微酸性電解水對(duì)空腸彎曲菌的殺滅特性及機(jī)制

宋欣坤，龐柳欣，牛玲玲，岳 婷，牛際涵，張春玲

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

空腸彎曲菌是革蘭氏陰性微需氧菌，主要存在于家禽和野禽體內(nèi)，是一種人畜共患的細(xì)菌病原體，會(huì)引發(fā)腹瀉、流產(chǎn)、不育、乳房炎以及傳染性肝炎等疾病[1]。人類可通過(guò)與動(dòng)物及其生活環(huán)境接觸，食用未煮熟的肉類、農(nóng)產(chǎn)品或飲用受污染的乳品、水等感染空腸彎曲菌?？漳c彎曲菌具有耐藥性，在不利環(huán)境中會(huì)進(jìn)入可存活但不可培養(yǎng)狀態(tài)，難以被完全殺滅，存在食品安全隱患[2-3]?？漳c彎曲菌可引發(fā)人類腸胃炎、發(fā)燒、血便等，甚至可引發(fā)米勒-費(fèi)希爾綜合征和格林-巴利綜合征[4]。世界衛(wèi)生組織已將空腸彎曲菌定義為常見(jiàn)的食源性致病菌之一[5]。通常屠宰多采用物理或化學(xué)方法去污除菌，主要包括身體清潔、物理和化學(xué)脫毛以及用熱水或化學(xué)物質(zhì)（次氯酸鈉）漂洗等傳統(tǒng)方法，不僅存在清潔程度較低的缺陷，還可能會(huì)對(duì)禽肉的質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響。所以，進(jìn)行補(bǔ)充干預(yù)去污十分必要，如脈沖光、超聲波、冷大氣等離子體、臭氧、二氧化氯、電解水等補(bǔ)充干預(yù)手段，它們具有毒性更低、形式更穩(wěn)定、對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量影響更小等優(yōu)點(diǎn)，是屠宰加工領(lǐng)域替代次氯酸鈉等傳統(tǒng)凈化方法的候選方法，上述部分方法在實(shí)際應(yīng)用中仍存在商業(yè)化難、能耗多等缺陷，而電解水由于制取方便、綠色高效的特點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。

微酸性電解水（slightly acidic electrolyzed water，SAEW）是在無(wú)隔膜電解槽中電解稀鹽或稀鹽酸溶液而生成的具有特殊理化性質(zhì)的水溶液[6]。SAEW的pH值為5.0～6.5，有效氯成分主要是次氯酸（HClO），其殺菌能力是ClO-的80～150 倍。SAEW具有殺菌高效廣譜、腐蝕性低、安全環(huán)保、pH值更加溫和等優(yōu)點(diǎn)，已在食品行業(yè)中廣泛應(yīng)用[7]。研究表明SAEW對(duì)大腸桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌（以下簡(jiǎn)稱單增李斯特菌）、金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌等多種食源性致病菌具有良好殺滅效果[8-11]。

本研究以空腸彎曲菌作為研究對(duì)象，考察SAEW對(duì)純培養(yǎng)空腸彎曲菌的殺滅效果，以及有機(jī)質(zhì)對(duì)殺菌效果的影響，同時(shí)對(duì)SAEW殺滅多代空腸彎曲菌的效果進(jìn)行評(píng)估，以確保SAEW殺菌方式的安全性；最后，對(duì)SAEW殺滅空腸彎曲菌的特性和機(jī)制進(jìn)行研究，以期為SAEW對(duì)食品中空腸彎曲菌的殺滅提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni）ATCC 33560來(lái)源于美國(guó)模式菌株收集中心。

次氯酸鈉 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；哥倫比亞血瓊脂、脫纖維羊血、微需氧袋、培養(yǎng)罐 青島海博生物有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）北京天勤一和生物科技有限公司；Live/Dead BacLight細(xì)菌細(xì)胞活性測(cè)定試劑盒L7012 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒和ATP檢測(cè)試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其他有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

InfiniteTMM200 PRO酶標(biāo)儀、victorX3多功能酶標(biāo)儀瑞士帝肯集團(tuán)公司；PTH027有效氯測(cè)量計(jì) 英國(guó)百靈達(dá)有限公司；FE28 pH/氧化還原電位（oxidation reduction potential，ORP）計(jì) 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；Harmony-II SAEW生成設(shè)備 北京睿安德科技有限公司；Vortex-2渦旋儀 上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；S-3400N場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本日立公司；DM5000B熒光顯微鏡 德國(guó)Leica公司；GHX-9050B-2細(xì)菌培養(yǎng)箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SAEW的制備

本研究選用Harmony-II為電解水生成設(shè)備，制備pH值為5.0～6.5，有效氯質(zhì)量濃度（available chlorine concentration，ACC）為10、20、30、40 mg/L和50 mg/L的SAEW，制備完成后立即檢測(cè)其理化指標(biāo)。SAEW的ACC由有效氯測(cè)定儀測(cè)定；pH值和ORP由雙標(biāo)度pH/ORP計(jì)測(cè)量。用相應(yīng)ACC的NaClO溶液及無(wú)菌去離子水作為對(duì)照。本研究所用處理溶液的理化參數(shù)如表1所示。

表1 SAEW和NaClO溶液的理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical parameters of SAEW and NaClO solution

1.3.2 菌液制備

用無(wú)菌接種環(huán)將凍存管內(nèi)的空腸彎曲菌接種于哥倫比亞血瓊脂上進(jìn)行活化，42 ℃微需氧條件（5% O2、10%CO2和85% N2）培養(yǎng)48 h。挑取單菌落劃線于哥倫比亞血瓊脂平板，42 ℃微需氧條件下純化培養(yǎng)24 h。挑取單菌落于含有5%脫纖維羊血的Bolton肉湯中，42 ℃微需氧培養(yǎng)48 h后離心重懸，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 SAEW對(duì)空腸彎曲菌的殺滅效果

分別將菌懸液與不同ACC（10、20、30、40 mg/L和50 mg/L）的SAEW按照1∶9（V/V）的比例混合處理1、2、5 min和10 min，以1∶1（V/V）的比例取反應(yīng)液與5 g/L Na2S2O3溶液中和劑混合終止殺菌，涂布后置于42 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中，微需氧條件培養(yǎng)48 h后用平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)空腸彎曲菌的存活率，使用NaClO和無(wú)菌去離子水作為對(duì)照。同時(shí)，取殺菌時(shí)間為2 min的樣品置于4 ℃保存，備用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 蛋白質(zhì)對(duì)SAEW空腸彎曲菌殺滅效果的影響

參照邴珊[12]的方法，將BSA制成質(zhì)量濃度為3、10 g/L及30 g/L的干擾物，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ? mL ACC為30 mg/L的SAEW處理1 mL菌懸液，處理后的菌液與不同質(zhì)量濃度的BSA等比例混合，處理2 min；取9 mL ACC為10、20、30、40 mg/L和50 mg/L的SAEW處理1 mL菌懸液，處理后的菌液與10 g/L的BSA等比例混合，處理2 min；取9 mL ACC為30 mg/L的SAEW處理1 mL菌懸液，處理后的菌液與10 g/L的BSA等比例混合，處理不同時(shí)間（1、2、5、10 min）。以1∶1（V/V）的比例取反應(yīng)液與5 g/L的Na2S2O3溶液中和劑混合終止殺菌反應(yīng)，涂布置于42 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中，微需氧條件培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)，使用NaClO和無(wú)菌去離子水作為對(duì)照。

1.3.5 SAEW多代殺菌效果的測(cè)定

參照梁鐸[13]的方法，取菌液與10 mg/L SAEW按1∶9（V/V）比例混合，渦旋振蕩充分后終止殺菌。平板涂布后42 ℃微需氧培養(yǎng)48 h。計(jì)數(shù)后挑選稀釋度合適的平板，挑取菌落加入Bolton肉湯培養(yǎng)基，相同條件培養(yǎng)48 h，再次進(jìn)行殺菌實(shí)驗(yàn)。每次殺菌實(shí)驗(yàn)為一代，重復(fù)此過(guò)程即為多代殺菌。結(jié)果以殺菌率表示，計(jì)算公式為：

1.3.6 SAEW處理對(duì)空腸彎曲菌細(xì)胞膜完整性的影響

參照Wang Yao等[14]的方法，使用Live/Dead BacLight細(xì)菌細(xì)胞活性測(cè)定試劑盒L7012進(jìn)行熒光染色。將處理后的菌液離心、漂洗、重懸。加入3 μL 1∶1（V/V）混合的SYTO-9和碘化丙啶（propidium iodide，PI）染料，室溫避光孵育15 min，用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.3.7 掃描電子顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)變化

參照Shi Chao等[15]的方法通過(guò)電子顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)變化：將SAEW處理后的菌液離心，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗2 次，2.5%戊二醛溶液固定過(guò)夜，PBS漂洗3 次，不同體積分?jǐn)?shù)（30%、50%、70%、80%、90%和100%）乙醇溶液梯度洗脫樣品。固定樣品，脫水后鍍金，通過(guò)掃描電子顯微鏡觀測(cè)拍照。

1.3.8 SAEW處理對(duì)空腸彎曲菌細(xì)胞膜損傷的影響

1.3.8.1 SAEW處理后空腸彎曲菌細(xì)胞內(nèi)DNA的泄漏情況

參照Cao Shuo等[16]的方法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)DNA的泄漏：處理后菌液離心，PBS漂洗后收集上清液，過(guò)濾，使用多功能酶標(biāo)儀在260 nm波長(zhǎng)處測(cè)量濾液的光密度（OD260nm）值。

1.3.8.2 SAEW處理后空腸彎曲菌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的泄漏情況

采用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度：處理后菌液離心，PBS漂洗后收集上清液，使用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD570nm值。依據(jù)使用的樣品體積計(jì)算出蛋白質(zhì)量濃度。

1.3.8.3 SAEW處理后空腸彎曲菌細(xì)胞內(nèi)ATP的泄漏情況

參照Sánchez等[17]的方法測(cè)定細(xì)胞ATP濃度：處理后菌液在冰上超聲，離心后收集上清液置于冰上備用，使用ATP檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ATP含量，使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度。依據(jù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞內(nèi)ATP的濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本研究的數(shù)據(jù)均是獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次獲得，并采用SPSS對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以的形式表示數(shù)據(jù)（n＝3），采用Duncan’s ANOVA對(duì)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析比較（以P＜0.05表示差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同ACC的SAEW對(duì)空腸彎曲菌的殺滅效果

采用不同ACC的SAEW和NaClO溶液對(duì)空腸彎曲菌進(jìn)行2 min殺滅處理。由圖1可以看出，隨著ACC的增加，SAEW對(duì)空腸彎曲菌的殺滅效果逐漸增強(qiáng)，呈濃度依賴性。相同ACC時(shí)，SAEW處理后空腸彎曲菌的減少量顯著大于NaClO處理（P＜0.05），表明SAEW殺滅作用更強(qiáng)。有研究表明，ACC為20 mg/L的SAEW處理1 h或2 h后，空腸彎曲菌減少1.5～1.7（lg（CFU/g）），抑制作用顯著大于相同ACC的酸性電解水處理組[18]。Yang Gaoji等[19]研究也發(fā)現(xiàn)，相同ACC時(shí)，SAEW比NaClO對(duì)蠟樣芽孢桿菌的殺滅效果更好。對(duì)單增李斯特菌的殺滅研究中也發(fā)現(xiàn)與150 mg/L的NaClO溶液相比，ACC約為60 mg/L的SAEW具有相同或更高的殺菌功效[20]。

圖1 不同ACC的SAEW和NaClO對(duì)空腸彎曲菌的殺滅效果Fig.1 Bactericidal effects of SAEW and NaClO at different ACC levels on C.jejuni ATCC 33560

2.2 SAEW處理不同時(shí)間對(duì)空腸彎曲菌的殺滅效果

采用ACC為30 mg/L的SAEW對(duì)空腸彎曲菌分別進(jìn)行1、2、5 min和10 min的處理，結(jié)果如圖2所示。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，SAEW和NaClO對(duì)空腸彎曲菌的殺滅效果均逐漸增強(qiáng)，并且不同處理間具有顯著性差異（P＜0.05）。研究表明，ACC為60 mg/L的SAEW處理10 min后可以完全殺滅腸炎沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌[21]，并且SAEW對(duì)蠟樣芽孢桿菌的滅活效果在很大程度上取決于ACC水平和暴露時(shí)間以及菌株和生長(zhǎng)條件[11]。在SAEW和NaClO處理1 min內(nèi)空腸彎曲菌減少速度最快，分別減少了5.42（lg（CFU/mL））和4.72（lg（CFU/mL）），當(dāng)處理時(shí)間為10 min時(shí)，SAEW處理和NaClO處理的空腸彎曲菌減少量均達(dá)到最大，分別為6.23（lg（CFU/mL））和5.22（lg（CFU/mL））。結(jié)果表明，相同處理時(shí)間條件下SAEW比NaClO的殺菌效果更好。

圖2 SAEW和NaClO處理不同時(shí)間對(duì)空腸彎曲菌的殺滅效果Fig.2 Bactericidal effects of treatment time of SAEW and NaClO treatments on C.jejuni ATCC 33560

2.3 蛋白質(zhì)對(duì)SAEW殺滅空腸彎曲菌的影響

2.3.1 不同蛋白質(zhì)量濃度SAEW對(duì)空腸彎曲菌的殺滅效果

在不同質(zhì)量濃度BSA干擾下，采用ACC為30 mg/L的SAEW處理空腸彎曲菌2 min，結(jié)果如圖3所示。隨著蛋白質(zhì)量濃度增加，SAEW對(duì)空腸彎曲菌的殺滅效果逐漸減弱，BSA為0 g/L時(shí)，SAEW處理組空腸彎曲菌減少量為5.72（lg（CFU/mL）），BSA為30 g/L時(shí)，SAEW處理組為3.41（lg（CFU/mL）），與BSA質(zhì)量濃度為0 g/L時(shí)相比下降了40.38%，不同蛋白質(zhì)量濃度對(duì)SAEW殺菌效果的影響有顯著差異（P＜0.05）。相同蛋白質(zhì)量濃度下，NaClO處理組殺滅效果弱于SAEW處理組。有研究發(fā)現(xiàn)SAEW殺菌效果會(huì)隨著蛋白質(zhì)濃度的增加而減弱[22]。Ni等[23]研究也發(fā)現(xiàn)，SAEW處理大腸桿菌、腸炎沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的殺菌效率隨著ACC的增加而增加，隨著B(niǎo)SA質(zhì)量濃度的增加而降低，并且增加蛋白質(zhì)濃度可以加速SAEW的ACC的降低[24]。以上研究表明，蛋白質(zhì)會(huì)顯著影響SAEW和NaClO的殺滅效果，蛋白質(zhì)量濃度越高，SAEW的殺菌效果越差，因此在SAEW的實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)降低接觸蛋白質(zhì)的濃度，保證SAEW的殺滅效果。

圖3 不同蛋白質(zhì)量濃度干擾下SAEW和NaClO處理對(duì)空腸彎曲菌的殺滅效果Fig.3 Bactericidal effects of SAEW and NaClO treatments on C.jejuni ATCC 33560 under different BSA concentration

2.3.2 蛋白質(zhì)存在時(shí)不同ACC的SAEW對(duì)空腸彎曲菌的殺滅效果

在10 g/L蛋白質(zhì)存在時(shí)，采用ACC分別為10、20、30、40 mg/L和50 mg/L的SAEW和NaClO溶液處理菌液2 min，結(jié)果如圖4所示。隨著ACC的增加，SAEW對(duì)菌液的殺滅效果逐漸增加，當(dāng)ACC小于20 mg/L時(shí)，SAEW處理組和NaClO處理組的殺菌效果無(wú)顯著差異（P＞0.05），推測(cè)蛋白質(zhì)在一定程度上干擾了ACC較低時(shí)SAEW中游離氯的作用，當(dāng)ACC大于20 mg/L時(shí)，即使存在蛋白質(zhì)干擾，SAEW的殺菌效果也強(qiáng)于NaClO，表明當(dāng)ACC小于20 mg/L時(shí)，蛋白質(zhì)消耗了大部分有效氯，導(dǎo)致殺菌效果大大減弱。在電解水應(yīng)用于肉類工業(yè)的研究中發(fā)現(xiàn)，有機(jī)物存在時(shí)，與NaClO的殺菌效果相比，SAEW的殺菌效果更穩(wěn)定[24]。因此在處理肉類等含有蛋白質(zhì)的樣品時(shí)，應(yīng)選取合適ACC的SAEW處理樣品。

圖4 蛋白質(zhì)存在時(shí)不同ACC的SAEW和NaClO處理對(duì)空腸彎曲菌的殺滅效果Fig.4 Bactericidal effects of SAEW and NaClO treatments at different ACC levels against C.jejuni ATCC 33560 in the presence of exogenous protein

2.3.3 蛋白質(zhì)存在時(shí)SAEW處理不同時(shí)間對(duì)空腸彎曲菌的殺滅效果

在10 g/L蛋白質(zhì)干擾下，采用ACC為30 mg/L的SAEW處理空腸彎曲菌1、2、5 min和10 min，結(jié)果如圖5所示。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，SAEW對(duì)空腸彎曲菌的殺滅效果增強(qiáng)，當(dāng)SAEW處理10 min時(shí)，空腸彎曲菌減少數(shù)量達(dá)到最大值（4.12（lg（CFU/mL））），低于相同ACC的SAEW處理空腸彎曲菌純培養(yǎng)液時(shí)的最大值（6.23（lg（CFU/mL）））。SAEW和NaClO處理1 min內(nèi)空腸彎曲菌減少速率最快，1 min后趨于穩(wěn)定。有研究發(fā)現(xiàn)，在模擬洗滌的過(guò)程中，與蔬菜產(chǎn)品相比，肉類消耗有效氯更快[22]。Park等[25]的研究也發(fā)現(xiàn)，隨著蛋白質(zhì)的增加，游離的有效氯含量降低。SAEW殺菌效率的不斷降低是有機(jī)質(zhì)不斷消耗有效氯導(dǎo)致的。雖然蛋白質(zhì)會(huì)減弱殺菌作用，但是SAEW殺菌效果仍然強(qiáng)于NaClO，因此在食品工業(yè)中應(yīng)用SAEW時(shí)應(yīng)考慮不同食品中蛋白質(zhì)的數(shù)量和類型，合理選擇處理時(shí)間，從而優(yōu)化殺菌條件和效果。

圖5 蛋白質(zhì)存在時(shí)SAEW和NaClO處理不同時(shí)間對(duì)空腸彎曲菌的殺滅效果Fig.5 Effect of treatment time of SAEW and NaClO on inactivation of C.jejuni ATCC 33560 under protein interference

2.4 SAEW多代殺菌效果

采用ACC為10 mg/L的SAEW對(duì)多代培養(yǎng)的空腸彎曲菌處理2 min，考察SAEW的殺滅效果，結(jié)果如圖6所示。SAEW對(duì)第一代菌的殺菌率為26.3%，之后每代的殺菌率均在24.95%～29.80%，且差異較小。梁鐸[13]通過(guò)連續(xù)多代處理，分析SAEW對(duì)單增李斯特菌的多代殺菌效果，第一代殺菌率為56.33%，之后每代的殺菌效果均在47.71%～82.75%之間，且差異不顯著（P＞0.05），這表明單增李斯特菌在10 代之內(nèi)對(duì)SAEW不產(chǎn)生耐藥性。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，10 代以內(nèi)空腸彎曲菌不會(huì)對(duì)低濃度SAEW產(chǎn)生耐受性而降低殺菌效果，因此，可以采用SAEW殺滅空腸彎曲菌。

圖6 SAEW對(duì)空腸彎曲菌的多代殺菌效果Fig.6 Comparison of multi-generational inactivation effects of SAEW on C.jejuni ATCC 33560

2.5 SAEW處理對(duì)空腸彎曲菌細(xì)胞活力的影響

通過(guò)熒光顯微鏡觀察SAEW和NaClO處理對(duì)空腸彎曲菌細(xì)胞活力的影響，結(jié)果如圖7所示。SYTO9是一種可滲透細(xì)胞的核酸染料，PI僅穿透膜受損的細(xì)菌，具有完整細(xì)胞膜的細(xì)菌被染成綠色熒光，膜受損的細(xì)菌顯示紅色熒光。由圖7A可知，無(wú)菌去離子水處理的空腸彎曲菌多數(shù)為強(qiáng)綠色熒光，紅色熒光數(shù)較少，表明對(duì)照組細(xì)胞膜幾乎完好無(wú)損。隨著ACC的增加，紅色熒光數(shù)大幅增加，表明SAEW、NaClO對(duì)細(xì)胞膜完整性的破壞與濃度呈正相關(guān)，且相同ACC條件下NaClO處理組（圖7b～f）的紅色熒光明顯少于SAEW處理組（圖7B～F），表明SAEW對(duì)細(xì)胞膜的損傷程度更強(qiáng)。有研究使用SAEW處理腐敗鏈球菌和腐生鏈球菌，也發(fā)現(xiàn)SAEW會(huì)破壞細(xì)胞膜完整性[26]。用ImageJ軟件對(duì)熒光圖片進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖8所示。隨著ACC的增加，紅色熒光與綠色熒光比值逐漸增加，表明細(xì)胞膜破壞程度加深，與熒光圖片結(jié)果一致。當(dāng)ACC大于等于40 mg/L時(shí)，SAEW處理和NaClO處理的紅色熒光與綠色熒光的比值存在顯著性差異（P＜0.05），表明此時(shí)SAEW對(duì)細(xì)胞膜的破壞作用明顯強(qiáng)于NaClO處理。以上研究表明，SAEW可能通過(guò)損害細(xì)胞膜完整性殺滅空腸彎曲菌。

圖7 SAEW和NaClO處理后空腸彎曲菌熒光顯微鏡圖像Fig.7 Fluorescence microscopic images of C.jejuni ATCC 33560 treated with SAEW and NaClO

圖8 SAEW和NaClO處理后空腸彎曲菌熒光顯微鏡圖像紅色熒光/綠色熒光比值定量分析Fig.8 Quantitative analysis of red/green fluorescence ratios in the fluorescence microscopic images of C.jejuni ATCC 33560 treated with SAEW and NaClO

2.6 SAEW處理對(duì)空腸彎曲菌形態(tài)的影響

對(duì)不同ACC的SAEW處理了2 min的空腸彎曲菌形態(tài)通過(guò)掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察，以無(wú)菌去離子水作為對(duì)照，結(jié)果如圖9所示。無(wú)菌去離子水處理的菌體圖像呈現(xiàn)較完整和光滑的彎曲形（圖9A），而SAEW處理的菌體表面能清楚地觀察到不規(guī)則、褶皺、凹陷、破損甚至破裂（圖9B～F），且菌體表面損傷程度隨著ACC的增加而增加。類似研究發(fā)現(xiàn)，SAEW會(huì)破壞和損傷大腸桿菌和枯草芽孢桿菌，使其形態(tài)發(fā)生改變，推測(cè)SAEW可能通過(guò)改變菌體形態(tài)、增強(qiáng)膜的滲透性和細(xì)菌懸浮液中的導(dǎo)電性，導(dǎo)致鉀離子和蛋白質(zhì)從細(xì)菌細(xì)胞中釋放出來(lái)[27-28]。以上研究表明，SAEW處理會(huì)改變菌體形態(tài)，導(dǎo)致其表面呈現(xiàn)不同程度的損傷，因此可以推測(cè)SAEW可能通過(guò)改變和破壞菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)殺滅空腸彎曲菌。

圖9 SAEW處理后空腸彎曲菌場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡圖像Fig.9 Field emission scanning electron microscopy photomicrographs of C.jejuni ATCC 33560 treated with SAEW

2.7 SAEW處理對(duì)空腸彎曲菌細(xì)胞膜損傷的影響

2.7.1 SAEW處理后空腸彎曲菌細(xì)胞內(nèi)DNA的泄漏情況

采用不同ACC和處理時(shí)間，觀察SAEW對(duì)細(xì)胞內(nèi)核酸泄漏的影響，結(jié)果如圖10所示。處理組的OD260nm遠(yuǎn)高于對(duì)照組，且OD260nm與ACC呈正相關(guān)。然而，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，OD260nm先迅速上升后趨于平穩(wěn)。相似的研究表明，Rhizopus stoloniferOD260nm隨著超聲功率和SAEW ACC的增加而增加，當(dāng)聯(lián)合使用500 W的超聲和55 ℃ 50 mg/L的SAEW處理10 min時(shí)，OD260nm最高，表明此時(shí)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏最嚴(yán)重，細(xì)胞膜被破壞，導(dǎo)致胞內(nèi)成分釋放[29]。有研究表明SAEW處理腐生鏈球菌時(shí)，腐生鏈球菌的細(xì)胞外DNA含量顯著增加（P＜0.05），且與SAEW的ACC呈正比[27]。以上結(jié)果表明，SAEW處理會(huì)導(dǎo)致空腸彎曲菌中核酸泄漏，與ACC呈濃度依賴性，因此可以推測(cè)SAEW通過(guò)增加細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)核酸泄漏，從而殺滅空腸彎曲菌。

圖10 不同ACC的SAEW處理不同時(shí)間對(duì)空腸彎曲菌核酸的影響Fig.10 Effect of different times of SAEW treatment at different ACC levels on leakage of intracellular nucleic acid from C.jejuni ATCC 33560

2.7.2 SAEW處理后空腸彎曲菌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的泄漏情況

蛋白質(zhì)量濃度可以反映細(xì)胞膜的完整性，已測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線表明OD570nm與蛋白質(zhì)量濃度有良好的線性關(guān)系（y＝0.577 2x+0.630 8，R2＝0.996 2），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的樣品中蛋白質(zhì)量濃度的結(jié)果如圖11所示。與對(duì)照組相比，蛋白質(zhì)泄漏質(zhì)量濃度隨著ACC的增加而增加，呈濃度依賴性，且ACC大于等于30 mg/L時(shí)，蛋白質(zhì)泄漏質(zhì)量濃度顯著增加（P＜0.05）。有研究表明酸性電解水可以通過(guò)增加細(xì)胞膜的滲透性導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)成分的泄漏，從而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)[30]，與本研究結(jié)果一致。Osafune等[31]報(bào)道細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)會(huì)被酸性電解水沖洗出細(xì)胞壁。因此，可以推測(cè)SAEW通過(guò)增加細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)成分泄漏，從而殺滅空腸彎曲菌。

圖11 不同ACC的SAEW處理2 min對(duì)空腸彎曲菌蛋白質(zhì)的影響Fig.11 Effect of SAEW treatment for 2 min at different ACC levels on leakage of intracellular protein from C.jejuni ATCC 33560

2.7.3 SAEW處理對(duì)空腸彎曲菌細(xì)胞內(nèi)ATP濃度的影響

AT P 在細(xì)胞的各種生理、病理中起著重要作用，ATP水平的變化會(huì)影響細(xì)胞的功能。已測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線表明熒光強(qiáng)度與ATP濃度呈良好的線性關(guān)系（y＝35 578x+3 621.3，R2＝0.999 8），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的樣品中ATP濃度的結(jié)果如圖12所示。與無(wú)菌去離子水對(duì)照組相比，細(xì)胞ATP濃度隨著ACC的增加而降低，呈濃度依賴性，且ACC大于等于30 mg/L時(shí)，ATP濃度極顯著降低（P＜0.01）。對(duì)照組ATP濃度為（0.30±0.01）μmol/L，當(dāng)ACC為50 mg/L時(shí)，處理后的ATP濃度僅為（0.06±0.02）μmol/L。類似研究發(fā)現(xiàn)，3-苯丙酸和SAEW聯(lián)合處理會(huì)造成Klebsiella oxytoca的ATP水平顯著變化，表明其聯(lián)合處理破壞了細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致ATP泄漏，且細(xì)胞損傷隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而增加[32]。以上研究表明，SAEW會(huì)破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性并滲透到細(xì)胞中，導(dǎo)致ATP濃度下降。

圖12 SAEW處理對(duì)空腸彎曲菌細(xì)胞ATP濃度的影響Fig.12 Effect of SAEW treatment on leakage of intracellular ATP from C.jejuni ATCC 33560

3 結(jié)論

本研究表明，SAEW對(duì)空腸彎曲菌的殺滅效果與處理時(shí)間和ACC呈正相關(guān)，并且SAEW的殺滅效果顯著高于相同ACC的NaClO，蛋白質(zhì)存在時(shí)，SAEW的殺菌效果會(huì)隨著蛋白質(zhì)量濃度的增加而減弱，將空腸彎曲菌進(jìn)行連續(xù)多代處理，在10 代內(nèi)并未對(duì)低濃度SAEW產(chǎn)生明顯的抗藥性反應(yīng)。SAEW處理破壞了空腸彎曲菌的形態(tài)和細(xì)胞膜的完整性，且破壞程度呈濃度依賴性。SAEW處理會(huì)導(dǎo)致空腸彎曲菌細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、ATP泄漏，細(xì)胞活性下降等變化，推測(cè)SAEW通過(guò)破壞膜完整性殺滅空腸曲菌。