測定，計算各成分含量的平均回收率和RSD值。結(jié)果顯示，木蘭花堿、丹酚酸B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ的平均回收率分別為100.47%、104.37%、95.38%、95.93%、96.66%，相對標準偏差RSD分別為2.88%、1.95%、2.52%、2.87%、4.59%，符合2020版中國藥典要求[10]，表明該方法準確度較好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一份供試品溶液（批號211001），于室溫下放置0、2、4、8、12、18、24、48、72 h時進樣分析。結(jié)果顯示，木蘭花堿、丹酚酸B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ色譜峰面積在72 h內(nèi)相對標準偏差RSD分別為0.52%、0.19%、0.20%、0.58%、0.87%，RSD均小于2.0%，表明供試品溶液在室溫下放置72 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 耐用性試驗

取同一批健腰密骨片浸膏粉（批號211001）制備成供試品溶液，進樣測定，考察不同類型/不同批號色譜柱（Agilent Zorbax SB-C18、Agilent Eclipse Plus-C18）對木蘭花堿、丹酚酸B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ含量檢測的影響。結(jié)果顯示不同型號色譜柱檢測各指標性成分的分離度均大于1.5，含量RSD均小于5.0%，表明該方法耐用性良好（表3）。

2.8 樣品含量測定

取3批健腰密骨片浸膏粉制備成供試品溶液，每批各進樣測定2次，計算含量（表4）。結(jié)果顯示該方法下測定各批次樣品含量相對偏差均小于5.0%，表明該方法檢測樣品含量數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠。

3 討論

研究[11-12]發(fā)現(xiàn)木蘭花堿同時存在于淫羊藿和青風藤藥材中，故本研究同時制備缺淫羊藿、缺青風藤的單陰性樣品溶液及缺上述兩味藥材的雙陰性樣品溶液，經(jīng)證實在木蘭花堿色譜峰出峰位置上分別缺兩味藥材的單陰性樣品溶液（圖1 C和E）均出現(xiàn)干擾峰，在同時缺兩味藥材的雙陰性樣品溶液（圖1F）未出現(xiàn)干擾峰。

本研究對浸膏粉質(zhì)量濃度（0.01、0.012 5、0.016 7、0.025、0.05 g/mL）、提取溶劑甲醇濃度（20%、40%、60%、80%）和乙醇濃度（60%）、超聲時間（20、30、40、50、60 min）分別進行考察，綜合考慮色譜峰數(shù)量、峰面積等因素，最終選擇0.025 g/mL樣品80%甲醇超聲提取30 min作為提取條件。

本研究還分別考察了流動相酸鹽種類和濃度（水、0.05%磷酸、0.1%磷酸、0.1%乙酸、乙二胺、0.01 mol/L磷酸二氫鉀、0.02 mol/L磷酸二氫鉀）對液相色譜分析的影響，發(fā)現(xiàn)不同種類酸鹽對木蘭花堿和丹酚酸B的2個色譜峰峰形和出峰時間影響較大，經(jīng)過對比研究后選擇0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液，再以磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5作為流動相。

綜上，本研究建立的健腰密骨片浸膏粉多成分定量分析方法可同時對處方中木蘭花堿、丹酚酸B、朝藿苷C、淫羊藿苷和寶藿苷Ⅰ共5種成分進行定量分析，體現(xiàn)方中青風藤、丹參、淫羊藿3味藥材，可作為健腰密骨片中間體多味藥指標成分的檢測方法。后期將進行中間體及成品指紋圖譜研究，以期對其化學成分進行更全面的表征和控制。

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