德氏乳桿菌KY20 胞外多糖對C57BL/6 小鼠肥胖的預防作用

張?zhí)煊睿昃矗荑?，趙崇杰，江雨男，秦琳琳，孫偲，郝力壯，陳勉，王楠*

（1.天津科技大學生物工程學院,教育部工業(yè)發(fā)酵微生物學重點實驗室,天津 300457；2.青海百分牛生物科技有限公司,青海西寧 810016；3.青海大學青海省高原放牧家畜動物營養(yǎng)與飼料科學重點實驗室,青海西寧 810016；4.山東省藥學科學院,山東濟南 250101）

近年來,我國肥胖和Ⅱ型糖尿病的發(fā)病率快速上升。據(jù)2020 年國家衛(wèi)健委公布的數(shù)據(jù),18 歲以上成年人肥胖率達到16.4%[1-2],2019 年,在中國非傳染性疾病相關的死亡病例中,由超重和肥胖導致的占11.1%[3]。目前,緩解肥胖的手段主要包括飲食調節(jié)、運動、手術治療和藥物調節(jié)。但手術治療和藥物調節(jié)存在安全性、副作用等問題,所以僅適用于少數(shù)患者[4-5],相對而言人們更愿意接受健康合理的飲食調節(jié)方式。近年來,益生菌及其后生元對健康的調節(jié)作用日益受到人們的關注,益生菌的干預可以有效改善肥胖,并具有公認的安全性。

已有大量研究證實益生菌可以緩解肥胖[6]、降低胰島素抵抗[7]、減輕炎癥[8],對肥胖及其并發(fā)癥具有較好的改善作用[9-10],其主要機制包括抑制膽固醇合成酶活性、抑制食欲進而減少攝入高熱量食物、調節(jié)腸道菌群、改善腸道屏障、降低炎癥因子水平、提高胰島素敏感性等。目前已有多種乳酸菌菌株表現(xiàn)出較為明顯的抗肥胖作用。Zarrati 等[11]以76 名健康超重和肥胖個體為研究對象,發(fā)現(xiàn)益生菌（嗜酸乳桿菌La5、雙歧桿菌BB12 和干酪乳桿菌DN001）酸奶及減肥飲食干預會明顯降低體質量指數(shù)和脂肪百分比。補充合生元（含有嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌和雙歧桿菌加菊粉）也可以為超重或肥胖的受試者帶來許多健康益處,包括改善甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、體重、壓力、焦慮和抑郁[12]。干酪乳桿菌IMV B-7280[13]、發(fā)酵乳桿菌KUB-D18[14]等均已被證實具有降膽固醇、抑制肥胖的效果。Hallajzadeh 等[15]證實德氏乳桿菌PTCC1057 能夠顯著降低糖尿病小鼠血糖水平。

乳酸菌的胞外多糖（exopolysaccharide,EPS）是乳酸菌生長代謝過程中分泌的一類糖類化合物,具有抗氧化、抗腫瘤、調節(jié)機體免疫、改善腸道菌群等多種功效[16-17]。除了上述研究較多的功效,也有少量研究證實乳酸菌的胞外多糖可以改善肥胖。Zhang 等[18]研究表明,從鼠李糖乳桿菌GG 中分離的EPS 能夠有效降低高脂飲食誘導的肥胖小鼠肝臟三酰甘油和膽固醇水平,抑制脂肪形成。相對而言,德氏乳桿菌胞外多糖在抗肥胖方面的研究較少,因此,對其EPS 降脂減肥功效的研究具有重要意義。本課題組前期從河套地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離得到一株德氏乳桿菌KY20,發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗氧化活性,但菌株及其EPS 是否具有降脂減肥的作用尚未可知。因此本研究通過分離提取KY20 的胞外多糖,探究KY20 及其胞外多糖對肥胖的抑制作用,旨在為預防治療肥胖及其相關疾病提供新的研究思路和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與動物

自河套地區(qū)分離的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的德氏乳桿菌保加利亞亞種KY20:保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心,CGMCC 編號20084；無特定病原體（specific pathogen free,SPF）動物C57BL/6J 雄性小鼠[6～8 周齡,許可證號SCXK（京）2021-0006]:北京維通利華實驗動物技術有限技術公司；動物高脂飼料（D12492）:美國Research Diets 公司。

1.1.2 主要試劑

MRS 液體培養(yǎng)基:北京索萊寶科技有限公司；三氯乙酸、無水乙醇（均為分析純）:天津市江天化工技術有限公司；總膽固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（triglyceride,TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein-cholesterol,HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein-cholesterol,LDL-C）測定試劑盒:南京建成生物工程研究所。

1.1.3 儀器與設備

臺式離心機（TGL-16C 型）:上海天呈實驗儀器制造有限公司；厭氧培養(yǎng)箱（SPX-150 型）:湖南凱達科學儀器有限公司；厭氧培養(yǎng)箱（YQX-Ⅲ）:上海躍進醫(yī)療器械有限公司；多功能酶標儀（iD3）:美谷分子儀器（上海）有限公司；血糖儀、血糖試紙（優(yōu)易GM501）:三諾生物傳感股份有限公司；氣相色譜儀（GC-7890）:美國Agilent 公司；傅里葉變換紅外光譜儀（Bruker Vetex 70 FT-IR）:德國布魯克公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的生長曲線及耐受性的測定

1.2.1.1 菌株的生長曲線

將活化兩次的KY20 接種于MRS 液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,每隔1 h 取樣1 次,并在波長600 nm 處測定吸光值,繪制菌株的生長曲線。

1.2.1.2 耐酸性、耐膽鹽能力測定

耐酸能力測定:將KY20 接種于pH 值為1.0、2.0、3.0、4.0 的MRS 液體培養(yǎng)基中；耐膽鹽能力測定:將KY20 接種于不同膽鹽濃度（0.1%、0.2%、0.3%）的MRS液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中4 h,通過測量490 nm 處的吸光值,按照下列公式計算存活率。

式中:ɑ為存活率,%；b為實驗組吸光值；c為對照組的吸光值。

1.2.1.3 耐藥性測定

采用K-B 紙片擴散法,將37 ℃倒置培養(yǎng)24 h 后的平板取出測定其抑菌圈直徑。

1.2.2 胞外多糖的提取、純化及結構分析

1.2.2.1 胞外多糖的提取和純化

KY20 培養(yǎng)過夜后收集菌液煮沸,除去菌體沉淀,將發(fā)酵液在8 000 r/min、4 ℃離心20 min,收集上清液,蒸發(fā)濃縮；三氯乙酸法除蛋白,水提醇沉法提取多糖,透析后真空冷凍即為胞外多糖粗品。將胞外多糖粗品過DEAE-52 陰離子交換柱,分別收集0～0.5 mol/L NaCl 洗脫溶液,其中以0.1 mol/L NaCl 洗脫的多糖為主,收集并合并單一峰組分,去離子水透析至無Cl-檢出并冷凍干燥。

1.2.2.2 胞外多糖的主要成分測定

參考王曉楠[19]的方法,通過苯酚-硫酸法測定多糖含量,間羥基聯(lián)苯法測定糖醛酸含量,考馬斯亮藍法測定蛋白質含量；參考仇小妹等[20]的方法,通過Folin 法測定總酚含量。

1.2.2.3 胞外多糖的分子量測定

使用高效液相色譜（high performance liquid chromatography,HPLC）對多糖的分子量進行測定,色譜柱為TSKgel G4000PWXL（10μm,7.8 mm×300 mm）,進樣量為20μL,流速為0.5 mL/min,柱溫為38 ℃。采用不同分子量的D-葡聚糖為標準品繪制標準曲線為y=-31 617x+30.684,根據(jù)出峰時間計算樣品的相對分子質量。

1.2.2.4 紫外光譜測定

用雙蒸水配制0.5 mg/mL 多糖溶液,用0.22μm濾膜過濾后進行紫外光譜掃描（波長230～380 nm）,樣品流速為0.5 mL/min。

1.2.2.5 傅里葉變換紅外光譜測定

將干燥的EPS（2 mg）用溴化鉀粉末（200 mg）研磨并壓制成片劑,然后使用傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm-1范圍內掃描。

1.2.3 動物實驗

1.2.3.1 小鼠分組與飼養(yǎng)

C57BL/6J 小鼠用普通飼料適應性喂養(yǎng)1 周后隨機分為6 組,分別為正常組、模型組、KY20 組、EPS 低劑量組、EPS 中劑量組、EPS 高劑量組。正常組為普通飼料喂養(yǎng),模型組、KY20 組、EPS 組均給予高脂飼料喂養(yǎng),KY20 組按照1×108CFU/次給予KY20,EPS 低、中、高組分別按50、100 mg/kg 和200 mg/kg 給予KY20 胞外多糖,各組均隔日灌胃,連續(xù)12 周。

1.2.3.2 葡萄糖耐量（glucose tolerant,GTT）的測定

實驗結束前,按2 g/kg 葡萄糖劑量對小鼠進行腹腔注射,在不同時間對小鼠進行尾靜脈取血,測量小鼠的血糖值并計算曲線下面積（area under curve,AUC）,AUC 的計算公式如下。

式中:A為AUC,h·（mmol/L）；c0min、c15min、c30min、c60min、c120min為不同時間的血糖值,mmol/L。

1.2.3.3 胰島素耐量（insulin tolerant,ITT）的測定

實驗結束前,按照0.75 U/kg 的胰島素劑量對小鼠進行腹腔注射,在不同時間測量小鼠的血糖值。按照

1.2.3.2 公式計算曲線下面積。

1.2.3.4 胰島素抵抗指數(shù)測定

對小鼠進行尾尖取血并用血糖儀測量空腹血糖,采用試劑盒檢測小鼠血清中的胰島素含量,計算胰島素抵抗指數(shù)（homeostatic model assessment of insulin resistance,HOMA-IR）。HOMA-IR 計算公式如下。

式中:z為胰島素抵抗指數(shù)；m為胰島素含量,mmol/L；n為空腹血糖值,mmol/L；22.5 為校正因子。

1.2.3.5 樣品采集

實驗結束后,對小鼠進行眼球取血,收集血清于-20 ℃保存；取小鼠的肝臟、腎臟、胰腺、脾臟進行稱重,并將肝臟、脂肪固定于多聚甲醛；取皮下、附睪、肩胛脂肪組織并稱重,取盲腸內容物于-80 ℃保存。

1.2.3.6 組織病理學分析

取小鼠的組織置于固定液中,使組織、細胞的蛋白質變性凝固,蒸餾水清洗組織表面的固定液后,分別用不同濃度的乙醇浸泡,逐漸脫去組織中的水分；然后用體積比為1∶1 的無水乙醇與二甲苯溶液、二甲苯溶液分別浸泡30 min,以二甲苯替換出組織中的乙醇；將透明的組織用石蠟液體浸滲3 次,每次1 h,用包埋框包埋,固定好后切成3μm 薄片,并在恒溫攤片烤片機中37.5 ℃恒溫下進行烤片2 h；用二甲苯脫去切片中的石蠟后,不同濃度的乙醇處理除去切片中的二甲苯,蒸餾水浸泡1 min,自然風干,磷酸鹽緩沖液清洗3 次后進行染色；蘇木素染色3 min；自來水洗片2 min；用1%鹽酸酒精溶液分化；用2% 伊紅溶液染色3 min；蒸餾水沖洗2 min,重復3 次；無水乙醇脫水,二甲苯透明；中性樹膠封片；最后在正置熒光顯微鏡下進行觀察。

1.2.3.7 血脂指標測定

將血清放置冰上解凍后,按照相應試劑盒的操作步驟,采用多功能酶標儀測定血清中總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的含量。

1.2.3.8 短鏈脂肪酸（short chain fatty acid,SCFAs）含量的測定

取小鼠盲腸內容物,溶于蒸餾水中,渦旋混勻,4 ℃、12 000 r/min 離心取上清液加入100μL 10%硫酸溶液,渦旋混勻后加入1 mL 乙酸乙酯繼續(xù)渦旋4 ℃離心制備樣品。采用的色譜柱及相應進樣條件:色譜柱為HP-5（30 m×320μm×0.25μm）,進樣量為1μL,進樣口溫度為250 ℃,分流比為1∶1,柱流速為2 mL/min,柱溫:初始柱溫為90 ℃,持續(xù)6 min,以10 ℃/min 升至200 ℃,并保持6 min。載氣的流速為2 mL/min。（氫）火焰離子化檢測器檢測器溫度為250 ℃,氫氣和空氣的流量分別為30 mL/min 和300 mL/min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗結果以平均值±標準差表示,實驗數(shù)據(jù)利用軟件Graphpad prism 6 進行統(tǒng)計學分析,多組間比較采用one-way ANOVA 分析,P<0.05 時,表示與比較組有統(tǒng)計學差異。

2 結果與討論

2.1 菌株KY20 的生長與益生特性

2.1.1 菌株KY20 的生長曲線

德氏乳桿菌KY20 的生長曲線見圖1。

圖1 德氏乳桿菌KY20 的生長曲線Fig.1 Growth curve of Lactobacillus delbrueckii KY20

由圖1 可知,德氏乳桿菌KY20 在4 h 后進入對數(shù)生長期,9 h 進入平衡期,達到最大生長速率。

2.1.2 菌株KY20 耐受性結果分析

菌株KY20 的耐受性如圖2 所示。

圖2 德氏乳桿菌KY20 的耐受性Fig.2 Tolerance of Lactobacillus delbrueckii KY20

由圖2A 可知,菌株KY20 在pH1、pH2、pH3 條件下培養(yǎng)4 h 后存活率分別為（44.26±1.21）%、（49.18±1.42）%和（50.01±0.64）%,而pH4 條件下存活率可達（81.54±1.75）%。由圖2B 可知,將菌株KY20 在膽鹽濃度為0.10%、0.20% 和0.30% 的MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h 后,存活率分別為（84.08±4.67）%、（59.10±0.95）%和（52.86±1.19）%。因此,德氏乳桿菌KY20 展示出較強的耐酸、膽鹽耐受能力。

2.1.3 菌株KY20 藥敏試驗結果

德氏乳桿菌KY20 的藥物敏感性見表1。

表1 德氏乳桿菌KY20 的藥物敏感性Table 1 Antibiotic susceptibility of Lactobacillus delbrueckii KY20

由表1 可知,德氏乳桿菌KY20 對青霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、利福平敏感；對鏈霉素和紅霉素中度敏感；而對亞胺培南、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素、頭孢噻吩、頭孢他啶、頭孢噻肟、萬古霉素均不敏感。

2.2 菌株KY20 胞外多糖提取分離與性質鑒定

2.2.1 菌株KY20 胞外多糖提取分離

EPS 洗脫曲線及HPLC 分析見圖3。

圖3 EPS 洗脫曲線及HPLC 分析Fig.3 Elution curve and HPLC analysis of exopolysaccharide

由圖3 可知,經(jīng)DEAE-52 陰離子交換樹脂進行不同濃度NaCl 溶液洗脫后,德氏乳桿菌KY20 洗脫峰以0.1mol/L NaCl 洗脫液為主,說明粗多糖中以酸性多糖為主。將0.1mol/L NaCl 溶液洗脫的多糖進行HPLC分析,在11.766 min 處出現(xiàn)了單一對稱的尖峰,表明其為分子質量均一的較純組分,根據(jù)標準曲線,計算得到其分子量約為0.96×103kDa。進一步測定其多糖純度為（76.43±0.77）%,蛋白質含量為（1.41±0.10）%,糖醛酸含量為（2.29±0.08）%,總酚含量為（0.55±0.24）%。

2.2.2 EPS 的紫外和紅外光譜分析

德氏乳桿菌KY20 的紫外光譜和紅外光譜見圖4。

圖4 德氏乳桿菌KY20 的紫外光譜和紅外光譜Fig.4 Ultraviolet spectrum and infrared spectra of Lactobacillus delbrueckii KY20

如圖4A 所示,純化后的多糖在230～380 nm 波長范圍內,沒有出現(xiàn)核酸（260 nm）和蛋白質（280 nm）的明顯特征吸收峰,說明不存在或存在非常少量的核酸和蛋白質。如圖4B 所示,在3 380 cm-1附近具有強且寬的吸收峰,這個吸收峰是糖類O—H 官能團的伸縮振動引起的,代表該多糖存在分子間和分子內氫鍵。在2 927 cm-1處的吸收峰是由C—H 官能團的伸縮振動引起的,在這個區(qū)域的吸收峰是糖類物質的另一個特征吸收峰。而在1 070 cm-1和1 654 cm-1附近的峰被指定為CO 基團；1 240.57 cm-1處—COOH 中O—H變角振動吸收峰,代表多糖分子間存在羧基或乙?；鶊F。

2.3 動物實驗結果

2.3.1 菌株KY20 及其EPS 對高脂飲食小鼠體質量的影響

德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖對肥胖小鼠體質量的影響見表2。

表2 德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖對肥胖小鼠體質量的影響Table 2 Effect of Lactobacillus delbrueckii KY20 and its exopolysaccharide on the weight of obese mice

由表2 可知,各組小鼠初始體質量無明顯差異,第7 周之前,除正常組外,其余各組與模型組體質量相差不大,7 周后與正常組相比,模型組體質量增長較快,給予KY20 和其EPS 組體質量增長較為緩慢。第12 周實驗結束時,與正常組相比,模型組小鼠體質量顯著升高,而KY20 及不同劑量的EPS 對小鼠體質量的增加均有抑制作用,其中KY20 及EPS 低劑量組抑制作用最顯著。

2.3.2 菌株KY20 及其EPS 對高脂飲食小鼠脂肪質量的影響

德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖對肥胖小鼠脂肪質量的影響見表3。

表3 德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖對肥胖小鼠脂肪質量的影響（n=6）Table 3 Effect of Lactobacillus delbrueckii KY20 and its exopolysaccharide on the fat weight of obese mice（n=6）

由表3 可知,模型組總脂肪質量、附睪脂肪質量和皮下脂肪質量與正常組相比,均具有顯著差異,而肩胛脂肪質量無顯著差異。與模型組相比,KY20 能夠顯著減輕附睪脂肪和總脂肪質量,但對肩胛脂肪和皮下脂肪質量沒有顯著影響。與模型組相比,EPS 低、中劑量組可以顯著減輕附睪脂肪質量,EPS 高劑量組對不同組織的脂肪均有一定的減輕作用,但沒有顯著性差異。

2.3.3 菌株KY20 及其EPS 對高脂飲食小鼠臟器指數(shù)的影響

德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖對肥胖小鼠臟器指數(shù)的影響見表4。

表4 德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖對肥胖小鼠臟器指數(shù)的影響（n=6）Table 4 Effect of Lactobacillus delbrueckii KY20 and its exopolysaccharide on the organ index of obese mice（n=6）

由表4 可知,高脂飲食對小鼠肝臟、脾臟均具有顯著性影響,而對腎臟和胰腺的影響無顯著性差異。其中對肝臟影響最為顯著,KY20 及不同劑量的EPS 對肥胖小鼠肝臟指數(shù)增大具有顯著的抑制作用,同時對肥胖小鼠脾臟指數(shù)的增大也具有不同程度的抑制作用,其中KY20 及EPS 低劑量和中劑量組的抑制作用較為顯著。

2.3.4 菌株KY20 及其EPS 對高脂飲食小鼠GTT、ITT以及HOMA-IR 的影響

長期的高脂飲食會引起胰島素介導的相關作用減弱,比如脂解抑制作用,促使肝臟生成內源性葡萄糖,而胰島素不能抑制肝糖原的合成,從而導致肝臟發(fā)生胰島素抵抗,引起了血糖水平的升高[21]。KY20 及其EPS 對高脂飲食小鼠GTT、ITT 以及HOMA-IR 的影響結果如圖5、圖6、圖7 所示。

圖5 德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖對高脂飲食小鼠糖耐量的影響Fig.5 Effect of Lactobacillus delbrueckii KY20 and its exopolysaccharide on glucose tolerance in mice fed with high-fat diet

圖6 德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖對高脂飲食小鼠胰島素耐量的影響Fig.6 Effect of Lactobacillus delbrueckii KY20 and its exopolysaccharide on insulin tolerance in mice fed with high-fat diet

圖7 德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖對高脂飲食小鼠胰島素抵抗的影響Fig.7 Effect of Lactobacillus delbrueckii KY20 and its exopolysaccharide on insulin resistance in mice fed with high-fat diet

由圖5A 可知,注射葡萄糖后各組小鼠的血糖水平均表現(xiàn)為迅速上升,隨后便呈現(xiàn)下降的趨勢,正常組血糖值在2 h 后恢復到正常水平,而模型組血糖水平下降與其他組相比較為緩慢,2 h 后仍處于較高的水平。由圖5B 可知,模型組、德氏乳桿菌KY20 組及其不同劑量EPS 組的葡萄糖耐量均顯著高于正常組；與模型組相比,德氏乳桿菌KY20 及其不同劑量的EPS均能夠改善高脂飲食誘導的肥胖小鼠葡萄糖耐量,其中,胞外多糖中劑量組效果顯著。

由圖6A 可知,除KY20 組外,其他組小鼠血糖值水平在注射胰島素30 min 時降至最低,隨后便呈現(xiàn)回升趨勢,模型組小鼠血糖水平與其他組小鼠相比下降較為遲緩,表現(xiàn)出胰島素抵抗。由圖6B 可知,與模型組相比,KY20 組及EPS 低劑量組均顯著降低。

由圖7 可知,正常組小鼠的胰島素抵抗指數(shù)處于較低水平,模型組小鼠胰島素抵抗指數(shù)最高,而KY20組及其胞外多糖組的小鼠胰島素抵抗指數(shù)顯著低于模型組。

已有研究證實,嗜酸乳桿菌NS1 顯著減輕了高脂飲食誘導的肥胖并改善胰島素敏感性[22]。Andreasen等[23]以45 名2 型糖尿病患者為研究對象,給予口服補充嗜酸乳桿菌NCFM,結果發(fā)現(xiàn)與安慰劑相比,口服NCFM 可以較好地保持胰島素敏感性。本研究中德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖有效改善了肥胖小鼠的胰島素耐受性和葡萄糖耐受性,提高了胰島素敏感性,并改善了胰島素抵抗。

2.3.5 菌株KY20 及其EPS 對高脂飲食小鼠肝臟、脂肪的病理學和血脂指標的影響

長期高脂飲食會引起體內代謝紊亂,導致血清中TC、TG、LDL-C 水平的升高和HDL-C 水平降低,引起肝內脂肪堆積形成脂肪肝。KY20 及其EPS 對高脂飲食小鼠肝臟、脂肪的病理學和血脂指標的影響如圖8、圖9 和表5 所示。

表5 德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖對高脂飲食小鼠TG、TC、LDL-C 和HDL-C 含量的影響（n=6）Table 5 Effect of Lactobacillus delbrueckii KY20 and its exopolysaccharide on triglyceride（TG），total cholesterol（TC），lowdensity lipoprotein-cholesterol（LDL-C），high-density lipoproteincholesterol（HDL-C）of mice fed with high-fat diet（n=6）mmol/L

圖8 德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖對高脂飲食小鼠肝臟的病理學影響Fig.8 Pathological effect of Lactobacillus delbrueckii KY20 and its exopolysaccharide on the liver of mice fed with high-fat diet

圖9 德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖對高脂飲食小鼠脂肪的病理學影響Fig.9 Pathological effect of Lactobacillus delbrueckii KY20 and its exopolysaccharide on the fat of mice fed with high-fat diet

由圖8 可知,正常組肝臟組織表現(xiàn)為肝細胞排列規(guī)則,結構整齊,邊界清晰。而模型組小鼠有較明顯的細胞邊界不清,肝臟結構紊亂現(xiàn)象,KY20 及其EPS 能夠顯著減輕這些病變,使肝臟組織的形態(tài)趨于正常。

由圖9 可知,正常組小鼠的脂肪細胞排列較為規(guī)則,呈圓形；而肥胖小鼠脂肪細胞與其他組小鼠的脂肪細胞相比明顯偏大,有較明顯的脂肪堆積和脂肪變性,KY20 及其EPS 能夠明顯減小脂肪細胞體積,使脂肪細胞形態(tài)和排列趨于正常。

由表5 可知,與正常組相比,模型組的TC、TG、LDL-C 含量顯著升高,而HDL-C 含量顯著降低。與模型組相比,KY20 及其不同劑量的胞外多糖均可以不同程度降低TC、TG、LDL-C 的含量,其中KY20 組能夠較為顯著降低TC、TG 的含量并升高HDL-C 含量,而中劑量組能顯著降低LDL-C 的含量。

研究表明,益生菌可以有效降低血清、血漿中的膽固醇水平,改善整體脂質譜。Liu 等[24]研究表明,副干酪乳桿菌24 可以通過調節(jié)腸道菌群組成降低高脂飲食小鼠的體質量和脂肪沉積,降低血清膽固醇、肝臟脂肪和甘油三酯含量,改善肝臟脂肪變性。此外,微生物EPSs 由于其減脂降糖、抗腫瘤、抗氧化、免疫調節(jié)和抗病毒活性[25],在食品、醫(yī)學等領域具有較高的應用價值。從副干酪乳桿菌M7 分離出的EPS 在體外濃度為0.1%時,將膽固醇水平降低了70.78%[26],從植物乳桿菌RFJ4 中分離得到的EPS 將膽固醇降低了42.24%[27]。植物乳桿菌L-14 的EPS 可以通過TLR2 和AMPK 信號通路抑制脂肪生成,口服L-14 提取物改善高脂飲食誘導的小鼠肥胖[28]。本研究證實德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖均可以有效降低血清中TC、TG、LDL-C 水平,并且升高了HDL-C,也緩解了高脂飲食誘導的肝臟中脂肪堆積和脂肪細胞的肥大。

2.3.6 菌株KY20 及其EPS 對高脂飲食小鼠SCFAs的影響

腸道微生物發(fā)酵膳食纖維、多糖產(chǎn)生SCFAs,SCFAs是腸道上皮細胞的主要能量來源,在維持腸道屏障、調節(jié)先天免疫、抑制炎癥反應和維持腸道微環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要的作用。KY20 及其EPS 對高脂飲食小鼠SCFAs 的影響如圖10 所示。

圖10 德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖對高脂飲食小鼠血脂SCFAs 的影響Fig.10 Effect of Lactobacillus delbrueckii KY20 and its exopolysaccharide on the short chain fatty acids（SCFAs）of mice fed with high-fat diet

由圖10 可知,與正常組相比,模型組的乙酸、丙酸、丁酸的含量顯著降低。與模型組相比,德氏乳桿菌KY20 組及不同劑量的胞外多糖對不同短鏈脂肪酸具有一定的恢復作用,其中對丁酸的上調作用最為顯著。Zhao 等[29]發(fā)現(xiàn)SCFAs 中的乙酸和丁酸可以通過上調肽酪氨酸（peptide tyrosine tyrosine,PYY）和胰高血素樣肽-1（glucagon-like peptide-1,GLP-1）的水平,抑制中樞神經(jīng),減少食欲,從而達到減輕體質量的效果。本研究通過對肥胖小鼠盲腸內容物的檢測發(fā)現(xiàn),德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖均顯著逆轉了由高脂飲食誘導肥胖小鼠丁酸水平下降的情況,從而減輕了肥胖小鼠的體質量。

3 結論

本研究中從德氏乳桿菌KY20 提取的EPS 是分子量為0.96×103kDa 的酸性多糖,EPS 低、中、高劑量對肥胖小鼠各項指標均具有一定的改善效果,其中低劑量組和中劑量組在體部分指標中具有顯著優(yōu)勢。

KY20 菌株具有良好的酸耐受性和膽鹽耐受能力,且菌株KY20 及其胞外多糖均可以有效抑制高脂飲食誘導的肥胖,降低肥胖小鼠的體質量,改善血脂代謝紊亂、改善肝臟脂肪變性程度和脂肪細胞肥大、調節(jié)葡萄糖耐受和胰島素耐受,因此,本研究對于德氏乳桿菌KY20 及其后生元（胞外多糖）在食品、醫(yī)藥領域的應用開發(fā)具有積極意義。