低溫脅迫聯(lián)合乳酸菌發(fā)酵對藜麥富集γ-氨基丁酸的影響

黃振勇，淡明，韋馨平，周主貴，梁曉君，張娥珍*

（1.廣西農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,廣西南寧 530007；2.廣西果蔬貯藏與加工新技術(shù)重點實驗室,廣西南寧 530007；3.南寧市農(nóng)業(yè)科學研究所,廣西南寧 530021）

藜麥（ChenopodiumquinoɑWilld）又名印地安麥、南美藜,原產(chǎn)于南美安第斯山脈的高海拔地區(qū)[1],藜麥營養(yǎng)價值極高,被稱為“營養(yǎng)黃金”[2-3],藜麥富含黃酮、多酚、皂苷、γ-氨基丁酸等活性成分[4],此外還富含人體必需的氨基酸和非必需氨基酸,特別是含有其他谷物沒有的賴氨酸和組氨酸[5-6]。藜麥被聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織認定為能滿足正常人體所需全部營養(yǎng)物質(zhì)的單一作物,其生理功效多,可作為糖尿病人群的主食[7]。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）是一種非蛋白質(zhì)類氨基酸,具有降血糖[8]、降血壓[9]、緩解阿爾茲海默癥[10]、抗衰老[11]、改善睡眠質(zhì)量[12]等保健功能。GABA 廣泛存在于谷物、果蔬中,具有緩解焦慮、降血壓、調(diào)控體質(zhì)量等多種生物活性,但天然谷物中GABA含量普遍較低,采用植物代謝（發(fā)芽）及微生物發(fā)酵等處理可有效富集GABA[13-14]。研究表明,植物代謝萌發(fā)處理能調(diào)整谷物營養(yǎng)結(jié)構(gòu)、改善感官特性、提高谷物營養(yǎng)價值和保健功能；微生物發(fā)酵處理可改善食品風味、提高營養(yǎng)價值,因此,可考慮采用適當手段提高藜麥營養(yǎng)價值[15-16]。目前在藜麥的生長發(fā)育、營養(yǎng)價值、功能成分、基因分析及生理功能方面已有大量的研究,藜麥萌發(fā)期營養(yǎng)與功能成分變化、GABA 的富集及藜麥芽食品開發(fā)等藜麥精深加工產(chǎn)品研究也逐漸成為熱門[17-19]。本文對低溫脅迫聯(lián)合乳酸菌發(fā)酵富集藜麥GABA 工藝進行研究,以期為提高藜麥中GABA 含量和藜麥功能產(chǎn)品精深加工研發(fā)提供技術(shù)參考,對藜麥產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白藜麥:市售；植物乳桿菌LK-1:中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；γ-氨基丁酸（標準品）:上海源葉生物科技有限公司；次氯酸鈉、無水乙醇（均為分析純）:成都市科隆化學品有限公司；硼酸（分析純）:天津市科密歐化學試劑有限公司；苯酚（分析純）:成都金山化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

人工氣候箱（RGX-250B）:紹興市景邁儀器設備有限公司；電熱鼓風干燥箱（WGLL-230BE）、高速萬能粉碎機（FW80）:天津市泰斯特儀器有限公司；紫外可見分光光度計（UV-6100）:上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 GABA 標準曲線的制定

采用Berthelotb 比色法進行測定[20]。分別將GABA 標準液（1 mg/mL）稀釋成濃度為0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16 mg/mL 的梯度液,準確吸取0.5 mL 各梯度液于比色管,依次加入pH9.0、濃度為0.2 mol/L 的硼酸緩沖液0.2 mL、6% 苯酚溶液1 mL 和10% 次氯酸鈉0.4 mL,渦旋振蕩器混合均勻,98 ℃水浴反應7 min,取出后立即冰水浴,出現(xiàn)藍綠色后加入60%乙醇溶液2 mL,于630 nm 處測定吸光值,得回歸方程:y=2.896 4x+0.041 8,R2=0.999 1。

1.3.2 藜麥萌發(fā)處理

參考馬麗等[21]和陳益勝等[22]的方法稍作修改,選擇籽粒飽滿、完好、無損壞的白藜麥,用0.1%次氯酸鈉溶液浸泡30 min,隨后用無菌水沖洗4 次,加入2 mg/mL谷氨酸鈉溶液沒過藜麥,浸泡3 h 撈出瀝干,平鋪于塑料盤中進行低溫脅迫處理,處理完成后取出,無菌水浸泡使其恢復到室溫,撈出瀝干平鋪于4 層紗布培養(yǎng)盤中,放置于人工氣候箱中避光培養(yǎng),萌發(fā)結(jié)束后65 ℃熱風烘干至恒重,粉碎,過60 目篩,備用。同時,以不作任何處理的原藜麥（ck1）作為空白對照,考察發(fā)芽對藜麥GABA 含量的影響。

1.3.3 發(fā)芽藜麥發(fā)酵處理

準確稱取15 g 發(fā)芽后烘干、粉碎好的藜麥粉,按料液比1∶10（g/mL）添加無菌水,加入6 mg/mL 抗壞血酸,混勻溶解,接種乳酸菌菌種,隨后置于人工氣候箱中恒溫發(fā)酵,定時取樣測定樣品中GABA 含量。同時,以未發(fā)酵的發(fā)芽藜麥粉（ck2）作空白對照,考察發(fā)酵對藜麥GABA 含量的影響。

1.3.4 樣品中GABA 含量測定

取粉碎后的樣品3.0 g 于100 mL 三角瓶中,加入50 mL 蒸餾水,在超聲波清洗器中超聲提取90 min,8 000 r/min 離心15 min 取上清液,準確移取上清液0.5 mL,按標曲方法測定上清液中GABA 含量。

1.3.5 發(fā)芽工藝單因素試驗

根據(jù)單因素變量原則,分別在脅迫溫度為4、0、-7、-15、-24、-36、-80 ℃,脅迫時間為1、2、3、4、5、6 h,發(fā)芽溫度為26、29、32、35、38 ℃,發(fā)芽時間為6、12、18、24、30 h 情況下,測定發(fā)芽后藜麥中GABA 含量。

1.3.6 發(fā)芽工藝正交優(yōu)化試驗

在單因素基礎上,選擇合適的因素水平設計L9（34）正交試驗進行藜麥發(fā)芽工藝條件優(yōu)化。正交因素與水平見表1。

表1 發(fā)芽正交試驗Table 1 Germination orthogonal experiment

1.3.7 發(fā)酵工藝單因素試驗

準確稱取15 g 發(fā)芽后烘干、粉碎好的藜麥粉,按料液比1∶10（g/mL）添加無菌水,加入6 mg/mL 抗壞血酸,混合均勻。根據(jù)單因素變量原則,分別測定在乳酸菌接種量為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.3%、3.0%,發(fā)酵溫度為28、32、36、40、44 ℃,發(fā)酵時間為6、12、18、24、30 h 情況下發(fā)酵藜麥中GABA 含量。

1.3.8 發(fā)酵工藝正交優(yōu)化試驗

根據(jù)發(fā)酵條件單因素試驗結(jié)果,選擇合適的因素水平進行乳酸菌發(fā)酵藜麥富集GABA 工藝優(yōu)化,因素水平見表2。

表2 發(fā)酵正交試驗Table 2 Fermentation orthogonal experiment

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有指標均進行3 次重復試驗,結(jié)果以平均值±標準差表示,試驗數(shù)據(jù)用Excel 軟件處理,用Origin pro 2017進行顯著性分析并繪圖,P<0.05 表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果分析

2.1 脅迫溫度對發(fā)芽藜麥γ-氨基丁酸含量的影響

藜麥采用不同溫度脅迫后再進行萌芽培養(yǎng),藜麥種子富集的GABA 含量有較大差異。不同脅迫溫度對藜麥GABA 含量影響見圖1。

圖1 脅迫溫度對藜麥GABA 含量影響Fig.1 Effects of stress temperature on GABA content in quinoa

如圖1 所示,以低溫脅迫藜麥種子后再進行萌發(fā)培養(yǎng),發(fā)芽后藜麥GABA 含量較原藜麥（ck1）均有所提高；在脅迫溫度為-7 ℃時,藜麥中GABA 含量達到了1.36 mg/g,是原藜麥（ck1）的3.29 倍；繼續(xù)降低脅迫溫度,發(fā)芽藜麥富集GABA 能力有所下降,在脅迫溫度低于-24 ℃時,發(fā)芽藜麥中GABA 含量沒有較大變化。脅迫溫度造成發(fā)芽藜麥GABA 含量存在差異的原因可能是適當?shù)拿{迫溫度使藜麥中谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase,GAD）被激活,促進谷氨酸脫羧形成GABA,但是脅迫溫度過低,酶活被抑制,谷氨酸不能完全脫羧,導致GABA 積累受阻,因此含量有所下降[21]。由試驗結(jié)果可知,脅迫溫度選擇在0～-15 ℃之間較為合適。

2.2 脅迫時間對發(fā)芽藜麥γ-氨基丁酸含量的影響

脅迫時間對藜麥GABA 含量影響見圖2。

圖2 脅迫時間對藜麥GABA 含量影響Fig.2 Effect of stress time on GABA content in quinoa

如圖2 所示,在脅迫時間為4 h 時,同條件下培養(yǎng),發(fā)芽藜麥中GABA 含量達1.38 mg/g,是原藜麥（ck1）的3.34 倍；繼續(xù)延長脅迫時間,GABA 含量有所降低,原因可能是當脅迫時間較長時,為了抵抗逆環(huán)境,合成的GABA 經(jīng)GABA 轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)變成琥珀酸半醛,琥珀酸半醛又經(jīng)琥珀酸半醛脫氫酶轉(zhuǎn)變成為琥珀酸,隨后進入三羧酸循環(huán),因此導致GABA 含量有所消耗[23]。從試驗結(jié)果可知,藜麥低溫脅迫時間在3～5 h 較為合適。

2.3 發(fā)芽溫度對發(fā)芽藜麥γ-氨基丁酸含量的影響

適宜的環(huán)境溫度對種子的發(fā)芽具有促進作用,低溫脅迫后的藜麥種子在不同環(huán)境溫度中萌發(fā)對GABA含量的積累具有較大影響,發(fā)芽溫度對藜麥GABA 含量影響見圖3。

圖3 發(fā)芽溫度對藜麥GABA 含量影響Fig.3 Effect of germination temperature on GABA content in quinoa

如圖3 所示,不同發(fā)芽溫度下,發(fā)芽后GABA 含量均比原藜麥（ck1）有所提高；在發(fā)芽溫度低于32 ℃時,發(fā)芽藜麥中GABA 快速積累,在發(fā)芽溫度達到32 ℃時,GABA 含量達到了1.49 mg/g,是原藜麥（ck1）的3.61 倍；在發(fā)芽溫度高于32 ℃時,GABA 含量有所下降。產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因可能是隨著發(fā)芽溫度逐漸升高,GAD 酶活能力提高,GABA 含量快速積累,但是溫度過高,有害微生物容易滋生,藜麥中營養(yǎng)物質(zhì)遭到破壞,引起GAD 酶活能力下降,因此積累的GABA 含量有所減少[24]。由試驗結(jié)果可知,發(fā)芽溫度在29～35 ℃藜麥發(fā)芽積累GABA 含量較佳。

2.4 發(fā)芽時間對發(fā)芽藜麥γ-氨基丁酸含量的影響

發(fā)芽是植物種子利用自身貯藏的營養(yǎng)物質(zhì)成長為幼苗的過程,不同程度的萌發(fā)對種子內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)的損耗不同,發(fā)芽時間對藜麥種子GABA 含量影響見圖4。

圖4 發(fā)芽時間對藜麥GABA 含量影響Fig.4 Effect of germination time on GABA content in quinoa

如圖4 所示,隨著發(fā)芽時間的延長,發(fā)芽藜麥中GABA 含量逐漸積累,在發(fā)芽時間為18 h 時,GABA 含量達到了1.47 mg/g,是原藜麥（ck1）的3.56 倍；在發(fā)芽時間18 h 以上時,GABA 含量有所下降,主要原因可能是發(fā)芽時間過長,在轉(zhuǎn)氨酶作用下GABA 轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌镔|(zhì),導致含量下降[25]。同時,發(fā)芽時間過長容易滋生有害細菌,導致腐爛、變質(zhì),從而影響GABA 含量。因此發(fā)芽時間在12～24 h 比較適合。

2.5 發(fā)芽工藝正交優(yōu)化試驗

在單因素基礎上,設計L9（34）正交試驗對脅迫溫度、脅迫時間、發(fā)芽溫度和發(fā)芽時間4 個因素進行工藝優(yōu)化,結(jié)果如表3、表4 所示。

表3 發(fā)芽工藝正交優(yōu)化Table 3 Orthogonal optimization of germination process

表4 發(fā)芽工藝正交試驗方差分析Table 4 Variance analysis of germination process orthogonal experiment

由圖3 可知,各因素對低溫脅迫藜麥發(fā)芽富集GABA 工藝影響次序為發(fā)芽時間>脅迫溫度>發(fā)芽溫度>脅迫時間。正交試驗組合中A2B3C1D2組合GABA 含量為1.61 mg/g,為試驗組中含量最高,但直觀分析得到組合A2B3C3D2為最佳,分別對這兩組工藝進行驗證,結(jié)果顯示,采用工藝組合A2B3C3D2藜麥發(fā)芽后GABA 含量為（1.71±0.01）mg/g,高于組合A2B3C1D2,是原藜麥（ck1）的4.14 倍,因此,確定工藝組合A2B3C3D2為最佳發(fā)芽工藝,即脅迫溫度為-7 ℃,脅迫時間為5 h,發(fā)芽溫度為35 ℃,發(fā)芽時間為18 h。4 個因素中,發(fā)芽時間對藜麥GABA 含量的積累有顯著影響（P<0.05）。

2.6 乳酸菌接種量對發(fā)芽藜麥γ-氨基丁酸含量的影響

接種量大小對乳酸菌在發(fā)酵底物中的生長繁殖速度具有較大影響,在接種一定量乳酸菌菌種后,發(fā)芽藜麥中GABA 含量變化見圖5。

圖5 乳酸菌接種量對發(fā)芽藜麥GABA 含量影響Fig.5 Effect of lactic acid bacteria inoculation amount on GABA content in germinated quinoa

如圖5 所示,相同發(fā)酵時間內(nèi),隨著乳酸菌接種量的提高,GABA 含量有較大變化,在接種量為2.0%時,GABA 含量最高達到了2.17 mg/g,是發(fā)酵前藜麥（ck2）的1.27 倍,是原藜麥（ck1）的5.26 倍；繼續(xù)提高接種量,GABA 含量有所下降,原因可能是接種量過大引起藜麥中乳酸菌生長過于旺盛,容易出現(xiàn)菌種衰老,導致發(fā)酵效率下降[26]。因此乳酸菌接種量為2.0% 左右較為合適。

2.7 發(fā)酵溫度對發(fā)芽藜麥γ-氨基丁酸含量的影響

溫度是微生物生長繁殖的重要因素,不同發(fā)酵溫度下,乳酸菌發(fā)酵對藜麥GABA 含量的影響見圖6。

圖6 發(fā)酵溫度對發(fā)芽藜麥GABA 含量影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on GABA content in germinated quinoa

如圖6 所示,在發(fā)酵溫度較低情況下,藜麥中GABA 含量積累較緩慢,隨著發(fā)酵溫度的升高,GABA含量積累較快,在發(fā)酵溫度為36 ℃時,藜麥GABA 含量最高達到了2.05 mg/g,是發(fā)酵前藜麥（ck2）的1.20 倍,是原藜麥（ck1）的4.96 倍。適當提高發(fā)酵溫度有利于乳酸菌的生長繁殖,從而促進GABA 的積累。因此,接種乳酸菌后發(fā)酵溫度36 ℃左右較為合適。

2.8 發(fā)酵時間對發(fā)芽藜麥γ-氨基丁酸含量的影響

合理控制發(fā)酵時間是降低生產(chǎn)成本、實現(xiàn)經(jīng)濟效益最大化的關(guān)鍵,不同發(fā)酵時間內(nèi),乳酸菌發(fā)酵對藜麥GABA 含量的影響見圖7。

圖7 發(fā)酵時間對發(fā)芽藜麥GABA 含量影響Fig.7 Effect of fermentation time on GABA content in germinated quinoa

如圖7 所示,隨著發(fā)酵時間的延長,發(fā)酵藜麥中GABA 含量增加,在發(fā)酵時間為18 h 時,GABA 含量達到了2.18 mg/g,是發(fā)酵前藜麥（ck2）的1.27 倍,是原藜麥（ck1）的5.28 倍。造成試驗現(xiàn)象的原因可能是發(fā)酵時間過長,積累的GABA 轉(zhuǎn)化形成其他物質(zhì),從而導致含量下降。因此接種乳酸菌后發(fā)酵時間為18 h 左右較為合適。

2.9 發(fā)酵條件正交優(yōu)化

在乳酸菌發(fā)酵單因素基礎上,進行三因素三水平正交優(yōu)化試驗,結(jié)果見表5、表6。

表5 發(fā)酵工藝正交優(yōu)化Table 5 Orthogonal optimization of fermentation process

表6 發(fā)酵工藝正交試驗方差分析Table 6 Variance analysis of fermentation process orthogonal experiment

通過表5、表6 可知,3 個因素影響藜麥發(fā)酵富集GABA 的次序為G>E>F,即發(fā)酵時間>接種量>發(fā)酵溫度,其中發(fā)酵時間對發(fā)酵效果有顯著性影響。直觀分析顯示,其最佳組合為E2F1G3,但試驗組中以E2F1G2效果最好,分別對該兩組工藝進行對比驗證,結(jié)果顯示,采用工藝組合E2F1G2發(fā)酵藜麥所富集的GABA 達（2.45±0.01）mg/g,含量較高,是發(fā)酵前藜麥（ck2）的1.43 倍,是原藜麥的5.92 倍,故確定組合E2F1G2為最佳發(fā)酵工藝,即接種量為2.0%,發(fā)酵溫度為32 ℃,發(fā)酵時間為18 h。

3 結(jié)論

為提高藜麥的營養(yǎng)價值,以藜麥為原料,采用低溫脅迫方式對藜麥種子進行冷處理后培養(yǎng)使其萌發(fā),結(jié)果表明,藜麥種子在合適低溫環(huán)境中進行一定時間的冷處理,對藜麥種子萌發(fā)具有促進作用,萌發(fā)后種子中GABA 含量比未處理組高；將發(fā)芽藜麥進行乳酸菌發(fā)酵處理,發(fā)酵后GABA 含量有較大幅度的提高,說明乳酸菌發(fā)酵能夠進一步提高藜麥GABA 含量。綜上表明,低溫脅迫聯(lián)合乳酸菌發(fā)酵對提高藜麥種子GABA 含量有一定的效果,后期將對藜麥種子在低溫脅迫過程中內(nèi)源激素、內(nèi)酶等物質(zhì)活性的變化規(guī)律以及乳酸菌發(fā)酵過程中GABA 合成轉(zhuǎn)化規(guī)律進行深入研究。