氯沙坦降低癲癇大鼠共患抑郁癥風(fēng)險的機制研究☆

潘楠楠 胡雅純 廖雪珍 石喆 施海姍

據(jù)統(tǒng)計約有20%～61%的癲癇患者共患有抑郁癥[1-2]。癲癇共患抑郁癥會加重患者癲癇發(fā)作的頻率、降低抗癲癇藥物的療效，對患者和社會造成不利影響[3-4]。目前關(guān)于癲癇的治療仍以控制癲癇發(fā)作為主[5]，并不能減少癲癇共患抑郁癥的患病率。氯沙坦（losartan）是一種廣泛用于治療高血壓的血管緊張素受體拮抗劑。近年研究發(fā)現(xiàn)氯沙坦可以減少癲癇發(fā)作[6-7]，另外還具有抑制炎癥損傷的作用，可以在炎癥損傷的靶器官內(nèi)下調(diào)高遷移率族蛋白B1（high-mobility group protein B1，HMGB1）表達，減輕炎癥反應(yīng)，從而改善預(yù)后[8]。而HMGB1 相關(guān)的炎癥反應(yīng)在癲癇和抑郁癥的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用。因此本研究將氯沙坦用于癲癇模型大鼠，觀察氯沙坦是否可以通過下調(diào)HMGB1表達，改善癲癇大鼠海馬區(qū)炎癥反應(yīng)，從而降低癲癇共患抑郁癥的風(fēng)險，為癲癇共患抑郁癥的預(yù)防提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 癲癇大鼠模型的建立及分組 成年SD 雄性大鼠（體質(zhì)量150～180 g，n=24）購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。大鼠飼養(yǎng)在SPF 環(huán)境中，食物和水可自由攝取。本實驗所有步驟遵守中華人民共和國科技部發(fā)布的《實驗動物福利倫理指南》，并獲得廣州醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

大鼠采用隨機數(shù)字表法分為3 組：匹羅卡品-氯沙坦（pilocarpine and losartan，PL-L）組（n=8）接受鋰-匹羅卡品腹腔注射建模，建模成功后給予氯沙坦干預(yù)；匹羅卡品（pilocarpine，PL）組（n=8）接受鋰-匹羅卡品腹腔注射建模；對照（control，Ctrl）組（n=8）接受氯化鋰腹腔注射。

按照既往鋰-匹羅卡品模型方案建立癲癇大鼠模型[9]，具體操作步驟：腹腔注射氯化鋰（127 mg/kg，Sigma-Aldrich，美國），18～24 h 后腹腔注射東莨菪堿（1 mg/kg，阿拉丁，P424411，上海），30 min后腹腔注射匹羅卡品（30 mg/kg，阿拉丁，P344660，上海），當(dāng)大鼠出現(xiàn)Racine 標(biāo)準(zhǔn)Ⅳ級及以上發(fā)作后開始計時[10]，30 min 內(nèi)發(fā)作3 次視為癲癇持續(xù)狀態(tài)誘導(dǎo)成功，癲癇持續(xù)狀態(tài)持續(xù)90 min后予腹腔注射地西泮注射液（10 mg/kg）終止發(fā)作。對照組大鼠給予等量的氯化鋰、東莨菪堿和生理鹽水，不注射匹羅卡品。Racine 分級[10]：Ⅰ級為面部陣攣，包括眨眼、動須、節(jié)律性咀嚼、濕狗樣顫抖；Ⅱ級為I級+節(jié)律性點頭；Ⅲ級為Ⅱ級+前肢陣攣；Ⅳ級為Ⅲ級+后肢站立；Ⅴ級為Ⅳ級+跌倒。

1.2 氯沙坦干預(yù) 參考既往文獻給予氯沙坦干預(yù)[11]：PL-L 組大鼠在癲癇大鼠模型建立成功24 h 后給予氯沙坦（浙江華海藥業(yè)股份有限公司）60 mg/kg腹腔注射，連用3 d，后將氯沙坦以2 g/L 溶于大鼠飲用水中，連用18 d。PL組和Ctrl組飲用正常飲用水。

1.3 抑郁行為學(xué)評估 采用體質(zhì)量增長量和蔗糖偏愛實驗來評估大鼠的抑郁樣行為。體質(zhì)量增長量的測量：各組大鼠在實驗結(jié)束后連續(xù)測量體質(zhì)量1周，計算每只大鼠1 周之內(nèi)的體質(zhì)量增長量。蔗糖偏愛實驗：大鼠單籠飼養(yǎng)，實驗前給予2 瓶1%蔗糖水進行適應(yīng)性訓(xùn)練；正式實驗時，首先禁水16 h，然后在適應(yīng)性訓(xùn)練時同樣位置放置事先稱重的2 瓶水（1%的蔗糖水和普通飲用水），飲用4 h，中間水瓶交換位置一次；實驗結(jié)束后撤下2 瓶水并稱重（g），計算大鼠的糖水偏愛率。糖水偏愛率＝[糖水消耗量/（糖水消耗量+普通飲用水消耗量）]×100%。

1.4 RT-PCR 檢測HMGB1、IL-1β 和IL-6 相對mRNA 表達量 抑郁樣行為評估結(jié)束后，所有大鼠用10%水合氯醛麻醉，經(jīng)升主動脈插管至左心房，4 ℃的生理鹽水約150 mL 沖洗后取腦，在冰上將海馬分離出來后在液氮中快速冷凍，并在-80 ℃下保存，用于實時逆轉(zhuǎn)錄定量PCR（RT-PCR）分析。使用TRIzol 試劑（Sigma，美國）從海馬中分離總RNA，總RNA 由納米dropND-1000（Thermo 科學(xué)，美國）定量，用無酶DNase 試劑盒（Promega，麥迪遜，美國）消化以去除DNA 污染。將mRNA 逆轉(zhuǎn)錄，使用高容量cDNA-RT 試劑盒（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）進行cDNA 檢測，然后使用SYBR 綠色跳躍啟動Taq準(zhǔn)備混合物（Sigma，美國）進行RT-PCR。使用Prime 5.0 軟件設(shè)計引物。HMGB1：正向引物CACT TGGATGTTGAATGCCTC，反向引物TGAAACATCC AAAACTGCCAGA。IL-1β：正向引物TTGAGTCTG CACAGTTCCC，反向引物GTCAACTATGTCCCGAC CA。IL-6：正向引物CTGCCTTCCCTACTTCACA，反向引物ATATGTAATTAAGCCTCCGACT。GAPD H：正向引物CTTCTTGTGCAGTGCCAGCC，反向引物CAAGAGAAGGCAGCCCTGGT。RT-PCR 分3 個階段進行：第一階段在95℃預(yù)熱30 s；第二個階段共40個周期，包括在95 ℃ 5 s，在60 ℃ 30 s；第三階段包括在95 ℃ 15 s，在60 ℃ 1 min，在95 ℃ 15 s。采用比較ΔΔCt法對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。為了減少取樣造成的誤差，對每個樣本進行3 次RT-PCR 分析，并取平均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。圖表應(yīng)用Graph-Pad Prism 5 制作。多組比較采用單因素方差分析，兩組之間比較采用LSD-t法，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 癲癇發(fā)作情況 所有注射匹羅卡品的大鼠發(fā)生Racine Ⅳ級以上的癲癇發(fā)作，并持續(xù)發(fā)作90 min以上。其中有4 只老鼠死于癲癇發(fā)作持續(xù)狀態(tài)。最后PL-L組6只大鼠，PL組6只，Ctrl組8只。

2.2 大鼠抑郁樣行為學(xué)評估結(jié)果 體質(zhì)量增長量結(jié)果顯示，3 組之間的體質(zhì)量增長量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=10.89,P＜0.01）。PL 組大鼠體質(zhì)量增長量較Ctrl 組減少（P＜0.01），PL-L 組大鼠體質(zhì)量增長量較PL組增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），而PL-L組大鼠體質(zhì)量增長量與Ctrl 組相比，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.64）。見表1。

Tab.1 Results of depression-like behavior assessment of rats in each group表1 各組大鼠抑郁樣行為學(xué)評估結(jié)果

蔗糖偏愛實驗結(jié)果顯示，3 組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=13.21,P＜0.01）。PL 組大鼠糖水偏愛率低于較Ctrl 組大鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；PL-L 組大鼠糖水偏愛率高于PL 組大鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而PL-L 組大鼠糖水偏愛率雖然低于Ctrl 組，但兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.12）。見表1。

2.3 氯沙坦對HMGB1 mRNA 相對表達量的影響3 組大鼠海馬區(qū)HMGB1 mRNA 相對表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=20.62,P＜0.01）。與Ctrl 組相比，PL組大鼠海馬區(qū)HMGB1 mRNA 相對表達量增加（P＜0.01）；PL-L組大鼠海馬區(qū)HMGB1 mRNA相對表達量較PL組減少（P＜0.01），與Ctrl組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.07）。見圖1、表2。

Fig.1 HMGB1 mRNA expression in the hippocampus of rats in each group圖1 各組大鼠海馬區(qū)HMGB1 相對mRNA 的表達量 注：** P＜0.001。

Tab.2 The expression of HMGB1, IL-1β and IL-6 mRNA in hippocampus of rats in each group表2 各組大鼠海馬區(qū)HMGB1、IL-1β和IL-6 mRNA相對表達量

2.4 氯沙坦對大鼠海馬區(qū)炎癥因子表達的影響 3組大鼠海馬區(qū)IL-1β（F=17.38，P＜0.01）和IL-6（F=6.04，P=0.04）mRNA的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義。PL組大鼠海馬區(qū)IL-1β（P＜0.01）和IL-6（P=0.03）mRNA 相對表達量較Ctrl組增加；PL-L 組大鼠海馬區(qū)IL-1β（P＜0.01）和IL-6（P=0.02）mRNA 相對表達量較PL 組減少，而與Ctrl 組相比，則差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

3 討論

癲癇患者易共患抑郁癥，而抑郁癥又會加重癲癇患者的病情，并降低其生活質(zhì)量[12]。因此，預(yù)防癲癇患者共患抑郁癥具有重要意義?；诮陙黻P(guān)于癲癇共患抑郁癥的相關(guān)機制研究，本研究采用氯沙坦干預(yù)癲癇大鼠，觀察氯沙坦在癲癇共患抑郁癥中的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，PL 組大鼠呈現(xiàn)出體質(zhì)量減少以及快感缺失等抑郁樣行為表現(xiàn)，這與之前的研究結(jié)果[13]一致。給予氯沙坦干預(yù)后，PL-L 組大鼠的抑郁樣行為較PL組大鼠明顯好轉(zhuǎn)，與Ctrl組大鼠無明顯差異。這些結(jié)果提示，氯沙坦干預(yù)可能降低了癲癇大鼠出現(xiàn)抑郁樣行為的風(fēng)險，表明氯沙坦在減輕癲癇相關(guān)抑郁癥狀方面具有潛在的治療效果。

氯沙坦是一種常用的抗高血壓藥物，通過選擇性地阻斷血管緊張素Ⅱ受體1（AT1 受體），抑制血管緊張素Ⅱ的生物學(xué)效應(yīng)[14-15]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，氯沙坦還具有減輕炎癥損傷、抑制包括HMGB1在內(nèi)的多種炎性因子釋放的作用[16-17]。氯沙坦的抗炎作用可能是通過抑制血管緊張素Ⅱ生物學(xué)效應(yīng)，間接地降低HMGB1 的表達和釋放[18]；也可能直接影響HMGB1 的核內(nèi)轉(zhuǎn)運和細胞外釋放，從而抑制HMGB1 在炎癥反應(yīng)中的作用[19-20]。在動物癲癇模型中，氯沙坦已被證實可能通過改變其腦內(nèi)炎癥因子水平，降低癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度或提高抗癲癇藥物的療效[21]。本研究發(fā)現(xiàn)PL 組大鼠海馬區(qū)HMGB1 mRNA相對表達量較Ctrl組顯著增加，而氯沙坦干預(yù)后與PL 組大鼠相比，PL-L 組大鼠海馬區(qū)HMGB1 mRNA相對表達量明顯減少，與Ctrl組相比則無統(tǒng)計學(xué)差異。這些結(jié)果表明，氯沙坦可以減少癲癇大鼠海馬區(qū)HMGB1的表達。

HMGB1 是一種高度保守的核蛋白，在細胞核內(nèi)廣泛存在，是損傷相關(guān)分子模式（damageassociated molecular patterns，DAMP）家族的典型成員，具有多種生物學(xué)功能，包括維護DNA 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄以及調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)[22-23]。在炎癥和免疫反應(yīng)中，HMGB1 被認為是重要的促炎因子，在炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮作用，促進炎癥細胞的遷移和活化，并誘導(dǎo)炎癥因子的釋放[24-25]。研究證實癲癇發(fā)作可導(dǎo)致海馬區(qū)細胞損傷和死亡，這些損傷促進HMGB1 釋放，HMGB1 可以通過與細胞表面的受體（如晚期糖基化終末產(chǎn)物受體和Toll 樣受體4）結(jié)合，激活下游信號通路，增加炎癥介質(zhì)（如IL-1β、IL-6 等）的合成和釋放，充當(dāng)“損傷相關(guān)分子模式”以誘導(dǎo)炎癥對靶器官的損傷，加重癲癇發(fā)作[26-27]。而炎癥因子，如IL-1β、IL-6等，可影響神經(jīng)遞質(zhì)的合成、釋放和再攝取[28-29]，從而導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)失衡，進而影響情緒調(diào)節(jié)和抑郁癥的發(fā)生[30-31]。本研究發(fā)現(xiàn)PL 組大鼠海馬區(qū)HMGB1 mRNA 相對表達量明顯增加的同時，IL-1β、IL-6的mRNA 相對表達量水平也增加，而給與氯沙坦干預(yù)后PL-L 組大鼠海馬區(qū)HMGB1 mRNA 相對表達量明顯減少，同時IL-1β、IL-6 的mRNA 相對表達量水平降低。

如何預(yù)防癲癇共患抑郁癥是癲癇治療的重要挑戰(zhàn)。綜上所述，本研究初步證實了氯沙坦可通過抑制HMGB1 釋放，減少炎癥因子IL-1β、IL-6 的表達，從而減少癲癇大鼠共患抑郁癥的風(fēng)險。這提示氯沙坦可能成為預(yù)防癲癇共患抑郁癥的有效方法。然而，考慮到臨床應(yīng)用與動物實驗之間的差異，以及癲癇共患抑郁癥的復(fù)雜性，將來尚需開展更多的研究來證實。