充氮包裝對(duì)冷藏過(guò)程中黃顙魚(yú)鮮度、微生物菌群及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

王菊元，張 毅，劉婷婷，艾有偉，韓婭紅，侯溫甫,2,*

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.湖北省荊楚特色食品產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，湖北 荊州 434000）

黃顙魚(yú)（Pelteoobagrus fulidraco）俗稱嘎牙子、黃姑、黃臘丁、黃鰭魚(yú)等，廣泛分布于長(zhǎng)江、黃河、珠江等流域，因其肉質(zhì)細(xì)嫩、無(wú)肌間刺、味道鮮美、無(wú)鱗片且營(yíng)養(yǎng)豐富、藥用價(jià)值高而備受消費(fèi)者歡迎[1]。然而黃顙魚(yú)極易品質(zhì)下降和腐敗變質(zhì)[2]，從而造成經(jīng)濟(jì)損失。因此，有必要開(kāi)發(fā)一種保鮮技術(shù)保障黃顙魚(yú)品質(zhì)并延長(zhǎng)其貨架期。氣調(diào)包裝是一種通過(guò)調(diào)節(jié)包裝中氣體的成分和比例[3]，最大程度保障食品品質(zhì)的新型保鮮技術(shù)，能避免低溫保藏的保鮮時(shí)效短和化學(xué)保鮮易危害人體健康的缺點(diǎn)，具有操作簡(jiǎn)便、保鮮時(shí)效長(zhǎng)和綠色高效的優(yōu)點(diǎn)，在水產(chǎn)品保鮮領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[4]。雖然氣調(diào)包裝應(yīng)用于水產(chǎn)品的保鮮與包裝方面的研究較多，但主要側(cè)重于三文魚(yú)[5]、帶魚(yú)[6]和大黃魚(yú)[7]等海水魚(yú)，而關(guān)于淡水魚(yú)的研究相對(duì)較少，對(duì)于黃顙魚(yú)是否起到類似效果有待于研究。此外，黃顙魚(yú)是一種肉質(zhì)細(xì)嫩、無(wú)肌間刺和鱗片的淡水魚(yú)，其基質(zhì)蛋白含量少，將氣調(diào)包裝應(yīng)用于黃顙魚(yú)的保鮮與包裝具有良好的實(shí)踐價(jià)值，此方面尚鮮見(jiàn)報(bào)道。

N2是氣調(diào)包裝中最常用的氣體，價(jià)格低廉，使用安全[8]，已被用于延長(zhǎng)三文魚(yú)[9]和金槍魚(yú)[10]等貨架期。目前研究主要側(cè)重于氣調(diào)包裝對(duì)水產(chǎn)品鮮度的影響，而水產(chǎn)品鮮度變化與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)以及微生物菌群息息相關(guān)，探討充氮包裝對(duì)黃顙魚(yú)冷藏過(guò)程中微生物菌群和風(fēng)味物質(zhì)的影響，有利于明晰充氮包裝在冷鮮魚(yú)肉中應(yīng)用的價(jià)值以及可以進(jìn)一步明晰其保鮮機(jī)理，目前鮮有相關(guān)研究報(bào)道。

近年來(lái)，新興的高通量測(cè)序技術(shù)因其高效性和準(zhǔn)確性常被用于研究魚(yú)類貯藏期間微生物菌群的變化。Zheng Ruihang等[11]發(fā)現(xiàn)在0 ℃冷鏈物流運(yùn)輸環(huán)境下馬鮫魚(yú)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌（specific spoilage organism，SSO）為假單胞菌屬。Cao Rong等[12]利用高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)嗜冷桿菌在經(jīng)高壓處理后的腐敗牡蠣中比例較高，而交替假單胞菌和希瓦氏菌在未經(jīng)高壓處理過(guò)的腐敗牡蠣中占據(jù)主導(dǎo)地位。Huang Wenbo等[13]發(fā)現(xiàn)在4 ℃貯藏期環(huán)境下雜交石斑魚(yú)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌為假單胞菌，而且假單胞菌的生長(zhǎng)和繁殖會(huì)產(chǎn)生2-乙基-1-己醇、3-甲基-1-丁醇等物質(zhì)，從而導(dǎo)致魚(yú)類的異味[14]。此外，其余微生物也會(huì)在魚(yú)類腐敗過(guò)程中產(chǎn)生具有特殊氣味的含氮化合物、醛、酮和酯等化合物[14-16]。因此，研究充氮包裝對(duì)黃顙魚(yú)冷藏過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和微生物菌群的內(nèi)在聯(lián)系，有利于闡明充氮包裝的作用機(jī)制。此外，氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）是檢測(cè)揮發(fā)性有機(jī)化合物的一種新興的分析方法，具有快速、靈敏和便捷等優(yōu)勢(shì)，已被用于分析大菱鲆[17]、鰱魚(yú)[18]、海參肽[19]和鱘魚(yú)[20]貯藏過(guò)程中揮發(fā)性成分的變化。利用GCIMS技術(shù)探究充氮包裝對(duì)黃顙魚(yú)冷藏過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響具有重要意義，尚鮮見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)選用黃顙魚(yú)作為研究對(duì)象，現(xiàn)場(chǎng)宰殺后放入碎冰中，在30 min內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。以白度、pH值、總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值、菌落總數(shù)、代謝酶活力、感官評(píng)價(jià)來(lái)表征黃顙魚(yú)的鮮度品質(zhì)，通過(guò)高通量測(cè)序分析了充氮包裝對(duì)黃顙魚(yú)冷藏期間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，同時(shí)利用GC-IMS技術(shù)分析充氮包裝對(duì)黃顙魚(yú)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，并對(duì)微生物和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。本研究結(jié)果可為充氮包裝延長(zhǎng)黃顙魚(yú)貨架期提供參考依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃顙魚(yú)購(gòu)自湖北省武漢市東西湖區(qū)常青花園商量販超市。

平板計(jì)數(shù)瓊脂 青島海博生物技術(shù)有限公司；糖原、乳酸、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）測(cè)定試劑盒 南京建成試劑有限公司；其余試劑均為分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌器、HRP-9082MBE型電熱恒溫箱上海博迅公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)蘇州凈化公司；HBM-400D系列樣品均質(zhì)器 天津恒奧公司；XHF-D高速分散器（內(nèi)切式勻漿機(jī)）寧波新芝生物科技公司；ST2100型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)、CP214（C）型電子天平 奧康斯儀器（常州）有限公司；LRH-100C型低溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FlavourSpec?型GC-IMS儀 德國(guó)G.A.S.公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

購(gòu)買49 條質(zhì)量約300 g、體長(zhǎng)約25 cm的黃顙魚(yú)，現(xiàn)場(chǎng)宰殺后放入裝有碎冰泡沫箱中，在30 min內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。在無(wú)菌切割室將黃顙魚(yú)用清水沖洗干凈，瀝干水分，隨機(jī)分成兩組。第1組為非充氮組，將黃顙魚(yú)放置在包裝盒上覆上保鮮膜進(jìn)行包裝；第2組為充氮組，將黃顙魚(yú)放置在包裝盒中充入100%氮?dú)膺M(jìn)行包裝。所有樣品包裝完成后置于4 ℃環(huán)境下冷藏9 d，其中冷藏第0天的黃顙魚(yú)樣品編號(hào)為F_0；冷藏第3、5、7、9天的非充氮包裝組的黃顙魚(yú)樣品分別命名為P_3、P_5、P_7、P_9；冷藏第3、5、7、9天的充氮包裝組的黃顙魚(yú)樣品分別命名為M_3、M_5、M_7和M_9。

1.3.2 指標(biāo)測(cè)定

1.3.2.1 白度

使用CR-400色差計(jì)分別測(cè)定樣品的亮度（L*值）、紅度（a*值）和黃度（b*值），每個(gè)樣品至少測(cè)定5 個(gè)位點(diǎn)，取平均值。按下式計(jì)算白度：

1.3.2.2 pH值

參照GB 5009.237—2016《食品pH值的測(cè)定》方法測(cè)定pH值。

1.3.2.3 TVB-N值

按GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》中的半微量定氮法測(cè)定TVB-N值。

1.3.2.4 菌落總數(shù)

參考GB/T 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》測(cè)定菌落總數(shù)。

1.3.2.5 代謝酶水平

采用相應(yīng)試劑盒并根據(jù)其說(shuō)明測(cè)定PK、LDH和CK 3 種代謝酶的活力。

1.3.2.6 感官評(píng)價(jià)

參考Ozogul等[21]的方法并略作修改。由5 名受過(guò)專業(yè)培訓(xùn)的感官評(píng)定人員對(duì)黃顙魚(yú)的氣味、顏色、黏液、肌肉組織和彈性進(jìn)行評(píng)分，其中10 分為最優(yōu)品質(zhì)，分?jǐn)?shù)越高表明黃顙魚(yú)品質(zhì)越好。

1.3.2.7 質(zhì)構(gòu)特性

魚(yú)肉切成1 cm×2 cm×2 cm的長(zhǎng)方塊狀，探頭類型為P 100，測(cè)試前探頭下降速率2 mm/s，測(cè)試速率1 mm/s，測(cè)試后探頭回程速率5 mm/s。選用與魚(yú)肉質(zhì)構(gòu)相關(guān)的硬度、咀嚼性、彈性及回復(fù)力4 個(gè)參數(shù)進(jìn)行研究。每組平行3 次，取平均值。

1.3.2.8 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

頂空進(jìn)樣條件：孵化溫度60 ℃；孵化時(shí)間15 min；進(jìn)樣方式為頂空進(jìn)樣；加熱方式為振蕩加熱；進(jìn)樣針溫度60 ℃。

GC-IMS條件：色譜柱溫度40 ℃；載氣為高純度N2；載氣流速程序：初始流速5.0 mL/min，保持3 min，8 min內(nèi)線性升至50.0 mL/min，5 min內(nèi)線性升至150.0 mL/min，保持3 min；總運(yùn)行時(shí)間為19 min。漂移管溫度45 ℃；漂移氣為高純度N2；漂移氣流速150 mL/min。

取3.0 g樣品，放入20.0 mL頂空進(jìn)樣瓶中，經(jīng)頂空進(jìn)樣，用FlavourSpec? GC-IMS儀進(jìn)行測(cè)試。

1.3.2.9 微生物群落檢測(cè)

每組樣品在每個(gè)取樣點(diǎn)取3 份平行樣品。在無(wú)菌超凈工作臺(tái)中，用無(wú)菌棉簽蘸取無(wú)菌生理鹽水將魚(yú)的體表全部擦拭一遍，將棉簽裝入10 mL滅菌離心管后液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆?。后續(xù)送至生物公司，基于二代測(cè)序平臺(tái)，采用338F和806R引物對(duì)16S功能基因V3～V4區(qū)段聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)生物云平臺(tái)進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

所有指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3 次,記錄數(shù)據(jù)后采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，利用單因素方差分析中的Duncan多重比較法進(jìn)行差異性比較，結(jié)果以表示，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 充氮包裝對(duì)冷藏過(guò)程中黃顙魚(yú)理化指標(biāo)的影響

白度可以量化色澤變化，主要與肌肉的組織結(jié)構(gòu)、亞鐵血紅素和結(jié)合水含量有關(guān)[22]。魚(yú)肉的白度變化會(huì)影響水產(chǎn)品的感官品質(zhì)及鮮度，影響消費(fèi)者對(duì)魚(yú)肉的接受度[23-24]。由表1可以看出，在冷藏過(guò)程中，兩組樣品的白度值均有上升趨勢(shì)。充氮包裝組白度上升趨勢(shì)緩慢，且在冷藏第7天和第9天白度顯著低于非充氮組，說(shuō)明充氮包裝能減緩白度的變化，對(duì)貯藏過(guò)程中黃顙魚(yú)的白度有維持作用。魚(yú)肉的白度與魚(yú)體內(nèi)的水分和脂肪氧化程度有關(guān)[25]。充氮包裝對(duì)黃顙魚(yú)的白度有維持作用可能是因?yàn)槌淙氲牡獨(dú)庑纬傻牡脱醐h(huán)境抑制了微生物生長(zhǎng)繁殖和脂肪氧化。

表1 黃顙魚(yú)在冷藏過(guò)程中白度、pH值、TVB-N值和菌落總數(shù)的變化Table 1 Changes in whiteness,pH,TVB-N and TBC of P.fulvidraco during cold storage

pH值的變化也可以在一定程度上反映水產(chǎn)品的新鮮度。由表1可知，充氮組在冷藏期間pH值基本保持穩(wěn)定，且在貯藏期間pH值均低于非充氮組，這可能是因?yàn)槌淙氲獨(dú)庑纬傻牡脱醐h(huán)境，有助于乳酸的積累。乳酸菌產(chǎn)生的乳酸對(duì)pH值的降低有一定的貢獻(xiàn)。此外，魚(yú)死后肌肉組織進(jìn)行糖酵解生產(chǎn)乳酸，也會(huì)導(dǎo)致黃顙魚(yú)的pH值下降。

TVB-N值是評(píng)價(jià)水產(chǎn)品鮮度的理化指標(biāo)之一[26]，三甲胺、二甲胺、氨和其他揮發(fā)性堿性含氮化合物是TVB-N的主要成分[27]。在貯藏前5 d，兩組黃顙魚(yú)的TVB-N值變化不大。在貯藏7 d后，兩組黃顙魚(yú)TVB-N值均開(kāi)始急劇上升，并且非充氮組增長(zhǎng)速度比充氮組快。非充氮組樣品在貯藏第9天的TVB-N值為28.00 mg/100 g，遠(yuǎn)超于GB 2733—2015《鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品》規(guī)定淡水魚(yú)蝦的TVB-N值不大于20 mg/100 g的要求。而在貯藏第9天時(shí)充氮組的TVB-N值僅為16.31 mg/100 g，未超國(guó)家限定標(biāo)準(zhǔn)。這表明高氮環(huán)境能夠抑制TVB-N的產(chǎn)生，保障黃顙魚(yú)的品質(zhì)，延長(zhǎng)保質(zhì)期。

菌落總數(shù)是判斷魚(yú)肉新鮮度的重要指標(biāo)。黃顙魚(yú)的初始菌落總數(shù)為3.29（lg（CFU/g）），兩組黃顙魚(yú)菌落總數(shù)均隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。充氮組在整個(gè)貯藏期間黃顙魚(yú)的菌落總數(shù)始終低于非充氮組，貯藏第9天時(shí)，充氮組黃顙魚(yú)的菌落總數(shù)為7.99（lg（CFU/g）），低于非充氮組（8.48（lg（CFU/g））），說(shuō)明充氮包裝能抑制微生物的生長(zhǎng)，有利于延長(zhǎng)黃顙魚(yú)的貨架期。

2.2 充氮包裝對(duì)冷藏過(guò)程中黃顙魚(yú)代謝酶活力的影響

LDH活力變化可作為檢測(cè)魚(yú)肉變質(zhì)，尤其是早期變質(zhì)程度的重要指標(biāo)[28]。已有研究表明LDH是能量代謝中參與糖酵解的一種關(guān)鍵酶，在淡水魚(yú)中具有較高活力，其活力變化將直接影響機(jī)體的能量代謝，而且與淡水魚(yú)剪切力、白度等加工品質(zhì)密切相關(guān)[29-30]。因此，本研究測(cè)定了充氮包裝對(duì)LDH以及其他兩種糖酵解相關(guān)的限速酶的影響。如圖1所示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，充氮組和非充氮組黃顙魚(yú)中PK、LDH和CK活力的變化趨勢(shì)基本一致，CK活力先上升后下降，LDH和PK活力呈波動(dòng)式下降。值得注意的是，非充氮組和充氮組CK活力在整個(gè)貯藏期間均沒(méi)有顯著差異。兩組黃顙魚(yú)PK活力在第1天和第3天出現(xiàn)顯著差異，LDH活力在第1天和第5天出現(xiàn)顯著差異，但這并不足以說(shuō)明充氮包裝會(huì)對(duì)酶的活力造成影響。LDH和CK是與能量代謝有關(guān)的重要酶，其較高活力有助于糖酵解的順利進(jìn)行和延緩pH值的下降[31]，其波動(dòng)變化可能與糖及乳酸等能量物質(zhì)的波動(dòng)變化有關(guān)。曹麗[32]研究也表明，牛宰后里脊部位的糖原顯著下降后輕微上升然后趨于穩(wěn)定，這可能是由于微生物的生長(zhǎng)所致。綜上所述，充氮包裝沒(méi)有對(duì)冷藏過(guò)程中黃顙魚(yú)代謝酶活力產(chǎn)生影響，酶活力在冷藏期間的變化和兩組之間的差異可能與微生物的生長(zhǎng)以及代謝密切相關(guān)。

圖1 黃顙魚(yú)在冷藏過(guò)程中PK（A）、LDH（B）和CK（C）活力的變化Fig.1 Changes in activities of PK (A),LDH (B) and CK (C) in P.fulvidraco during cold storage

2.3 充氮包裝對(duì)冷藏過(guò)程中黃顙魚(yú)感官評(píng)價(jià)的影響

冷藏期間黃顙魚(yú)的感官評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)圖2所示。第0天，兩組黃顙魚(yú)均表現(xiàn)出優(yōu)異的感官品質(zhì)，獲得較高的感官評(píng)分。整個(gè)冷藏過(guò)程中，充氮組的黃顙魚(yú)在顏色、黏液、彈性和肌肉組織方面的得分均高于非充氮組。在冷藏第5天時(shí)非充氮組黃顙魚(yú)的顏色、黏液和彈性評(píng)分低于6 分的限值，已經(jīng)視為感官“不可接受”，而充氮組在第7天黏液、彈性的評(píng)分才超過(guò)限值。這說(shuō)明充氮包裝能在一定程度上延緩黃顙魚(yú)感官品質(zhì)劣變。基于感官評(píng)價(jià)指標(biāo)可判斷，非充氮組和充氮組黃顙魚(yú)的貨架期分別為3 d和5 d，充氮處理將冷鮮黃顙魚(yú)的貨架期延長(zhǎng)了2 d左右。

圖2 黃顙魚(yú)在冷藏過(guò)程中氣味（A）、顏色（B）、黏液（C）、肌肉組織（D）和彈性（E）的感官評(píng)分變化Fig.2 Sensory scoring changes in smell (A),color (B),mucus (C),muscle tissue (D),and elasticity (E) of P.fulvidraco during cold storage

綜合考慮感官、微生物和TVB-N指標(biāo)，非充氮包裝黃顙魚(yú)貨架期為3 d左右，充氮包裝能減緩黃顙魚(yú)的品質(zhì)劣變，將貨架期延長(zhǎng)至5 d。

2.4 充氮包裝對(duì)冷藏過(guò)程中黃顙魚(yú)質(zhì)構(gòu)特性的影響

如表2所示，在4 ℃貯藏條件下，充氮組的魚(yú)肉硬度高于非充氮組，這可能是由于在微生物和酶的作用下，魚(yú)體肌肉組織不斷分解，導(dǎo)致魚(yú)肉變軟，硬度降低，而充氮組包裝盒中沒(méi)有氧氣，會(huì)抑制微生物和酶的活性。此外，在貯藏期間，兩組黃顙魚(yú)肉的咀嚼性、彈性和回復(fù)性均出現(xiàn)不同程度的下降，這可能是魚(yú)肉中的蛋白質(zhì)發(fā)生腐敗使肌肉組織被破壞造成的。上述分析表明，在4 ℃貯藏過(guò)程中，充氮包裝能在一定程度上延緩黃顙魚(yú)的腐敗變質(zhì)。

表2 黃顙魚(yú)在冷藏過(guò)程中質(zhì)構(gòu)特性的變化Table 2 Changes in texture characteristics of P.fulvidraco during cold storage

2.5 充氮包裝對(duì)冷藏過(guò)程中黃顙魚(yú)微生物菌群的影響

充氮組和非充氮組的黃顙魚(yú)微生物在門水平上的群落分布如圖3A所示。新鮮黃顙魚(yú)中最主要的微生物是變形菌門（Proteobacteria，21.3%）、擬桿菌門（Bacteroidota，26.0%）和厚壁菌門（Firmicutes，20.3%）。與初始黃顙魚(yú)樣品相比，在冷藏第3天，非充氮組和充氮組樣品中變形菌門和擬桿菌門比例有所上升。在冷藏的過(guò)程中，變形菌門迅速發(fā)展成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，在冷藏第9天，充氮組和非充氮組樣品中變形菌門分別占到細(xì)菌總數(shù)的90.6%和93.0%。

圖3 黃顙魚(yú)在門水平（A）和屬水平（B）上微生物群落組成Fig.3 Microbial community composition in P.fulvidraco at phylum (A)and genus (B) levels

在屬分類水平上分析充氮組和非充氮組的黃顙魚(yú)微生物群落結(jié)構(gòu)差異，其中主要優(yōu)勢(shì)菌的豐度差異如圖3B所示。黃顙魚(yú)貯藏第0天主要優(yōu)勢(shì)菌是黃桿菌屬（Flavobacterium，11.3%）、未分類的絨毛桿菌科（Muribaculaceae，5.9%）、紅育菌屬（Rhodoferax，3.3%）和乳桿菌屬（Lactobacillus，3.0%）。冷藏第3天，充氮組黃顙魚(yú)樣品的主要優(yōu)勢(shì)菌是黃桿菌屬（45.4%）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter，14.7%）和氣單胞菌屬（Aeromonas，22.7%），非充氮組黃顙魚(yú)樣品的主要優(yōu)勢(shì)菌是黃桿菌屬（40.0%）、不動(dòng)桿菌屬（35.7%）和假單胞菌屬（Pseudomonas，5.9%），充氮組中假單胞菌和不動(dòng)桿菌的占比明顯低于非充氮組。冷藏第9天，充氮組和非充氮組黃顙魚(yú)樣品的主要優(yōu)勢(shì)菌均為假單胞菌屬（分別為36.4%和43.2%）和不動(dòng)桿菌屬（分別為41.7%和37.9%）。從菌落組成結(jié)果可以看出，充氮組在冷藏第3天對(duì)黃顙魚(yú)樣品中的微生物組成產(chǎn)生了很大影響，隨后不動(dòng)桿菌屬和假單胞菌屬的比例隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。值得注意的是，黃桿菌屬雖然在貯藏第3天成為兩組樣品中的優(yōu)勢(shì)菌，但是在腐敗樣品中的比例大幅下降，表明其在冷藏過(guò)程中不如假單胞菌和不動(dòng)桿菌有競(jìng)爭(zhēng)力。

圖4顯示了聚類熱圖分析的結(jié)果，類間距離為0.5。選取豐度前25的細(xì)菌屬的操作分類單元、數(shù)據(jù)繪制熱圖。根據(jù)聚類熱圖可以將樣品分為4 類：1）0 d樣品；2）充氮組3 d樣品；3）非充氮組3 d樣品；4）充氮組和非充氮組第9天樣品。充氮組和非充氮組在貯藏第9天的樣品可聚為一類，而充氮組和非充氮組在貯藏第3天的樣品可聚為兩類。這一結(jié)果表明，充氮包裝對(duì)冷藏3 d的黃顙魚(yú)菌群結(jié)構(gòu)影響更為顯著。

圖4 黃顙魚(yú)在冷藏過(guò)程中微生物群落組成聚類熱圖Fig.4 Heatmap of microbial community composition in P.fulvidraco during cold storage

采用t檢驗(yàn)分析第3天充氮組和非充氮組微生物群落的顯著性變化（圖5）。結(jié)果表明，高濃度氮?dú)鈱?duì)黃顙魚(yú)中的不動(dòng)桿菌屬有極顯著抑制作用（P＜0.01），對(duì)氣單胞菌屬和紅育菌屬也有顯著影響（P＜0.05）。

圖5 黃顙魚(yú)中微生物群落的t檢驗(yàn)分析Fig.5 t-Test analysis of microbial community in P.fulvidraco

2.6 充氮包裝對(duì)冷藏過(guò)程中黃顙魚(yú)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

黃顙魚(yú)在冷藏過(guò)程中共檢測(cè)出47 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包含7 類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)：醇類10 種、醛類5 種、酸類7 種、酯類8 種、酮類8 種、芳香族化合物1 種以及雜環(huán)化合物8 種（表3）。為進(jìn)一步比較氮?dú)鈱?duì)黃顙魚(yú)貯藏過(guò)程中揮發(fā)性有機(jī)化合物的影響，用G.A.S.公司開(kāi)發(fā)的LAV軟件的Gallery Plot插件選取圖中待分析區(qū)域，自動(dòng)生成指紋圖譜（圖6）。圖6縱坐標(biāo)代表黃顙魚(yú)樣品，橫坐標(biāo)為黃顙魚(yú)樣品中全部揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)（與表3中的揮發(fā)性組分編號(hào)對(duì)應(yīng)），紅色越深，表明該揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量越多，藍(lán)色越深，說(shuō)明該揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量越少。如圖6所示，充氮包裝組在貯藏后期揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量明顯低于非充氮包裝組，說(shuō)明充氮包裝可以抑制部分揮發(fā)性物質(zhì)的產(chǎn)生。

圖6 黃顙魚(yú)冷藏過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的指紋圖譜Fig.6 Fingerprints of volatile components in P.fulvidraco during cold storage

表3 黃顙魚(yú)揮發(fā)性組分的定性Table 3 Volatile components in P.fulvidraco identified by GC-IMS

由表3可知，黃顙魚(yú)中主要揮發(fā)性化合物為醇類、醛類、酯類和酮類。2-辛醇、3-甲基-1-丁醇、2-糠基硫醇、4-甲基-1-戊醇主要出現(xiàn)在非充氮組冷藏第9天，充氮組中僅有微量檢出。其中，3-甲基-1-丁醇是微生物來(lái)源的揮發(fā)性有機(jī)化合物，與變質(zhì)肉和雞胴體中的假單胞菌、希瓦氏菌和環(huán)絲菌代謝有關(guān)[33]。在去內(nèi)臟海鱸中也檢測(cè)到了3-甲基-1-丁醇，其含量在貯藏過(guò)程中增加，有作為化學(xué)腐敗標(biāo)志物的潛力[34]，充氮包裝可以一定程度抑制與腐敗相關(guān)的醇類物質(zhì)產(chǎn)生。醛類主要是由各種微生物分解代謝氨基酸形成的，非充氮組中3-甲基丁醛、丁醛、壬醛的含量明顯高于充氮組。3-甲基丁醛是以亮氨酸為前體物質(zhì)產(chǎn)生的，是一種奶酪和辛辣的蘋(píng)果味[33]。據(jù)報(bào)道，3-甲基丁醛與冰藏蝦中交替假單胞菌的作用有關(guān)[32]，并且被認(rèn)為是海鯛魚(yú)片和熏鮭魚(yú)的潛在腐敗標(biāo)志物[34-35]。充氮包裝延緩了與腐敗相關(guān)的醛類物質(zhì)產(chǎn)生。海鮮中酮的存在主要與假單胞菌、交替假單胞菌和嗜冷桿菌的作用有關(guān)[35-36]。2-辛酮、2-戊酮、2-甲基-3-庚酮、3-羥基-2-丁酮在非充氮組的含量高于充氮組。有研究表明，3-羥基-2-丁酮與各種腐敗菌的代謝活性有關(guān)，其形成來(lái)自肉桿菌屬和乳酸桿菌屬的葡萄糖分解代謝[33]。這說(shuō)明充氮包裝可以有效抑制與腐敗相關(guān)的酮類物質(zhì)產(chǎn)生。酯是魚(yú)肉中最主要的化合物之一，其形成與醇和羧酸的酯化以及微生物酯酶活性有關(guān)[33]。乙酸乙酯是魚(yú)類中最常見(jiàn)的酯，交替假單胞菌屬和假單胞菌能夠在許多底物中產(chǎn)生這種化合物[36]。其中，假單胞菌被認(rèn)為是酯生產(chǎn)的重要貢獻(xiàn)者，并在感官評(píng)價(jià)中發(fā)揮重要作用[37]。乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸異丁酯在非充氮組的含量高于充氮組，充氮包裝也能抑制與腐敗相關(guān)的酯類的產(chǎn)生。綜上所述，充氮包裝可以抑制黃顙魚(yú)在冷藏過(guò)程中與腐敗相關(guān)的醇、醛、酮和酯的產(chǎn)生。

2.7 微生物群落與揮發(fā)性化合物的內(nèi)在聯(lián)系

偏最小二乘判別分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA）是一種有監(jiān)督的統(tǒng)計(jì)分析方法，對(duì)數(shù)據(jù)降維的同時(shí)建立回歸模型，并對(duì)回歸結(jié)果進(jìn)行判別分析。相比于主成分分析法，PLS-DA法更能量化特征化合物造成組分差異的程度[38-39]。利用黃顙魚(yú)揮發(fā)性風(fēng)味組分的信號(hào)峰強(qiáng)度進(jìn)行PLS-DA建模，如圖7所示，RX2為0.906，Q2為0.389，說(shuō)明該模型對(duì)不同黃顙魚(yú)樣品具有良好的穩(wěn)定性和較好的預(yù)測(cè)能力。從樣本的聚集、離散程度可知，當(dāng)冷藏時(shí)間在3 d以內(nèi)，黃顙魚(yú)樣本分布很聚集，表明在相同冷藏時(shí)間內(nèi)非充氮組和充氮組黃顙魚(yú)樣本整體風(fēng)味比較相近。當(dāng)冷藏時(shí)間超過(guò)3 d時(shí)，非充氮組和充氮組黃顙魚(yú)樣本存在明顯的區(qū)間分布，表明這些樣品中所含有的化合物的組成和含量開(kāi)始出現(xiàn)較大差異，這與圖6所示的結(jié)果完全一致。

圖7 不同黃顙魚(yú)樣品的PLS-DA得分圖Fig.7 PLS-DA score plot of different P.fulvidraco samples

基于P L S-D A 模型分析結(jié)果的變量重要性投影（variable important for the projection，VIP）值可以量化PLS-DA的每個(gè)變量對(duì)分類的貢獻(xiàn)，以VIP值大于1表示該變量在判別過(guò)程中起到重要作用。VIP值越大，變量在不同黃顙魚(yú)樣品間的差異越顯著[35]。其中，以VIP大于1為潛在的揮發(fā)性特征標(biāo)志物，共篩選出14 個(gè)潛在的揮發(fā)性特征標(biāo)志物（表4），分別為2,5-二甲基-4-羥基-3(2H)-呋喃酮、正辛醛、4-甲基-1-戊醇、3-甲基丁醇、戊醛、3-羥基-2-丁酮、1-苯乙醇、2-己酮、1-辛醇、松油烯-4-醇、二甲基硫醚、苯甲酸甲酯（M）、烯丙基甲基硫醚和β-羅勒烯。

表4 黃顙魚(yú)在冷藏過(guò)程在風(fēng)味特征標(biāo)記物峰強(qiáng)度值Table 4 Peak intensities of characteristic markers for flavor substances of P.fulvidraco during cold storage

從表4可知，以峰強(qiáng)度值代表各揮發(fā)性化合物含量的高低，其中戊醛、松油烯-4-醇和苯甲酸甲酯（M）等物質(zhì)的VIP值大于1.6，是影響不同貯藏期間黃顙魚(yú)風(fēng)味差異的重要成分。充氮組中1-辛醇、2,5-二甲基-4-羥基-3(2H)-呋喃酮的含量在整個(gè)冷藏期間均顯著低于非充氮組（P＜0.05）。3-甲基丁醇、正辛醛、3-羥基-2-丁酮含量從第5天開(kāi)始在充氮組中顯著低于非充氮組（P＜0.05）。松油烯-4-醇、苯甲酸甲酯（M）、4-甲基-1-戊醇含量從第7天開(kāi)始在充氮組中顯著低于非充氮組（P＜0.05）。綜上，充氮包裝可以減少黃顙魚(yú)在冷藏過(guò)程中部分風(fēng)味特征標(biāo)記物的形成。此外，相同貯藏時(shí)間的戊醛、2-己酮和β-羅勒烯在兩組樣品之間基本沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），特別是β-羅勒烯在整個(gè)冷藏期間含量也相對(duì)穩(wěn)定，這說(shuō)明該物質(zhì)的形成與腐敗微生物的生長(zhǎng)和代謝無(wú)關(guān)。

冷藏期間揮發(fā)性物質(zhì)的多樣性以及微生物的多樣性增加了相關(guān)性分析的復(fù)雜性，需要進(jìn)一步研究不同微生物對(duì)氣味變化的影響。對(duì)屬水平上豐富度前5的細(xì)菌和關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味成分（VIP值＞1）進(jìn)行了冗余分析（redundancy analysis，RDA），結(jié)果如圖8所示。第1和第2主成分貢獻(xiàn)率累計(jì)達(dá)到62.53%。說(shuō)明RDA可以有效表征不同微生物對(duì)氣味變化的影響。與第0天的樣品相比，充氮組和非充氮組冷藏第9天的樣品腐敗程度最嚴(yán)重，其中假單胞菌和不動(dòng)桿菌為優(yōu)勢(shì)菌。此外，在腐敗樣品周圍發(fā)現(xiàn)正辛醛、3-羥基-2-丁酮、3-甲基丁醇、1-辛醇、2,5-二甲基-4-羥基-3(2H)-呋喃酮5 種揮發(fā)性化合物，這些化合物均與假單胞菌和不動(dòng)桿菌呈正相關(guān)。據(jù)報(bào)道，假單胞菌和不動(dòng)桿菌在水產(chǎn)腐敗風(fēng)味的形成中起著重要作用。綜上所述，假單胞菌和不動(dòng)桿菌與揮發(fā)性化合物的形成具有較強(qiáng)的相關(guān)性，在黃顙魚(yú)腐敗風(fēng)味的形成中起著重要作用。

圖8 黃顙魚(yú)微生物群落與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的RDAFig.8 RDA analysis of microbial community and volatile flavor compounds in P.fulvidraco

3 結(jié)論

充氮包裝減緩了菌落總數(shù)、TVB-N值、pH值的增長(zhǎng)速度，能有效維持色度、硬度和感官品質(zhì)，可將黃顙魚(yú)的保質(zhì)期延長(zhǎng)2 d左右。與非充氮包裝相比，充氮包裝能在冷藏期間抑制假單胞菌和不動(dòng)桿菌成為優(yōu)勢(shì)腐敗菌的速度，同時(shí)能抑制正辛醛、3-羥基-2-丁酮、3-甲基丁醇、1-辛醇等高VIP值化合物的形成，微生物與揮發(fā)性化合物的形成具有很強(qiáng)的相關(guān)性。

綜上所述，充氮包裝能夠抑制黃顙魚(yú)冷藏期間優(yōu)勢(shì)腐敗菌生長(zhǎng)、維持其鮮度，并延緩風(fēng)味劣變，有利于延長(zhǎng)黃顙魚(yú)貨架期，研究結(jié)果可為其商品化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。