通過式固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定食品中的氯米芬、曲美他嗪和美度銨

宋 娟，李 君，張陽陽，姚蕾珺，肖全偉，李紹波,*，戴 琴,*

（1.成都市食品檢驗研究院，四川 成都 611130；2.國家市場監(jiān)管重點實驗室（營養(yǎng)與健康化學(xué)計量及應(yīng)用），北京 100029）

氯米芬是具有順、反異構(gòu)的N,N-二乙基-2-[4-(1,2-二苯基-2-氯乙烯基)苯氧基]乙胺化合物，穩(wěn)定性較差，通常以枸櫞酸鹽形式存在[1-2]。鹽酸曲美他嗪屬哌嗪類衍生物，化學(xué)名為1-(2,3,4-三甲氧基苯甲基)哌嗪二鹽酸鹽，是一種抗心肌缺血的代謝性藥物，具有降低血管阻力、增加冠脈及循環(huán)血流量、促進心肌代謝、降低心肌耗氧量、改善心肌氧的供需平衡、增強心臟功能的作用[3]。美度銨，又稱米屈阱，最初作為一種生長促進劑用于動物養(yǎng)殖，此外，作為左旋肉堿抑制劑，在歐洲作為臨床藥物治療糖尿病、神經(jīng)退行性疾病和支氣管肺疾病。就運動表現(xiàn)而言，對運動員運動能力、耐力以及運動后恢復(fù)均有促進作用[4]。因此，2016年，世界反興奮劑中心將美度銨列入《禁用清單》S4激素及代謝調(diào)節(jié)劑。為了避免食品來源的興奮劑污染，國家體育總局也于2021年發(fā)布《大型賽事食源性興奮劑防控工作指南》，要求大型賽事舉辦方對食品中的食源性興奮劑進行檢測，把氯米氛、曲美他嗪和美度銨同時歸為代謝調(diào)節(jié)劑。其中氯米芬的參考檢出限為1 μg/kg；曲美他嗪的參考檢出限為2 μg/kg；美度銨的參考檢出限為20 μg/kg。檢測對象為畜禽肉及其制品、水產(chǎn)品及其制品、蛋及其制品、奶及其制品，除此之外，曲美他嗪的檢測對象還包括所有經(jīng)廠家加工過的烹調(diào)調(diào)味品（如油、鹽、醬、醋、料酒、味精、雞精、蠔油等），檢測對象多，基質(zhì)較為復(fù)雜。

現(xiàn)有氯米芬、曲美他嗪和美度銨的檢測方法主要包括液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、超臨界色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜-高分辨質(zhì)譜法等[5-14]。液相色譜檢測法分析時間長，且易受基質(zhì)干擾，滿足不了痕量分析的需要；超臨界色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析速度快，但正相色譜柱易受樣品中水的影響，不適合長期、大批量樣品的分析。質(zhì)譜儀作為高效液相色譜的檢測器，大大提高了儀器的靈敏度和檢測范圍。三重四極桿質(zhì)譜儀具有高效的對已知目標(biāo)化合物定量檢測的能力，目前已廣泛應(yīng)用于食品中多種藥物殘留的檢測。通過多反應(yīng)離子監(jiān)測的掃描模式，能大大減少復(fù)雜基質(zhì)樣品中的背景干擾，提高目標(biāo)化合物的檢測靈敏度，保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

目前，氯米芬、曲美他嗪和美度銨的絕大多數(shù)檢測方法是建立在藥品、尿液及血液基質(zhì)中，食品中的檢測方法報道較少。由于食品樣品種類復(fù)雜，基質(zhì)干擾效應(yīng)明顯，因此對樣品前處理方法提出了更高的要求。而目前還鮮有食品中同時檢測氯米芬、曲美他嗪、美度銨3 種代謝調(diào)節(jié)劑的報道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸櫞酸氯米芬（純度99.0%）、曲美他嗪（純度99.9%）、美度銨（99.0%）、氯米芬-D5鹽酸鹽（純度98.5%）、曲美他嗪二鹽酸鹽-D8（純度98.7%）和美度銨-D3（100.0 μg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)品購于天津阿爾塔科技有限公司。

甲酸、甲醇、乙腈、甲酸銨、正己烷（均為色譜純）德國Merck公司；氯化鈉、二甲基亞砜（均為分析純）重慶川東化工（集團）有限公司；Oasis PRiME HLB固相萃取小柱（200 mg/6 mL）美國Waters公司；安捷倫Elut凈化包 美國Agilent公司；實驗用水符合GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》實驗室一級用水。本研究過程中所用100余批次樣品均購自于市場。

1.2 儀器與設(shè)備

1290+6470超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀美國Agilent公司；Centrifuge 5810R高速離心機 德國Eppendorf公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司；Multi reax全能型振蕩器 德國Heidolph公司；BP211D型天平 德國Sartorius公司；ORTEX3旋渦混勻器 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的配制

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：準(zhǔn)確稱取適量枸櫞酸氯米芬、曲美他嗪和美度銨標(biāo)準(zhǔn)品，分別用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制成氯米芬（折算成枸櫞酸后）、曲美他嗪和美度銨質(zhì)量濃度各為1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-18 ℃保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：分別準(zhǔn)確吸取不同體積的氯米芬、曲美他嗪和美度銨標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于同一棕色容量瓶中，用90%乙腈-水溶液（含0.1%甲酸）定容至刻度，搖勻得混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（氯米芬、曲美他嗪質(zhì)量濃度為0.2 μg/mL，美度銨質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL）。

1.3.1.2 同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

同位素內(nèi)標(biāo)儲備液：分別準(zhǔn)確稱取氯米芬-D5鹽酸鹽、曲美他嗪二鹽酸鹽-D8和美度銨-D3標(biāo)準(zhǔn)品適量（準(zhǔn)確至0.01 mg）置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容配制成氯米芬-D5（折算鹽酸后）、曲美他嗪-D8（折算鹽酸后）和美度銨-D3質(zhì)量濃度各為100 μg/mL的同位素內(nèi)標(biāo)儲備液，-18 ℃保存。

混合同位素內(nèi)標(biāo)中間工作液：分別準(zhǔn)確吸取不同體積的氯米芬-D5、曲美他嗪-D8和美度銨-D3同位素內(nèi)標(biāo)儲備液至同一棕色容量瓶中，用90%乙腈-水溶液（含0.1%甲酸）定容至刻度，搖勻得混合同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液（氯米芬-D5、曲美他嗪-D8質(zhì)量濃度為0.2 μg/mL，美度銨-D3質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL）。

1.3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別吸取不同體積的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液和500 μL的混合同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液于不同10 mL容量瓶中，用90%乙腈-水溶液（含0.1%甲酸）定容至刻度，搖勻，待測。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 提取

固態(tài)和半固態(tài)樣品：準(zhǔn)確稱取均質(zhì)樣品2 g（精確至0.01 g），置于50 mL離心管中，加入100 μL混合同位素內(nèi)標(biāo)中間工作液，加入均質(zhì)子、5 mL水，渦旋混勻5 min。加入20 mL 5%甲酸-乙腈溶液，渦旋混勻10 min，超聲30 min，再加入8 g氯化鈉，渦旋混勻1 min，于9 500 r/min、4 ℃冷凍離心5 min，取上清液于另一離心管中，加入10 mL乙腈飽和正己烷溶液，渦旋混勻5 min，于9 500 r/min、4 ℃冷凍離心5 min，棄去正己烷層，下層溶液待凈化。

液態(tài)樣品：準(zhǔn)確稱取均質(zhì)樣品2 g（精確至0.01 g），置于50 mL離心管中，加入100 μL混合同位素內(nèi)標(biāo)中間工作液，加入3 mL水，渦旋混勻5 min。加入20 mL 5%甲酸-乙腈溶液，渦旋混勻10 min，超聲30 min，再加入8 g氯化鈉，渦旋混勻1 min，于9 500 r/min、4 ℃冷凍離心5 min，取上清液于另一離心管中，加入10 mL乙腈飽和正己烷溶液，渦旋混勻5 min，于9 500 r/min、4 ℃冷凍離心5 min，棄去正己烷層，下層溶液待凈化。

1.3.2.2 凈化

取10 mL下層溶液過PRiME HLB小柱，收集濾液于氮吹管中，加入50 μL二甲基亞砜，40 ℃氮吹至近干，用90%乙腈-水溶液（含0.1%甲酸）定容至1 mL，混勻，過0.22 μm有機濾膜，上機待測。

1.3.3 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.3.3.1 超高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH Amide（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相A為0.1%甲酸-乙腈溶液，B為20 mmol/L甲酸銨溶液（含0.1%甲酸）；流速：0.4 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：2 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI+）；檢測方式：多重反應(yīng)監(jiān)測模式；干燥氣（氮氣）溫度：300 ℃；干燥氣（氮氣）流量：10 L/min；霧化氣（氮氣）壓力：35 psi；鞘氣溫度：300 ℃；鞘氣（氮氣）流量：11 L/min；毛細(xì)管電壓：3 500 V；監(jiān)測離子對和質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 3 種代謝調(diào)節(jié)劑檢測的質(zhì)譜條件Table 2 Mass spectrometric parameters for three metabolic regulators

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用MultiQuant 3.0.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對樣品中的3 種代謝調(diào)節(jié)劑進行超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析、數(shù)據(jù)采集和處理，采用Origin 2023進行統(tǒng)計計算和圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別將100 μg/L單一標(biāo)準(zhǔn)溶液注入離子源，進行一級質(zhì)譜全掃描，在最佳碎裂電壓下確認(rèn)目標(biāo)化合物的母離子m/z值，然后進行二級質(zhì)譜優(yōu)化，優(yōu)化碰撞能量，對碎片離子進行全掃描，選取響應(yīng)最強與次強的碎片離子作為定量和定性離子[15]。

實驗發(fā)現(xiàn)所有被測物均在ESI+下具有較強的信號值，3 種代謝調(diào)節(jié)劑均可獲得較高豐度的[M+H]+峰。在優(yōu)化干燥氣溫度、干燥氣流量、霧化氣壓力、鞘氣溫度、毛細(xì)管電壓等離子源條件后，得到質(zhì)譜條件參數(shù)，結(jié)果見表2。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 色譜柱選擇

本研究考察了ACQUITY UPLC BEH C18（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC BEH HILIC（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）和ACQUITY UPLC BEH Amide（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）3 種色譜柱對待測化合物的分離效果。在同一流動相條件下，美度銨在C18色譜柱出峰速度過快，峰形較差，且易被內(nèi)源性雜質(zhì)（如乙酰膽堿同位素、賴氨酸和谷氨酸等）干擾[12]；采用HILIC柱，美度銨出峰時間靠后，峰形較寬；而采用Amide柱，3 種目標(biāo)物出峰時間、峰形和分離度均可以滿足要求。因此，最終選擇ACQUITY UPLC BEH Amide（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）作為目標(biāo)物分離的色譜柱，美度銨在C18柱、Amide柱和HILIC柱上的色譜峰比較見圖1。

圖1 美度銨在C18柱（A）、Amide柱（B）和HILIC柱（C）上的色譜峰比較Fig.1 Comparison of chromatographic peaks of meldonium on C18 (A),Amide (B) and HILIC (C) columns

2.2.2 流動相的選擇

選擇乙腈作為流動相的有機相，并加入0.1%甲酸優(yōu)化峰形。考察5 mmol/L甲酸銨（含0.1%甲酸）、10 mmol/L甲酸銨（含0.1%甲酸）、20 mmol/L甲酸銨（含0.1%甲酸）、50 mmol/L甲酸銨（含0.1%甲酸）4 種不同濃度的甲酸銨溶液作為流動相對3 種物質(zhì)的分離效果影響，結(jié)果表明4 種溶液均能達(dá)到目標(biāo)物出峰、分離的要求，綜合考慮峰形、對稱度及流動相含鹽量，本方法選擇20 mmol/L甲酸銨（含0.1%甲酸）溶液作為流動相的水相。3 種化合物的總離子流色譜圖見圖2。

圖2 3 種代謝調(diào)節(jié)劑標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流色譜圖Fig.2 Total ion current chromatograms of mixed standard solution of three metabolic regulators

2.3 提取條件優(yōu)化

目前針對該類物質(zhì)的提取溶劑有甲醇、甲醇-水、乙腈、乙腈-水等。乙腈具有沉淀蛋白、與油脂相容性較差等特點[16]，本研究選擇乙腈作為基礎(chǔ)提取溶劑，分別用乙腈、0.5%甲酸-乙腈、1%甲酸-乙腈、2%甲酸-乙腈、5%甲酸-乙腈、6%甲酸-乙腈對豬肉中3 種代謝調(diào)節(jié)劑的提取效率進行考察，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，乙腈中加入甲酸可提高3 種目標(biāo)物的提取效率，且隨甲酸含量增加美度銨的提取效率明顯提高，甲酸體積分?jǐn)?shù)大于5%后，提取效率無明顯變化。本研究選擇5%甲酸-乙腈作為提取溶劑。

圖3 5 種提取溶劑的提取效率對比Fig.3 Comparison of extraction efficiencies of five solvents

2.4 凈化方式優(yōu)化

由于食品中含有大量脂溶性雜質(zhì)、色素等干擾物，容易干擾儀器檢測，因此選擇適宜的凈化方式對方法的建立尤為關(guān)鍵。目前主流的凈化方式有固相萃取小柱[17-18]、QuEChERS[19-21]、液液分散萃取[22]等凈化方式。本研究分別考察了QuEChERS（C18100 mg+乙二胺-N-丙基硅烷（primary second amine，PSA）硅膠100 mg+石墨化碳50 mg）、安捷倫Elut凈化包和PRiME HLB小柱（200 mg/6 mL）的凈化效果，以豬肉為基質(zhì)的凈化效果見圖4。結(jié)果表明，3 種凈化方式對氯米芬的回收率影響差別不大。而采用QuEChERS和安捷倫Elut凈化包兩種凈化方式時，曲美他嗪回收率大于120%；由于內(nèi)源性的雜質(zhì)干擾嚴(yán)重[12]，采用QuEChERS方式凈化時，美度銨回收率甚至大于200%。PRiME HLB小柱填料是一種新型的反相固相萃取吸附劑，具有免活化，操作簡單，能有效去除蛋白、鹽、磷脂等95%以上的基質(zhì)干擾物，使樣品基質(zhì)效應(yīng)更小等優(yōu)點[23-25]。本研究在采用PRiME HLB小柱凈化時，美度銨的內(nèi)源性雜質(zhì)干擾信號明顯降低，3 種目標(biāo)物的回收率在80%～110%之間，均滿足GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范》對回收率的要求。因此采用PRiME HLB小柱作為本研究的凈化方式。

圖4 不同凈化方式的回收率對比Fig.4 Comparison of recoveries of different purification methods

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

使用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測食品過程中可能帶入不同程度的基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)的存在直接影響到檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性[26-29]，因此本研究將對所建立方法的基質(zhì)效應(yīng)進行評估。

稱取適量份數(shù)的17 種空白基質(zhì)樣品，除不加入同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液外均按照1.3.2節(jié)獲取空白樣品提取液。分別使用空白樣品提取液和90%乙腈-水溶液（含0.1%甲酸）按照1.3.1.3節(jié)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值考察3 種代謝調(diào)節(jié)劑的基質(zhì)效應(yīng)。若基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值在0.85～1.15之間，則認(rèn)為不存在基質(zhì)效應(yīng)的影響，反之則存在基質(zhì)效應(yīng)。3 種目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見圖5。結(jié)果表明在17 種基質(zhì)中3 種代謝調(diào)節(jié)劑均存在較大的基質(zhì)效應(yīng)，因此本研究采用同位素內(nèi)標(biāo)法做定量分析，從而減少基質(zhì)效應(yīng)對實際樣品測定的干擾。

圖5 基質(zhì)效應(yīng)考察Fig.5 Evaluation of matrix effect

2.6 線性關(guān)系、檢出限與定量限

采取在空白試樣中逐級降低加標(biāo)濃度的方式確定3 種代謝調(diào)節(jié)劑的檢出限和定量限。同時在不同基質(zhì)中加入檢出限和定量限水平的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按照1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)的方法進行檢測。結(jié)果表明不同基質(zhì)中檢出限水平的各代謝調(diào)節(jié)劑其定性離子對、定量離子對信噪比均大于3；定量限水平的各代謝調(diào)節(jié)劑其定性離子對、定量離子對信噪比均大于10。氯米芬和曲美他嗪在1.0～40.0 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；美度銨在5.0～200.0 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。相關(guān)結(jié)果見表3。

表3 3 種被測物對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)化合物、線性范圍、線性方程、決定系數(shù)、檢出限及定量限Table 3 Internal standards,linear ranges,linear equations,determination coefficients (R2),limits of detection and limits of quantification of three metabolic regulators

2.7 方法回收率與精密度

依據(jù)GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》，分別稱取豬肉、肉腸、牛肉、培根、雞肉、牛奶、酸奶、奶酪、雞蛋、鹵蛋、花鰱、扇貝、淡水蝦、豆瓣醬、蠔油、雞精、菜籽油空白基質(zhì)樣品，按照定量限、2 倍定量限和10 倍定量限進行3水平添加實驗（n＝6），按照1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)方法進行樣品處理和檢測，考察所確定方法的回收率和精密度[30]。如表4所示，本方法的平均回收率在81.3%～100.7%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在0.3%～6.1%之間。

表4 方法加標(biāo)回收率及RSD（n ＝6）Table 4 Recoveries and RSDs of the developed method (n=6)

2.8 實際樣品測試

采用本方法對購自于市場的畜禽肉及含畜禽肉制品、水產(chǎn)品及含水產(chǎn)制品、蛋及含蛋制品、奶及含奶制品、植物油及含植物油制品以及烹調(diào)調(diào)味料等共100余批次樣品進行3 種代謝調(diào)節(jié)劑的檢測，均未檢出陽性樣品。

3 結(jié)論

本研究建立了通過式固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的檢測方法，分別對前處理方法、色譜和質(zhì)譜條件進行優(yōu)化，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測，同時測定食品中的氯米氛、曲美他嗪和美度銨。該方法具有靈敏度高、普適性強、操作簡便等優(yōu)點，可為體育賽事的食品保障工作提供有效的技術(shù)支撐。