金華地區(qū)血小板獻血者血小板基因的分型特點和基因庫建設(shè)

錢江 杜曉明 吳昕

血小板的主要功能是止血，但由于血小板表面存在復(fù)雜的抗原系統(tǒng)，患者多次輸注血小板很大程度會引發(fā)同種免疫反應(yīng)，造成血小板輸注無效（platelet transfusion refractoriness，PTR）。PTR 發(fā)生機制主要與兩類抗原有關(guān)，即人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-A、B 和人類血小板抗原（human platelet antigen，HPA）[1]。有研究表明，反復(fù)輸注血小板的患者中HLA 抗體陽性者占80%，而HPA 抗體陽性者僅占20%[2]。為PTR 患者輸注HLA 和HPA 配型相合的血小板可以顯著提高血小板輸注效果，本研究對金華地區(qū)單采血小板獻血者HLA-A、B 和HPA 抗原的等位基因進行檢測分析，通過對血小板基因分型，為患者提供主要抗原基因型相匹配的血液制品，并建立相應(yīng)的血小板基因庫。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2020 年1 月至2021 年2 月金華市中心血站單采血小板獻血者109 名，其中男63 名，女46名；年齡18～≤25 周歲30 名，＞26～≤35 周歲25 名，＞36～≤45 周歲27 名，＞46～≤55 周歲25 名，＞56～60 周歲2 名。所有獻血者均符合《獻血者健康檢查要求》的規(guī)定。按照《血站技術(shù)操作規(guī)程2019》的要求，在采血結(jié)束后，采用帶分離膠的促凝管留取約8 mL 的血液標(biāo)本備用。所有獻血者在健康狀況征詢環(huán)節(jié)已對其告知血小板建設(shè)基因庫的相關(guān)內(nèi)容并簽署相關(guān)同意書。本研究經(jīng)金華市中心血站醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過（批準(zhǔn)文號：2023-03-01）。

1.2 儀器與試劑 HPA 與HLA-A、B 基因分型檢測試劑盒（熒光PCR 法）（江蘇偉禾生物科技有限公司，批號：202101J）；血液基因組DNA 柱式小量提取試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號：03821），所有試劑均在有效期內(nèi)。高速臺式離心機（型號：Heraeus Pico 17，美國Thermo 公司）；DNA 濃度測定儀（分光光度計）（型號：NanoDrop one，美國Thermo 公司）；恒溫震蕩孵育器（型號：TMS200，杭州奧盛儀器有限公司）；混勻器（型號：VORTEX-5，海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；臺式低速離心機（型號：Mini-P25，杭州奧盛儀器有限公司）；熒光定量PCR 儀（型號：ABI 7500，美國ABI 公司）。所有設(shè)備運行正常，均符合使用要求。

1.3 方法

1.3.1 試劑準(zhǔn)備 從冰箱中取出各組分試劑，室溫平衡30 min，搖勻后用臺式低速離心機2 000 r/min 離心3 min，將試劑盒中的反應(yīng)板嚴(yán)格避光操作轉(zhuǎn)移至96孔板架上備用。準(zhǔn)備反應(yīng)所需HLA、HPA 的主反應(yīng)液、酶混合液、滅菌水、光學(xué)封膜等耗材，按照要求制備DNA 反應(yīng)模板，使其吸光度值（A）在260～280 nm 時比值1.6～2.0，濃度15～40 ng/μL。

1.3.2 加樣 配制混合反應(yīng)液，以1 個標(biāo)本的檢測量為例，在反應(yīng)板上每孔加入18 μL 混合母液，加樣完畢后貼上光學(xué)封膜，并壓緊封膜，2 000 r/min 離心3 min，使所有液體沉降至管底，配置見表1。

表1 混合反應(yīng)液配置表

1.3.3 PCR 擴增 按照操作說明對擴增儀進行循環(huán)參數(shù)設(shè)定，對5（6）羧基熒光素通道（FAM）、六氯-6-甲基熒光素通道（HEX）、羧基-X-羅丹明通道（ROX）、花菁染料通道（CY5）等通道的熒光強度進行檢測，判斷其是否正常。分別將熒光閾值參考值調(diào)整為FAM5000、HEX5000、ROX10000、CY55000，基線參考值調(diào)整為3～15。將混合反應(yīng)液放入擴增儀，95 ℃預(yù)變性150 s，94 ℃變性15 s，65 ℃退火和延伸55 s，完成PCR 擴增。

1.3.4 判定標(biāo)準(zhǔn)與結(jié)果分析

1.3.4.1 判定標(biāo)準(zhǔn) 擴增結(jié)束后，觀察各孔的擴增曲線和循環(huán)閾值（cycle threshold，CT），若標(biāo)記探針擴增曲線正常且CT＜32，判斷該標(biāo)記探針為陽性反應(yīng)；若無擴增曲線或CT≥32，判斷該標(biāo)記探針為陰性反應(yīng)；擴增曲線異常（基線上揚、無典型指數(shù)擴增期）應(yīng)重新檢測。

1.3.4.2 結(jié)果分析 根據(jù)HPA 與HLA-A、B 基因檢測試劑盒的試劑說明書中的HPA/HLA-A、B 判讀表，確定HLA-A、B 位點、HPA-1～6、10、15、21 位點的基因分型結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件。HLA 和HPA 基因頻率采用χ2檢驗，HPA 分布頻率采用Hardy-Weinberg 平衡驗證，采用Arlequin 3.5.2.2 軟件對HLAA、B 位點進行Hardy-Weinberg 平衡檢驗。金華地區(qū)和其他地區(qū)分布的差異采用χ2檢驗，HLA、HPA 對偶抗原配合度用錯配率（mismatch possibility，MMP）表示，MMP=2ab（1-ab），a、b 為對偶抗原等位基因頻率[2]。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金華地區(qū)血小板獻血者HLA-A、B 位點基因頻率 檢出HLA-A 位點等位基因14 個，基因頻率較高的等位基因分別是A*02、A*11、A*24、A*33，見表2；檢出HLA-B 位點等位基因24 個，基因頻率從高到低分別是B*40、B*15、B*46、B*58、B*55、B*39、B*13，見表3。

表2 金華地區(qū)109名血小板獻血者HLA-A 位點等位基因頻率

表3 金華地區(qū)109名血小板獻血者HLA-B 位點等位基因頻率

2.2 金華地區(qū)血小板獻血者HLA-A、B 高頻等位基因與其他地區(qū)的比較 金華地區(qū)的A*02 等位基因分布頻率與云南、遼寧和廣東相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=22.533、11.101、9.217，P＜0.001、0.001、0.002）；金華地區(qū)的A*11 等位基因分布頻率與云南、河南、遼寧、淄博和廣東相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=24.305、13.539、11.127、12.725、12.429，P＜0.001、＜0.001、0.001、＜0.001、＜0.001）；金華地區(qū)的A*24 等位基因分布頻率與西安、云南、河南、遼寧、淄博、廣東相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.747、0.072、1.508、1.006、0.149、3.470，P=0.387、0.788、0.219、0.316、0.699、0.062）；金華地區(qū)的B*40 等位基因分布頻率與西安、云南、河南、遼寧、淄博地區(qū)相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=42.643、29.151、66.627、93.159、36.130，均P＜0.001）；金華地區(qū)的B*15 等位基因分布頻率與西安、云南、河南、遼寧、淄博地區(qū)相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=13.034、6.287、25.429、19.922、17.535，P＜0.001、0.012、＜0.001、＜0.001、＜0.001）；金華地區(qū)的B*46 等位基因分布頻率與西安、河南、遼寧、淄博和廣東地區(qū)相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.305、6.339、5.238、5.132、17.420，P=0.038、0.012、0.022、0.023、＜0.001），見表4。

表4 金華地區(qū)血小板獻血者HLA-A、B 等位基因頻率與不同地區(qū)的比較

2.3 金華地區(qū)血小板獻血者HLA 等位基因Hardy-Weinberg 平衡檢驗 HLA-A、B 2 個位點基因的遺傳平衡檢驗P＞0.05（HLA-A：P=0.090；HLA-B：P=0.415），說明樣本選取具備一定的代表性，符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡。

2.4 金華地區(qū)血小板獻血者HPA-1～6、10、15、21 基因型和基因頻率分布 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HPA-4a、10a 呈單特異性，未檢測出相應(yīng)的對偶基因抗原。HPA-1～6、10、15、21 基因型中雜合度最高的是HPA-15 和HPA-3，HPA-15a/15a、HPA-15a/15ab、HPA-15b/15b 的頻率分別是0.294、0.459、0.248；HPA-3a/3a、HPA-3a/3b、HPA-3b/3b 的頻率分別是0.385、0.450、0.165。經(jīng)Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗，發(fā)現(xiàn)金華地區(qū)HPA-1～3、6、15、21 的基因頻率符合遺傳平衡法則，基因具有恒定性，見表5、6。

表5 金華地區(qū)109名血小板獻血者HPA基因型和基因頻率分布

表6 金華地區(qū)109 名血小板獻血者HPA 等位基因頻數(shù)比較

2.5 金華地區(qū)血小板獻血者HPA 基因頻率與不同國家和地區(qū)的比較 金華地區(qū)HPA-1、HPA-2、HPA-3、HPA-4、HPA-5、HPA-6、HPA-15 基因型與淄博、濰坊、上海、重慶比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（HPA-1：χ2=0.004、0.005、0.158、0.184，P=0.947、0.944、0.691、0.668；HPA-2：χ2=1.606、1.297、0.020、0.697，P=0.205、0.255、0.887、0.404；HPA- 3：χ2=0.114、0.007、0.168、0.669，P=0.736、0.936、0.682、0.413；HPA- 4：χ2=0.191、0.544、0.547、0.410，P=0.662、0.461、0.460、0.522；HPA-5：χ2=0.050、0.391、0.131、2.942，P=0.824、0.532、0.718、0.086；HPA-6：χ2=0.010、0.052、0.132、0.066，P=0.920、0.819、0.717、0.798；HPA- 15：χ2=0.083，0.440、0.817、0.135，P=0.774、0.507、0.336、0.713）。金華地區(qū)HPA-1、HPA-5、HPA-15 與英國白人比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=15.891、5.613、29.350，P＜0.001、0.018、＜0.001）；金華地區(qū)HPA-1、HPA-2、HPA-5 與美國黑人比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.349、9.580、19.559，P=0.012、0.002、＜0.001），見表7。

表7 金華地區(qū)血小板獻血者HPA 基因頻率與不同國家和地區(qū)的比較

3 討論

血小板輸注在治療出血性疾病中起到了重要作用，已成為一種重要的臨床治療手段。但是由于輸血、妊娠或骨髓移植等因素，機體可能會產(chǎn)生針對HLA、HPA 以及CD36 等抗原的血小板特異性抗體而導(dǎo)致PTR 的發(fā)生，盡管臨床上可以通過血小板交叉配合試驗來降低免疫性輸血反應(yīng)，但并不能完全規(guī)避PTR 的發(fā)生，因此血小板的配合性輸注成為困擾臨床輸血的難題。

有研究表明，HLA 抗體是導(dǎo)致機體發(fā)生PTR 最常見的免疫性因素，約占所有免疫因素的80%左右[14]。本次HLA 等位基因頻率調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，金華地區(qū)人群A*02、A*11、B*40、B*15、B*46 等位基因分布頻率與西安、云南、河南、遼寧、淄博、廣東地區(qū)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），僅A*24 基因分布頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。對HLA 等位基因進行Hardy-Weinberg 平衡檢驗[15]，發(fā)現(xiàn)HLA-A、B 等位基因均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡規(guī)律。以上調(diào)查結(jié)果說明金華地區(qū)人群HLA-A 和HLA-B 等位基因的分布具有較強的多態(tài)性和較高的均衡性。

另有研究表明，同種免疫血小板減少癥患者體內(nèi)HPA 出現(xiàn)頻率與對偶抗原的不配合率密切相關(guān)，對偶抗原不配合率越高，機體產(chǎn)生血小板抗體的概率就越大[16]。本次HPA 等位基因頻率研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，HPA-4a、10a 呈單特異性，未檢測出相應(yīng)的對偶基因抗原，與南寧地區(qū)報道一致[17]。HPA-3 和HPA-15 雜合度最高且呈現(xiàn)對偶抗原不配合現(xiàn)象，與韓瑜等[18]、陳涵薇等[19]、陳揚凱等[20]報道一致。HPA-1、2、4、5、6、21 系統(tǒng)以aa 基因型為主，HPA-1、2、4、6、10、21 未檢出bb 純合子，與南京地區(qū)報道一致[21]。金華地區(qū)人群HPA 等位基因分型結(jié)果與國內(nèi)多地數(shù)據(jù)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；與英國和美國人群相比，HPA-1、HPA-2、HPA-5、HPA-15 的基因頻率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。對HPA 等位基因進行Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗，發(fā)現(xiàn)金華地區(qū)人群HPA-1～3、6、15、21 的基因頻率符合遺傳平衡法則，僅HPA-5不符合平衡法則，可能是由于人群基因突變導(dǎo)致地域差異所致。以上研究結(jié)果表明，金華地區(qū)人群HPA 等位基因與國內(nèi)大多數(shù)地區(qū)人群一致，但與英國和美國具備明顯差異，造成這種結(jié)果的原因是由于中國人群與外國人群的遺傳背景不同導(dǎo)致HPA 等位基因分布的多態(tài)性。

通過HLA 和HPA 等位基因頻率分布研究，可以基本掌握金華地區(qū)HLA 和HPA 基因多態(tài)性數(shù)據(jù)，對于初步建立起金華地區(qū)血小板基因庫有著重要的提示和指導(dǎo)作用。有研究報道稱，血小板匹配性輸注可以有效減少PTR 的發(fā)生率[22]。因此，建立血小板基因庫的目的是從已知分型血小板供者庫中迅速找到匹配型供者，為患者提供配合型血小板，降低PTR 的發(fā)生率。但是由于HLA 和HPA 存在廣泛的遺傳多態(tài)性，使血小板配型工作變得十分復(fù)雜，這就需要建立一個庫容適中的血小板基因庫，用以增加血小板配型成功的概率。據(jù)文獻報道，在一個庫容量為5 000 人的血小板基因庫中，患者會有80%的概率匹配到5個A 級配合度的血小板供者[2]。但是由于個體差異和不同的遺傳背景，患者在同一血小板基因庫中找到配合性供者的概率差別也很大。因此，各地在建立血小板基因庫時，要嚴(yán)格按照當(dāng)?shù)厝巳篐LA 和HPA 基因分布頻率來建庫，以此滿足臨床配型需要。為促進臨床血小板應(yīng)用的科學(xué)性和提高血小板輸注效果，浙江省血液中心在2019 年聯(lián)合全省各市中心血站成立全省采供血系統(tǒng)血小板基因庫協(xié)作組，協(xié)作組通過構(gòu)建全省獻血者血小板抗原基因分型數(shù)據(jù)庫，實施基因庫資源共享。全省聯(lián)合建庫模式能夠?qū)鹑A地區(qū)血小板基因庫進行有效擴容，實現(xiàn)血小板資源整合，為患者提供配合型血小板，降低PTR 的發(fā)生率，提高血小板輸注效率。