UCA1/miR-122-5p/CPEB1軸促進(jìn)肺腺癌的順鉑耐藥發(fā)生機(jī)制研究

吳玲玲 陳姝慧 胡天奇 周辰康 仇魯男 王瑜敏

在全球，肺癌的發(fā)病率和死亡率居各種癌癥之首[1]。2016 年中國(guó)惡性腫瘤流行數(shù)據(jù)顯示，惡性腫瘤死亡第1 位是肺癌，發(fā)病率和死亡率分別位列男性腫瘤首位，女性腫瘤第2 位和第1 位[2]。非小細(xì)胞肺癌（non-small-cell carcinoma，NSCLC）在肺癌中最為多見，肺腺癌是NSCLC 中最常見的類型，占肺癌的40%，占NSCLC 的50%。目前肺腺癌的發(fā)病率在全球范圍呈不斷上升趨勢(shì)，由于肺腺癌具有早期出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特點(diǎn)，多數(shù)患者確診時(shí)已屬晚期。以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療在肺腺癌的綜合治療方案中占有重要地位[3]。但隨著順鉑的應(yīng)用，不可避免會(huì)引起腫瘤細(xì)胞對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，使化療效果明顯降低[4]。據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)調(diào)查顯示，90%以上腫瘤患者的死亡在不同程度上與腫瘤耐藥性產(chǎn)生有關(guān)，癌細(xì)胞一旦對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥，會(huì)對(duì)阿霉素、長(zhǎng)春堿、氟尿嘧啶、絲裂霉素等眾多一線化療藥物形成多藥耐藥，其危害尤為嚴(yán)重[5]。本研究團(tuán)隊(duì)前期已采用高通量長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）芯片技術(shù)比較肺腺癌順鉑耐藥株A549/DDP 細(xì)胞與順鉑敏感株A549 細(xì)胞，獲得了肺腺癌順鉑耐藥株差異性lncRNA 表達(dá)譜，篩選并初步鑒定出一些與肺腺癌順鉑耐藥相關(guān)的lncRNA 分子，其中通過lncRNA 芯片及實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄定量PCR（real-time fluorescence reverse transcription quantitative PCR，RT-qPCR）檢測(cè)結(jié)果均證實(shí)了尿路上皮癌胚抗原1（urothelial carcinoembryonic antigen 1，UCA1）為這些候選基因中明顯上調(diào)的lncRNA 分子。UCA1 首先被證實(shí)在膀胱癌組織呈高表達(dá)[6]，在其他癌癥也顯示為高表達(dá)。UCA1 經(jīng)常與miRNA 進(jìn)行互作[7]，而是否通過與相關(guān)miRNA 分子進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（competing endogenouse RNA，ceRNA）調(diào)控肺腺癌對(duì)順鉑耐藥的機(jī)制？本研究擬在前期工作的基礎(chǔ)上，根據(jù)miRNA 預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)的交集，獲得UCA1 調(diào)控相關(guān)miRNA 分子，重點(diǎn)針對(duì)UCA1 相關(guān)miR-122-5p 分子進(jìn)行研究，旨在探討UCA1 通過miR-122-5p 參與調(diào)控肺腺癌順鉑耐藥的機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 RPMI 1640 培養(yǎng)基（批號(hào)：C11875500BT）、DMEM 培養(yǎng)基（批號(hào)：12800017）、opti-MEM 培養(yǎng)基（批號(hào)：31985-070）購自美國(guó)Gibco公司（規(guī)格：500 mL/瓶）。順鉑注射液購自江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司（批號(hào)：SL2138596，規(guī)格：6 mL∶30mg×5 支）。FBS 購自美國(guó)Gibco 公司（批號(hào)：16000-044）。miR-122-5p 模擬物、miR-122-5p 模擬物陰性對(duì)照（NC）、miR-122-5p 抑制劑、miR-122-5p 抑制劑NC、質(zhì)粒pcDNA-胞質(zhì)多聚腺苷酸元件結(jié)合蛋白1（cytosolic polyadenyl element binding protein 1，CPEB1）、對(duì)照載體pcDNA-3.1 均購自廣州銳博生物科技有限公司（規(guī)格：50 μg/支）。Lipofectamine 3000 購自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司（批號(hào)：16000-044）。miDETECT A TrackTMmiRNA qPCR試劑盒購自銳博生物科技有限公司（批號(hào)：C10710）。雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)試劑盒購自美國(guó)Promega 公司（批號(hào)：ZY130595）。RrimeScriptTMRT Master Mix、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自日本Takara 公司（批號(hào)：RR036A、RR420A）。Trizol 試劑盒購自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司（批號(hào)：ALH005，規(guī)格：200 mL/瓶）；氯仿、異丙醇購自天津大茂化學(xué)試劑廠（批號(hào)：S19382、N32930，規(guī)格：10 mg/瓶）。CCK-8 試劑盒購自日本同仁公司（批號(hào)：C0038，規(guī)格：2 mL/瓶）。pmiRGLO-UCA1-野生型（WT）/突變型（Mut）載體、pmiRGLO- CPEB1-3'UTR-WT/Mut 載體均購自銳博生物科技有限公司。 311 型CO2培養(yǎng)箱購自美國(guó)賽默飛公司；ABI 7500 PCR 儀器購自美國(guó)ABI 公司；Nanodrop 2000 儀器購自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 肺腺癌細(xì)胞（HCC827、A549、H1299）和正常人支氣管上皮細(xì)胞（BEAS-2B）系購自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫。其中A549（順鉑敏感細(xì)胞株）、H1299 和HCC827 細(xì)胞保存在含有10%FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，BEAS-2B 細(xì)胞保存在含有10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中，并在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。所有培養(yǎng)物均經(jīng)過常規(guī)檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)支原體或真菌污染。A549/DDP細(xì)胞（順鉑耐藥細(xì)胞株）購自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫，在培養(yǎng)基加入1 μg/mL 順鉑，以保持其抗藥性。A549 過表達(dá)UCA1 及A549 過表達(dá)NC 細(xì)胞系前期已經(jīng)構(gòu)建完畢，可用于直接培養(yǎng)。所有細(xì)胞系均按照建議在含10%FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于37 ℃、5%CO2的311型CO2培養(yǎng)箱中。

1.3 轉(zhuǎn)染 準(zhǔn)備miR-122-5p 模擬物、miR-122-5p 模擬物NC、miR-122-5p 抑制劑、miR-122-5p 抑制劑NC、pcDNA-CPEB1、對(duì)照載體pcDNA-3.1 等質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染前1 天，以50%的細(xì)胞密度分別將A549、A549/DDP細(xì)胞株接種到12 孔板中，待細(xì)胞數(shù)量增加達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求后待用。轉(zhuǎn)染前2 h，將含有10%FBS 的RPMI 1640 完全培養(yǎng)基換為opti-MEM 培養(yǎng)基；制備聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）和上述質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，上述質(zhì)粒的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染濃度為50 nmol/L；分別用50 μL opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋2 μL PEI 和1.25 μL 上述質(zhì)粒，隨后將稀釋好的PEI 和上述質(zhì)?；靹颍糜谑覝胤跤?5 min。將100 μL 上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入細(xì)胞株培養(yǎng)基中，十字混勻搖勻，轉(zhuǎn)染8 h 后更換為500 μL 含有10%FBS 的RPMI 1640 完全培養(yǎng)基。獲得構(gòu)建A549 miR-122-5p 模擬物NC 細(xì)胞株、A549 miR-122-5p 模擬物細(xì)胞株、A549/DDP miR-122-5p 抑制物NC 細(xì)胞株、A549/DDP miR-122-5p 抑制物細(xì)胞株、A549 CPEB1 過表達(dá)NC 細(xì)胞株、A549 CPEB1 過表達(dá)細(xì)胞株；通過RTqPCR 驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.4 總RNA提取和qPCR檢測(cè)UCA1相關(guān)miRNA分子

1.4.1 細(xì)胞總RNA 提取 收集A549 和A549/DDP 的各處理組細(xì)胞沉淀于1.5 mL 的EP 管中，加入1 mL的Trizol，混勻后置于冰上充分裂解細(xì)胞10 min。向每個(gè)EP 管加入200 μL 氯仿于冰上靜置10 min 后離心15 min。吸取上層水相溶液400 μL 至新的EP 管，按同等體積比加入預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻后冰上靜置15 min 后離心15 min。吸去上清液，留RNA 沉淀，加入1 mL 75% 乙醇輕柔吹洗，離心5 min。吸干乙醇，開蓋5 min 使乙醇充分揮發(fā)，加入15 μL RNase-free 水使其溶解。

1.4.2 RNA 濃度檢測(cè) 使用Nano drop 2000 儀器，開機(jī)選擇RNA 濃度測(cè)定程序，用2 μL DEPC 水調(diào)零后進(jìn)行檢測(cè)；取1 μL RNA 樣品進(jìn)行測(cè)定，A260/A280值位于1.8～2.0表示RNA 提取合格，保存于-20 ℃用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 按RrimeScriptTMRT Master Mix 試劑盒說明書，配制反轉(zhuǎn)錄體系。PCR 儀設(shè)定以下程序：反轉(zhuǎn)錄37 ℃，15 min；RNA 酶失活85 ℃，5 s；反應(yīng)終止4 ℃，30 min；將樣本置于PCR 儀中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA，保存于-20 ℃待用。用于檢測(cè)miRNA 的RNA 樣本反轉(zhuǎn)錄采用miDETECT A TrackTMmiRNA qPCR Kit，操作步驟按miDETECT A TrackTMmiRNA qPCR 試劑盒說明書，配制Poly(A) Tailing 體系，混勻后于37 ℃反應(yīng)1 h，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 RT-qPCR 稀釋引物前先進(jìn)行瞬時(shí)離心使其沉于管底，按照管身的說明加入相應(yīng)體積×10 的去離子水，得到10 μmol/L 的工作引物濃度，并置于-20 ℃冰箱保存；按TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書制備10 μL 熒光定量PCR 體系；采用PCR 儀為ABI Q5 PCR 儀，設(shè)定PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；40 個(gè)循環(huán)包括：95 ℃變性5 s，55 ℃退火和延伸34 s。以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）和U6 作為內(nèi)部參考，結(jié)果分析采用2-ΔΔCt法，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建含有miR-122-5p 結(jié)合位點(diǎn)的WT 和Mut 序列UCA1 和CPEB1 的質(zhì)粒，并克隆到含有pmiRGLO 啟動(dòng)子的雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒中，得到pmiRGLO-UCA1-WT/Mut 和pmiRGLO-CPEB1-3'UTR-WT/Mut雙熒光素酶報(bào)告載體。具體實(shí)驗(yàn)分組為：miR-122-5p模擬物NC，miR-122-5p 模擬物，UCA1 WT+miR-122-5p 模擬物NC，UCA1 WT+miR-122-5p模擬物，UCA1 Mut+miR-122-5p模擬物NC，UCA1 Mut+miR-122-5p 模擬物；CPEB1 WT+miR-122-5p 模擬物NC，CPEB1 WT+miR-122-5p 模擬物，CPEB1 Mut+miR-122-5p 模擬物NC，CPEB1 Mut +miR-122-5p 模擬物。將A549 細(xì)胞接種到24 孔板中，置于37 ℃、5%CO2的311 型CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將miR-122-5p 模擬物或模擬物NC 與構(gòu)建的報(bào)告載體pmiRGLOUCA1-WT/Mut 或pmiRGLO- CPEB1-3'UTR-WT/Mut 共轉(zhuǎn)染48 h，最后用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)試劑盒評(píng)價(jià)相對(duì)熒光素酶活性。

1.6 順鉑敏感性試驗(yàn) 將A549 和A549/DDP 細(xì)胞接種在96 孔板中（2×103個(gè)/孔），并培養(yǎng)至細(xì)胞貼滿。隨后，用不同濃度順鉑（0、1、2、4、8、10 μg/mL）培養(yǎng)基代替RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48 h，用10%CCK-8替換每個(gè)孔中的培養(yǎng)液并培養(yǎng)1 h。用微孔板閱讀器在450 nm 處測(cè)量吸光度（A），并計(jì)算細(xì)胞活力，細(xì)胞活力（%）=（A加-A空白）/（A0加藥-A空白）×100%，其中A 加是指不同順鉑濃度（1、2、4、8、10 μg/mL）后細(xì)胞株的吸光度值，A 空白是指沒加細(xì)胞株，沒加藥物的培養(yǎng)基吸光度值，A0 加藥是指加入順鉑馬上檢測(cè)的吸光值。使用GraphPad Prism 8.0 軟件計(jì)算順鉑的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.7 公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物信息學(xué)分析 從腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）公共數(shù)據(jù)庫中下載肺腺癌及正常肺樣本的基因組數(shù)據(jù)，其中肺腺癌535例，匹配的正常肺樣本59個(gè)；肺腺癌組與正常組之間CPEB1 基因表達(dá)水平差異比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。繪制ROC曲線評(píng)價(jià)CPEB1基因診斷肺腺癌的效能，并計(jì)算AUC。采用Kaplan-Meier法繪制低表達(dá)組和高表達(dá)組患者的生存曲線，總生存期比較采用log-rank 檢驗(yàn)。選擇與CPEB1 基因表達(dá)相關(guān)的免疫細(xì)胞，以CPEB1基因表達(dá)高低來分組，比較免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的差異。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0 和SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，配對(duì)樣本比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher 確切概率法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UCA1 與多個(gè)miRNA 發(fā)生互作關(guān)系 根據(jù)miRNA預(yù)測(cè)網(wǎng)站http://www.microrna.org/microrna/home.do 和http://www.mircode.org/預(yù)測(cè)的交集，獲得UCA1調(diào)控相關(guān)miRNA（包括miR-143、miR-18a、miR-18b、miR-96-3p、miR-1271、miR-135a、miR-135b、miR-122-5p、miR-193a、miR-193b、miR-203a）。進(jìn)一步通過RT-qPCR 檢測(cè)獲得miR-122-5p、miR-203a、miR-143、miR-135a、miR-135b 作為UCA1 互作miRNA 分子參與肺腺癌的順鉑耐藥發(fā)生，見圖1。

圖1 UCA1 互作miRNA 分子表達(dá)水平比較結(jié)果（A：A549/DDP 和A549 細(xì)胞株的差異miRNA 表達(dá)情況；B：UCA1 過表達(dá)后差異miRNA 的表達(dá)情況）

2.2 檢測(cè)肺腺癌細(xì)胞及BEAS-2B 細(xì)胞中miR-122-5p的表達(dá)水平 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-122-5p 在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯升高，見圖2A。與miR-122-5p 模擬物NC、miR-122-5p 模擬物、UCA1 WT+miR-122-5p 模擬物NC、UCA1 Mut+miR-122-5p 模擬物NC、UCA1 Mut miR-122-5p 模擬物相比較，UCA1 WT+miR-122-5p 模擬物共轉(zhuǎn)染組的相對(duì)熒光素酶活性明顯下降，見圖2B，表明miR-122-5p 和UCA1 具有結(jié)合位點(diǎn)。

圖2 肺癌細(xì)胞及BEAS-2B 細(xì)胞中miR-122-5p 表達(dá)水平的比較（A：miR-122-5p 在肺腺癌細(xì)胞株的表達(dá)情況；B：miR-122-5p 模擬物或模擬物NC 與構(gòu)建的報(bào)告載體pmiRGLO-UCA1-WT/Mut 共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性比較）

2.3 miR-122-5p 對(duì)肺癌細(xì)胞株順鉑敏感性的影響RT-qPCR 結(jié)果顯示成功構(gòu)建了miR-122-5p 抑制物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，見圖3A；miR-122-5p 抑制后，順鉑IC50濃度從5.1 μg/mL 下降到2.3 μg/mL，提示miR-122-5p敲低后能提高順鉑的藥物敏感性，見圖3B。成功構(gòu)建了miR-122-5p 模擬物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，見圖3C；miR-122-5p 過表達(dá)后，順鉑IC50濃度從2.3 μg/mL 升高到4.8 μg/mL，提示miR-122-5p 過表達(dá)能減低順鉑的藥物敏感性，促進(jìn)順鉑耐藥，見圖3D。

圖3 miR-122-5p 對(duì)肺癌細(xì)胞株順鉑敏感性的影響（A：miR-122-5p 抑制物轉(zhuǎn)染A549/DDP 細(xì)胞株后miR-122-5p 表達(dá)水平的比較；B：miR-122-5p 抑制物轉(zhuǎn)染A549/DDP 細(xì)胞株后順鉑IC50的變化；C：miR-122-5p 模擬物轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞株后miR-122-5p 表達(dá)水平的比較；D：miR-122-5p 模擬物轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞株后順鉑IC50的變化）

2.4 miRNA 熒光素酶發(fā)現(xiàn)miR-122-5p 與CPEB1 存在結(jié)合 進(jìn)一步通過https://www.targetscan.org/vert_71/和https://www.mirbase.org/網(wǎng)站預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-122-5p 與CPEB1 可能存在結(jié)合。隨后檢測(cè)肺腺癌細(xì)胞及BEAS-2B 細(xì)胞中CPEB1 的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)CPEB1 在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯降低，見圖4A。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與miR-122-5p 模擬物NC、miR-122-5p 模擬物、CPEB1 WT+miR-122-5p 模擬物NC、CPEB1 Mut+miR-122-5p 模擬物NC、CPEB1 Mut miR-122-5p 模擬物組比較，CPEB1 WT +miR-122-5p 模擬物組的相對(duì)熒光素酶活性明顯下降，見圖4B，表明miR-122-5p 和CPEB1 具有結(jié)合位點(diǎn)。

圖4 miR-122-5p 與CPEB1 的雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)（A：CPEB1 在肺腺癌細(xì)胞株的表達(dá)情況；B：miR-122-5p 模擬物或NC 與構(gòu)建的報(bào)告載體CPEB1 WT 及CPEB1 Mut 共轉(zhuǎn)染后相對(duì)熒光素酶活性的比較）

2.5 CPEB1 對(duì)肺腺癌細(xì)胞株順鉑敏感性的影響 RTqPCR 結(jié)果顯示成功構(gòu)建了CPEB1 過表達(dá)細(xì)胞株，見圖5A；CPEB1 過表達(dá)后，順鉑IC50濃度從5.2 μg/mL 下降到2.5 μg/mL，見圖5B，提示CPEB1 過表達(dá)能提高順鉑的藥物敏感性，降低順鉑耐藥。

圖5 CPEB1 對(duì)肺腺癌細(xì)胞株順鉑敏感性的影響（A：CPEB1 過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549/DDP 細(xì)胞株后CPEB1 表達(dá)水平的比較；B：CPEB1 過表達(dá)后A549/DDP 細(xì)胞株后順鉑IC50的變化）

2.6 CPEB1 在肺腺癌表達(dá)及與免疫細(xì)胞功能的相關(guān)性 TCGA 公共數(shù)據(jù)庫分析顯示肺腺癌組織CPEB1 mRNA 明顯低于癌旁組織，見圖6A、B；ROC 曲線分析顯示CPEB1 表達(dá)水平能較好地用于診斷肺腺癌（AUC=0.849，95%CI：0.810～0.888），見圖6C，高CPEB1水平與低CPEB1 水平患者的生存預(yù)后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖6D；CPEB1 表達(dá)水平與肺腺癌患者的細(xì)胞功能如T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞存在密切關(guān)聯(lián)，見圖6E。

圖6 數(shù)據(jù)庫CPEB1 mRNA 表達(dá)情況（A：CPEB1 在肺腺癌組織的表達(dá)情況；B：CPEB1 在肺腺癌組織的表達(dá)情況；C：ROC 曲線分析CPEB1 用于肺腺癌的診斷效能；D：高CPEB1 水平與低CPEB1 水平患者生存預(yù)后的比較；E：CPEB1 表達(dá)水平與肺腺癌患者的細(xì)胞功能相關(guān)性）

3 討論

近年來國(guó)內(nèi)外研究表明，順鉑主要通過抑制腫瘤細(xì)胞DNA 合成[8]、誘導(dǎo)凋亡[9]而發(fā)揮作用。順鉑化療抵抗制極其復(fù)雜，是一個(gè)多基因參與的復(fù)雜事件，目前認(rèn)為主要通過如下幾種機(jī)制[10]來實(shí)現(xiàn)：（1）改變細(xì)胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)；（2）降低藥物活性干擾藥物作用機(jī)制；（3）影響DNA 損傷修復(fù)，目前相關(guān)基因如乳腺癌相關(guān)基因1、切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因等；（4）主要信號(hào)通路（PDK/Akt、MAPK/Erk、Wnt 等）的遺傳和表觀遺傳學(xué)改變，使藥物作用凋亡受阻。然而，令人遺憾的是，盡管以往包括基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究取得了不少進(jìn)展，但順鉑化療抵抗機(jī)制仍尚未闡明。

有研究發(fā)現(xiàn)，UCA1 可通過與miRNA 進(jìn)行互作，參與順鉑耐藥機(jī)制[11]。目前文獻(xiàn)報(bào)道UCA1 通過CREB調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞中的miR-196a-5p 促進(jìn)順鉑/吉西他濱耐藥[12]。UCA1 表達(dá)失調(diào)可能通過調(diào)節(jié)microRNA-495/NRF2 信號(hào)通路參與順鉑治療NSCLC 化療耐藥的發(fā)生[13]。本研究通過篩選到UCA1 的多個(gè)相關(guān)miRNA，表明UCA1 可與miRNA 互作參與肺腺癌的順鉑耐藥機(jī)制；結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[14]，筆者初步選定miR-122-5p作為后續(xù)的研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)miR-122-5p 在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯升高，并通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證UCA1 與miR-122-5p 結(jié)合，構(gòu)建miR-122-5p 抑制物和模擬物轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)miR-122-5p 抑制后，順鉑IC50濃度下降，而miR-122-5p 過表達(dá)后，順鉑IC50濃度升高，提示miR-122-5p 能降低順鉑的藥物敏感性，促進(jìn)肺腺癌順鉑耐藥。

本研究通過https://www.targetscan.org/vert_71/和https://www.mirbase.org/網(wǎng)站預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-122-5p 與靶基因CPEB1 可能存在結(jié)合。CPEB1 是指一種序列特異性的RNA 結(jié)合蛋白，可以調(diào)節(jié)mRNA 多聚腺苷酸化和翻譯以及腫瘤的發(fā)生[15]。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CPEB1 在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯降低，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)CPEB1 是與miR-122-5p 結(jié)合；構(gòu)建CPEB1 過表達(dá)質(zhì)粒染肺腺癌細(xì)胞株，CPEB1 過表達(dá)后，順鉑IC50濃度減低，提示CPEB1 過表達(dá)能提高順鉑的藥物敏感性，減低順鉑耐藥，表明CPEB1 參與肺腺癌順鉑耐藥機(jī)制。有報(bào)道顯示，CPEB1 降低會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)乳腺癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移[16]。本研究對(duì)公共數(shù)據(jù)庫分析顯示肺腺癌組織CPEB1 mRNA 明顯低于癌旁組織，ROC 曲線分析顯示CPEB1 表達(dá)水平能較好地用于診斷肺腺癌（AUC=0.849），分析顯示CPEB1 表達(dá)水平與肺腺癌患者的細(xì)胞功能如T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞存在密切關(guān)聯(lián)。

綜上所述，UCA1 與miR-122-5p 存在結(jié)合位點(diǎn)，后者可影響肺腺癌的順鉑耐藥，并與靶基因CPEB1 結(jié)合；肺腺癌中CPEB1 呈低表達(dá)，降低肺腺癌順鉑藥物的敏感性。UCA1/miR-122-5p/CPEB1 軸有望為干預(yù)肺腺癌順鉑耐藥的靶點(diǎn)。