荔枝落果中A型低聚原花青素抑制類甜蛋白促炎機(jī)制

羅楊合，曾詩(shī)藹，李洛欣，謝 翀，閆景坤，李玉婷，羅英捷，趙 雷,,*

（1.廣西康養(yǎng)食品科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（賀州學(xué)院），廣西 賀州 542899；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；3.東莞理工學(xué)院生命健康技術(shù)學(xué)院，廣東 東莞 523808；4.營(yíng)家健康科技（廣東）有限公司，廣東 東莞 523000）

荔枝作為“中華珍品”，是名貴的果品，有食、療兩用之功。但大量食用會(huì)引起“上火”癥狀，如口癢、眼皮腫脹、濕疹、皰疹、喉嚨腫痛等[1]，困擾荔枝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)荔枝中引起“上火”的重要原因之一是荔枝類甜蛋白（litchi thaumatin-like protein，LcTLP）導(dǎo)致人體對(duì)食物不耐受，從而引起組織發(fā)生炎癥反應(yīng)。LcTLP可顯著提高RAW264.7細(xì)胞中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等促炎因子分泌水平[2]，在此基礎(chǔ)上，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探明，LcTLP進(jìn)入胃腸道后未能被充分消化吸收，會(huì)導(dǎo)致腸道菌群和結(jié)腸代謝物發(fā)生變化，通過(guò)腸-肝軸引起肝臟炎癥[3]，明確了食用荔枝“上火”原因?yàn)長(zhǎng)cTLP引起的肝臟等組織的炎癥反應(yīng)。

目前，避免食用荔枝引起“上火”的主要方法可通過(guò)減少攝入量或利用加工方式（干制或超聲處理）破壞LcTLP的炎癥反應(yīng)活性位點(diǎn)[4-5]，但這限制了荔枝鮮果的產(chǎn)業(yè)發(fā)展。值得注意的是，荔枝皮“性苦寒”，民間有利用荔枝皮浸泡或煮水飲用緩解過(guò)量食用荔枝所引起的不良反應(yīng)的說(shuō)法。北宋詩(shī)人蘇軾云“食荔枝多則醉，以殼浸水飲之即解。此即食，物不消，還以本物消之之意”。研究亦發(fā)現(xiàn)，荔枝果皮中富含A型原花青素[6]。原花青素作為自然界第二豐富的天然酚類化合物[7]，由不同數(shù)量的黃烷-3-醇基本結(jié)構(gòu)單元組成，具有抗氧化[8]、抗癌[9]、抗炎[10]等多種生物活性。相較于B型原花青素，A型原花青素結(jié)構(gòu)上多一個(gè)C—O—C鍵，結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，其在體內(nèi)可以發(fā)揮更強(qiáng)的生物活性，且聚合度越低，其生物利用度越高。

在自然條件下，荔枝果實(shí)從授粉到果實(shí)發(fā)育成熟的過(guò)程中會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的生理落果的現(xiàn)象，平均坐果率僅約4%[11-12]。這可能是果實(shí)為了應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫以及營(yíng)養(yǎng)和激素失衡出現(xiàn)的結(jié)果[13]。而且荔枝落果中A型低聚原花青素（A-type oligomeric proanthocyanidins，A-OPC）的種類和含量均遠(yuǎn)高于熟果皮，是A型原花青素的潛在來(lái)源[14]。越來(lái)越多的研究證明原花青素是治療或緩解由脂多糖誘導(dǎo)炎癥的有效成分[15-16]，是否能夠?qū)cTLP造成的炎癥同樣具有較好的抑制效果值得深入探究。因此，本研究對(duì)荔枝落果中A型原花青素組分進(jìn)行了分離提取和結(jié)構(gòu)鑒定，并以LcTLP為促炎介質(zhì)誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7建立炎癥模型，明確其抑制炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制，為荔枝落果的增值開(kāi)發(fā)和解決荔枝食用不耐受提供新的途徑和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白糖罌荔枝落果由廣東茂名市果園提供。LcTLP由實(shí)驗(yàn)室制備[2]。

AB-8大孔吸附樹(shù)脂、兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品、表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品、原花青素A1標(biāo)準(zhǔn)品、原花青素A2標(biāo)準(zhǔn)品、原花青素A4標(biāo)準(zhǔn)品、原花青素B1標(biāo)準(zhǔn)品、原花青素B2標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司；乙腈（色譜純）德國(guó)默克公司；甲酸（色譜純）美國(guó)Sigma-Aldrich公司；小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7 中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)基、青霉素、硫酸鏈霉素 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；胎牛血清 美國(guó)Gibco公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）上海碧云天生物技術(shù)有限公司；NO測(cè)定試劑盒 南京建成生物科技有限公司；TNF-α、IL-6酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 欣博盛生物科技有限公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔多克隆抗體 美國(guó)Cell Signaling Technology公司。其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

E2695高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；6540 UHD Q-TOF型質(zhì)譜儀、1260 Mini-PROTEA制備液相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司；PowerPac Basic電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；SpectraMax i3x多功能酶標(biāo)儀 奧地利Molecular Devices公司。

1.3 方法

1.3.1 A-OPC的制備

參考Xie Chong等[14]的方法并稍作修改。將荔枝落果粉碎，按料液比1∶10（g/mL）與體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液混合，于常溫條件下采用磁力攪拌提取12 h，過(guò)濾，收集濾液，重復(fù)此操作4 次，合并提取液。提取液于40 ℃條件下減壓濃縮至無(wú)醇，采用AB-8大孔吸附樹(shù)脂吸附濃縮液，用蒸餾水洗去蛋白質(zhì)和糖等雜質(zhì)，最后采用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，洗脫液減壓濃縮經(jīng)真空冷凍干燥得到荔枝落果粗提物（crude extract of litchifruitlet，CELF），保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

采用制備液相色譜儀對(duì)CELF中的A-OPC進(jìn)行分離制備，色譜條件：色譜柱：安捷倫Pursuit Xrs C18柱（250 mm×21.2 mm，10 μm）；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；流動(dòng)相A：0.4%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液；流動(dòng)相B：乙腈；流速：20 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：550 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。梯度洗脫條件：0～10 min，85%～65% A，15%～35% B；10～25 min，65%～55% A，35%～45% B；25～40 min，55%～40% A，45%～60% B；40～45 min，80% A，20% B。收集13～14 min的餾分，餾分于40 ℃減壓濃縮后凍干得到A-OPC，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 A-OPC的組分鑒定

參考Wang Kun[5]和何婷[17]等的方法并稍作修改，采用高效液相色譜系統(tǒng)分析。色譜條件：色譜柱：Zorbox SB-C18柱；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；流動(dòng)相A：0.4%甲酸水溶液；流動(dòng)相B：乙腈；流速：0.7 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。梯度洗脫條件如下：0～10 min，83%～80% A，17%～20% B；10～12 min，80% A，20% B；12～15 min，80%～77% A，20%～23% B；15～22 min，77% A，23% B；22～25 min，77%～50% A，23%～50% B；25～30 min，50%～45% A，50%～55% B；30～32 min，45%～20% A，55%～80% B；32～35 min，20%～83% A，80%～17% B。

采用高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-quadrupole time-offlight tandem mass spectrometry，HPLC-Q-TOF-MS/MS）系統(tǒng)對(duì)樣品進(jìn)行電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）負(fù)離子分析，流動(dòng)相和洗脫條件與高效液相色譜分析相同。質(zhì)譜使用ESI在以下條件下收集：測(cè)定范圍：m/z100～1 700；毛細(xì)管電壓：3 500 V；氣體流速：9 L/min；碰撞能量：500 psig。

通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間的比較，對(duì)原花青素的峰進(jìn)行定性定量分析，標(biāo)準(zhǔn)品包括兒茶素、表兒茶素、原花青素B1、原花青素B2、原花青素A1、原花青素A2、原花青素A4。樣品中A型原花青素二聚體、三聚體和四聚體均以原花青素A2含量表示。原花青素的純度按下式進(jìn)行計(jì)算：

式中：m為總酚或原花青素的含量/mg；M為測(cè)定所用原料的質(zhì)量/mg。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)與活性測(cè)定

小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞采用DMEM完全培養(yǎng)基（含10%（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL硫酸鏈霉素）于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。采用CCK-8測(cè)定A-OPC對(duì)細(xì)胞活性的影響。將細(xì)胞以每孔200 μL、密度為5×105個(gè)/mL接種于96 孔板，并在培養(yǎng)箱中孵育24 h。移除培養(yǎng)基后分別添加含LcTLP（0.1 μg/mL）和含不同質(zhì)量濃度A-OPC（10、30、60、90、120、150、200 μg/mL）的培養(yǎng)基，孵育24 h。根據(jù)CCK-8說(shuō)明書(shū)進(jìn)行活性測(cè)定。

1.3.4 LcTLP誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥模型的建立

參考Chen Huifang等[2]方法制備LcTLP并建立RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型。將細(xì)胞以每孔1 mL、密度為5×105個(gè)/mL接種于24 孔板，孵育24 h，移除培養(yǎng)基。按實(shí)驗(yàn)分組添加相應(yīng)培養(yǎng)基，孵育24 h后用于指標(biāo)測(cè)定。其中，空白組：不含樣品和LcTLP的培養(yǎng)基；炎癥模型組：含LcTLP（100 ng/mL）的培養(yǎng)基；樣品組：含不同質(zhì)量濃度的A-OPC（60、90、120 μg/mL）及LcTLP（0.1 μg/mL）的培養(yǎng)基。

1.3.5 炎癥因子及NO分泌量的測(cè)定

收集1.3.4節(jié)中細(xì)胞上清液。根據(jù)NO試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定NO分泌量，采用ELISA試劑盒測(cè)定上清液中促炎因子IL-6和TNF-α含量。

1.3.6 蛋白表達(dá)量的測(cè)定

參考Zeng Shi’ai等[4]方法進(jìn)行測(cè)定。將細(xì)胞以密度為5×105個(gè)/mL接種于6 孔板中，每孔2 mL，經(jīng)不同實(shí)驗(yàn)組處理后，于冰上將細(xì)胞裂解15 min，收集細(xì)胞裂解液。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。統(tǒng)一蛋白質(zhì)濃度后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜，Tris含吐溫-20緩沖鹽溶液（Tris-buffered saline and Tween 20，TBST）洗膜5 min后用5%脫脂奶粉封閉90 min。用TBST洗去脫脂奶粉，將PVDF膜浸泡于一抗中，于4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜。再將PVDF膜浸泡于二抗中，于37 ℃孵育60 min，TBST洗膜。將PVDF膜浸泡于顯色液中1 min，用Amersham Imager 600凝膠成像顯影，采集蛋白條帶圖片。用Photoshop 2020軟件采集蛋白條帶灰度值并分析處理。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)均采用IBM SPSS Statistics Version 20.0進(jìn)行處理，Origin 2021作圖，數(shù)據(jù)以表示。采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并使用Tukey’s事后檢驗(yàn)確定均值之間的差異，P＜0.05視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 荔枝落果中A-OPC分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

圖1是不同生長(zhǎng)階段荔枝落果（白糖罌）和成熟果實(shí)照片。前期研究發(fā)現(xiàn)第三批次落果體積大、總量多且A-OPC含量最高，選取第三批次荔枝生理落落為原料作進(jìn)一步研究。落果經(jīng)粉碎、大孔樹(shù)脂吸附洗脫和70%乙醇溶液提取后，得到CELF，采用HPLC-Q-TOF-MS/MS對(duì)CELF進(jìn)行ESI負(fù)離子分析，液相色譜圖如圖2a所示，樣品分離出3 個(gè)大峰和6 個(gè)小峰，其中4 min的色譜峰為溶劑峰。根據(jù)原花青素的裂解方式共鑒定出13 種原花青素（表1），其中包含2 個(gè)單體、6 個(gè)二聚體、4 個(gè)三聚體和1 個(gè)四聚體，僅有2 個(gè)B型二聚體，其余全為A型原花青素。Gong Yihui等[18]對(duì)荔枝果皮中原花青素鑒定后也發(fā)現(xiàn)以A型為主。CELF中13.74 min的色譜峰具有相對(duì)較高的峰面積且均為A-OPC（原花青素A2和A型四聚體），為進(jìn)一步獲取高純度的A-OPC，對(duì)CELF中保留時(shí)間在13～14 min的化合物利用制備液相色譜儀收集，采用HPLC和LC-Q-TOF MS/MS對(duì)其進(jìn)行鑒定。結(jié)果如圖2c和表2所示，A-OPC中含兩個(gè)峰，A-OPC-1為原花青素A2、A型三聚體和A型四聚體，A-OPC-2為A型三聚體，計(jì)算可得A-OPC總純度可達(dá)到88.69%。Li Shuyi等[19-20]雖然在荔枝果皮中提取的低聚原花青素含量可達(dá)提取物的89.60%，但是A型原花青素在低聚物中約占41.70%。值得注意的是，原花青素的活性和生物利用度往往受其聚合程度和結(jié)構(gòu)的影響，A型原花青素相較于B型原花青素在結(jié)構(gòu)上多一個(gè)C—O—C鍵，這一個(gè)額外的連接鍵使其形成一個(gè)更加穩(wěn)固的3D形狀，使A型原花青素更易于與生物大分子發(fā)生相互作用而產(chǎn)生生物活性。A型原花青素相較于B型原花青素更容易被人體吸收，且聚合度越低，生物利用度越高[21]。因此，荔枝果皮泡水的“下火”功效可能得益于A-OPC特有的藥物動(dòng)力學(xué)特性和功能特性，A-OPC的抗炎活性值得進(jìn)一步探究。

表1 CELF中原花青素成分Table 1 Characterization of proanthocyanidins in CELF

表2 A-OPC中化合物的主要質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 2 Primary mass spectral data of compounds in A-OPC

圖1 不同生長(zhǎng)時(shí)期白糖罌荔枝落果及成熟荔枝圖片F(xiàn)ig.1 Pictures of developing and ripe litchi fruits

圖2 CELF（a）、原花青素混合標(biāo)準(zhǔn)品（b）和A-OPC（c）的高效液相色譜圖Fig.2 High performance liquid chromatograms of crude extract of litchi fruits (a),mixed standard of proanthocyanidins (b) and A-OPC (c)

2.2 A-OPC對(duì)LcTLP誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO分泌量的影響

進(jìn)一步探討以制備液相分離得到的A-OPC 對(duì)LcTLP誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥的抑制作用。通過(guò)CCK-8法測(cè)定A-OPC對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響，結(jié)果如圖3所示。與空白組相比，在10～200 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，A-OPC對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力無(wú)顯著性影響（P＞0.05），后續(xù)實(shí)驗(yàn)A-OPC質(zhì)量濃度選定為60、90、120 μg/mL。

圖3 A-OPC對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響Fig.3 Effect of A-OPC on the viability of RAW264.7 cells

圖4是A-OPC對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞NO分泌量的影響。在0.1 μg/mL LcTLP作用下，細(xì)胞分泌NO上升至32.73 μmol/L，為空白組6.22 倍，說(shuō)明細(xì)胞促炎模型建立成功。與模型組相比，添加A-OPC對(duì)NO的分泌抑制呈現(xiàn)出劑量依賴性。在60、90、120 μg/mL條件下，對(duì)NO的抑制率分別為7.31%、45.61%和58.38%。NO是一種重要的炎癥介質(zhì)，可由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。過(guò)量的NO不僅具有細(xì)胞毒性，同時(shí)能夠激活核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號(hào)通路導(dǎo)致促炎因子分泌增多，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生[4]。因此，添加A-OPC后可以抑制NO的分泌，初步得到A-OPC可以抑制LcTLP引起的炎癥反應(yīng)。

圖4 A-OPC對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO分泌量的影響Fig.4 Effect of A-OPC on NO secretion in RAW264.7 cells

2.3 A-OPC對(duì)LcTLP誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥因子分泌量的影響

圖5為A-OPC對(duì)RAW264.7細(xì)胞炎癥因子分泌量的影響，與A-OPC對(duì)NO的抑制效果相似，A-OPC的添加抑制了LcTLP誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的分泌。在60、90 μg/mL和120 μg/mL質(zhì)量濃度下，A-OPC對(duì)IL-6的抑制率分別為6.25%、17.26%、39.80%，呈現(xiàn)出劑量依賴性。在60 μg/mL質(zhì)量濃度下，A-OPC即可顯著降低TNF-α分泌量至451.43 pg/mL（P＜0.01），抑制率達(dá)到92.78%，繼續(xù)增加A-OPC質(zhì)量濃度，TNF-α的分泌量無(wú)顯著變化，在120 μg/mL質(zhì)量濃度下抑制率為86.31%，說(shuō)明在60 μg/mL質(zhì)量濃度下，A-OPC對(duì)TNF-α的分泌抑制已達(dá)最佳。炎癥因子IL-6和TNF-α為促炎因子，其分泌量的降低被認(rèn)為是巨噬細(xì)胞炎癥消失的重要因素[22]。Xie Chong等[14]發(fā)現(xiàn)荔枝果皮中原花青素三聚體的含量與抗炎活性顯著相關(guān)。Dudek等[23]從花生皮中分離得到的A型原花青素三聚體和四聚體在50 μg/mL條件下能有效抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α分泌。Han Shan[16]和Wang Qinqin[24]等研究發(fā)現(xiàn)原花青素A1和原花青素A2均能顯著降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。因此，A-OPC中含原花青素A2、A型原花青素三聚體，作為主要的抗炎物質(zhì)，表現(xiàn)出顯著的抗炎活性，并顯著減少了促炎細(xì)胞因子的分泌。

圖5 A-OPC對(duì)RAW264.7細(xì)胞炎癥因子分泌量的影響Fig.5 Effect of A-OPC on secretion of inflammatory cytokines in RAW264.7 cells

2.4 A-OPC對(duì)LcTLP誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）及環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）蛋白表達(dá)量的影響

COX-2和iNOS被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵酶[25]。圖6為A-OPC對(duì)LcTLP誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞iNOS及COX-2蛋白表達(dá)量的影響。細(xì)胞經(jīng)LcTLP孵育24 h后，COX-2和iNOS表達(dá)量大幅度增加，添加A-OPC后對(duì)LcTLP刺激產(chǎn)生的COX-2和iNOS具有抑制效果，在60 μg/mL質(zhì)量濃度下，A-OPC即可顯著降低iNOS的表達(dá)量至0.607（P＜0.01），但在90 μg/mL質(zhì)量濃度下才對(duì)COX-2的表達(dá)具有顯著抑制效果（P＜0.01），進(jìn)一步提高A-OPC濃度表現(xiàn)出劑量依賴性。iNOS是巨噬細(xì)胞用于產(chǎn)生NO的酶，能催化L-精氨酸轉(zhuǎn)化為NO和L-瓜氨酸[26]。而細(xì)胞受到促炎物質(zhì)刺激后，會(huì)在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控COX-2，通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和NF-κB通路，最終促進(jìn)COX-2基因的轉(zhuǎn)錄。原花青素可通過(guò)多種方式抑制COX-2，包括通過(guò)COX-2基因轉(zhuǎn)錄、COX-2蛋白表達(dá)和COX-2酶活性[27]。結(jié)果表明A-OPC發(fā)揮抗炎效果是通過(guò)抑制上游關(guān)鍵酶COX-2和iNOS的表達(dá)實(shí)現(xiàn)，其抑制路徑需要進(jìn)一步探究。

圖6 A-OPC對(duì)RAW264.7細(xì)胞iNOS和COX-2蛋白表達(dá)量的影響Fig.6 Effect of A-OPC on protein expression of iNOS and COX-2 in RAW264.7 cells

2.5 A-OPC對(duì)LcTLP-誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NF-κB/MAPK通路的影響

抑制NF-κB和MAPK信號(hào)通路的激活是炎癥性疾病的重要治療策略。為進(jìn)一步探討A-OPC對(duì)LcTLP誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥的抑制機(jī)制，探究了A-OPC對(duì)NF-κB通路上游激酶p65和NF-κB抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκBα）磷酸化水平的影響。如圖7所示，炎癥模型組（添加0.1 μg/mL LcTLP）顯著提高了p-p65/p65和p-IκBα/IκBα的表達(dá)，說(shuō)明LcTLP引起炎癥的主要原因是MAPK和NF-κB通路所介導(dǎo)的[4]。然而，添加A-OPC可抑制這種作用來(lái)減少磷酸化水平，在60、90、120 μg/mL時(shí)，p65的磷酸化水平下調(diào)27.85%、74.94%和96.71%。不同的是，A-OPC在60～90 μg/mL時(shí)對(duì)IκBα的磷酸化無(wú)明顯抑制效果，而在120 μg/mL時(shí)才表現(xiàn)出明顯抑制作用，下調(diào)37.07%。NF-κB被認(rèn)為是一種關(guān)鍵的促炎信號(hào)通路，因?yàn)樗谠S多促炎基因（如細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子）的表達(dá)中起作用。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB由5 個(gè)亞基（p65、RelB、c-Rel、p52和p50）組成，其中，p65亞基被認(rèn)為是最重要的一個(gè)，可以在許多位點(diǎn)磷酸化[28]。在其非活性形式中，NF-κB通過(guò)與抑制劑蛋白IκB-α結(jié)合而存在于細(xì)胞質(zhì)中。在LPS和TNF-α等外部刺激的激活下，IκB被磷酸化和降解，導(dǎo)致NF-κB易位到細(xì)胞核。核易位后，NF-κB亞基p65的磷酸化增強(qiáng)了各種促炎基因的轉(zhuǎn)錄。因此，A-OPC可能通過(guò)抑制p65和IκB-α亞基的磷酸化和核易位減少促炎基因的轉(zhuǎn)錄。

圖7 A-OPC對(duì)NF-κB通路上游激酶磷酸化水平的影響Fig.7 Effect of A-OPC on phosphorylation of upstream kinases in the NF-κB signaling pathway

MAPK通路蛋白的磷酸化被認(rèn)為是激活巨噬細(xì)胞中NO和促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的關(guān)鍵因素，MAPKs在NF-κB的激活中發(fā)揮關(guān)鍵作用[29]。圖8展示了A-OPC對(duì)MAPK通路上游激酶細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulating kinase，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和p38磷酸化水平的影響。LcTLP刺激后對(duì)JNK、ERK以及p38磷酸化顯著升高，加入A-OPC后以劑量依賴性方式還原JNK、ERK以及p38的磷酸化蛋白。在120 μg/mL下，JNK、p38和ERK磷酸化程度分別比模型組降低了29.05%、73.28%和21.84%。這些結(jié)果表明，A-OPC可顯著降低LcTLP誘導(dǎo)的MAPK和NF-κB通路蛋白表達(dá)的磷酸化水平。Harbeoui等[30]發(fā)現(xiàn)，富含原花青素的葡萄籽提取物能夠下調(diào)NF-κB和MAPK通路，對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥具有抑制的效果。因此，荔枝落果中A-OPC可通過(guò)MAPK和NF-κB通路對(duì)LcTLP誘導(dǎo)的炎癥產(chǎn)生抑制效果。

圖8 A-OPC對(duì)MAPKs通路上游激酶磷酸化水平的影響Fig.8 Effect of A-OPC on phosphorylation of upstream kinases in the MAPK signaling pathway

3 結(jié)論

本研究從荔枝落果中分離純化獲得純化物A-OPC，并對(duì)其結(jié)構(gòu)鑒定主要成分為原花青素A2、2 個(gè)A型原花青素三聚體和1 個(gè)A型原花青素四聚體，計(jì)算其A-OPC總純度可達(dá)到88.69%。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，A-OPC能有效抑制LcTLP引起的炎癥反應(yīng)，通過(guò)下調(diào)COX-2和iNOS的表達(dá)抑制RAW264.7分泌NO，并抑制促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的分泌。進(jìn)一步闡明A-OPC抑制LcTLP的抗炎活性的機(jī)制，A-OPC可顯著降低LcTLP誘導(dǎo)的NF-κB和MAPK通路上游激酶p65、IκBα、ERK、JNK和p38表達(dá)的磷酸化水平，從而達(dá)到抑制作用。綜上所述，荔枝落果富含A-OPC，能夠有效緩解LcTLP誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥，可作為一種升級(jí)再造的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物原料用于解決荔枝及其相關(guān)產(chǎn)品的不耐受問(wèn)題，從而為減少荔枝食用不良反應(yīng)的發(fā)生提供了一種潛在的策略。