宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染與P16、Ki-67蛋白表達(dá)

戴瑜珍，何 松，喻朝霞，胡曉安，張 潤

(1.安慶市第一人民醫(yī)院 病理科，安徽 安慶 246003;2.南通市腫瘤醫(yī)院 病理科，江蘇 南通 226361)

宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)、鱗狀細(xì)胞癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的癌前病變和惡性腫瘤。近年來，人們對宮頸癌的病因、發(fā)病機(jī)制和臨床治療等研究取得了一定進(jìn)展?，F(xiàn)已明確高危型人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是子宮頸癌的發(fā)病原因之一。為了探討HPV感染和P16、Ki-67蛋白在不同宮頸病變中的表達(dá)以及與宮頸鱗狀細(xì)胞癌的相關(guān)性，作者應(yīng)用原位雜交和免疫組化技術(shù)對200例宮頸尖銳濕疣、CIN和宮頸鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)行分析，旨在提高宮頸上皮病變病理診斷的準(zhǔn)確性。

1 材料和方法

1.1 材料 200例標(biāo)本均選自我院2008年1月～2010年12月間行宮頸活檢或Leep刀錐切或?qū)m頸鱗癌手術(shù)切除病例。其中尖銳濕疣性病變伴有鱗狀上皮增生40例、CINⅠ級50例、CINⅡ～Ⅲ級85例、宮頸浸潤性鱗癌25例。另選10例因子宮平滑肌瘤而切除的宮頸標(biāo)本，且經(jīng)光鏡證實(shí)為鱗狀上皮無異常者作對照。所有病例行常規(guī)HE染色，光鏡下觀察形態(tài)，確定病理診斷及分組。腫瘤分型按WHO(2003)女性生殖系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2 試劑與方法 原位雜交法(ISH)檢測HPV 6/11、HPV 16/18，含地高辛標(biāo)記的 HPV 6/11、HPV 16/18原位雜交試劑盒購自福州泰普生物科技有限公司。ISH檢測主要步驟:切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水，微波加熱脫水干燥，每張切片滴加25 μl地高辛標(biāo)記的HPV 6/11、16/18探針，加蓋蓋玻片，95℃變性后于37℃含雜交增效液的濕盒中孵育過夜(＜16 h)，清洗后加 A、B、C試劑分化，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。將宮頸濕疣切片加陽性探針作為陽性對照，TBS代替陽性探針作為陰性對照。免疫組化(IHC)Supervision二步法檢測P16、Ki-67蛋白，即用型抗體以及SP試劑盒購自福州邁新生物試劑有限公司，染色步驟參照試劑盒說明書，以TBS代替一抗作為陰性對照，乳腺癌組織作為陽性對照。

1.3 結(jié)果判定 HPV 6/11、16/18原位雜交以細(xì)胞核呈棕褐色信號判斷為雜交陽性。P16蛋白免疫組化染色以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)，或細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)同時(shí)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。根據(jù)陽性細(xì)胞分布于局灶或局限于上皮基底層為(+);分布于宮頸鱗狀上皮下1/3～2/3層為(?);分布于下2/3～全層為(?)。Ki-67蛋白僅基底層細(xì)胞核表達(dá)為(－);陽性細(xì)胞數(shù) ＜25%為(+);25% ～50%為(?);＞50%為(?)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，顯著性分析采用 χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析，α取0.05。

2 結(jié)果

2.1 HPV在不同宮頸病變中的表達(dá)(表1)HPV 6/11、16/18在宮頸尖銳濕疣、CIN、鱗狀細(xì)胞癌中有不同程度感染，總陽性率為64%(128/200)。在宮頸尖銳濕疣性病變中主要為低危型HPV 6/11陽性，陽性率為80%(32/40)，陽性細(xì)胞位于棘細(xì)胞層上部的挖空細(xì)胞和角質(zhì)層不全角化細(xì)胞，基底層細(xì)胞無陽性信號(圖1)。在宮頸 CIN組，高危型HPV16/18陽性率為57%(77/135)，CINⅠ級組織中陽性細(xì)胞散在于中～底層(圖2)，CINⅡ～Ⅲ級組織中陽性細(xì)胞明顯增加(圖3、4)，且陽性率隨著CIN級別增加呈逐級增高。高危型HPV16/18在宮頸CINⅡ～Ⅲ級和宮頸鱗狀細(xì)胞癌組中(圖5)陽性率分別為72%(61/85)和68%(17/25)，明顯高于其他組。

圖1 宮頸尖銳濕疣HPV6/11檢測呈陽性原位雜交(×100)Fig 1 Positive HPV 6/11 for cervical warts(×100)

圖2 宮頸CINⅠ級中底層細(xì)胞核HPV16/18檢測呈陽性原位雜交(×200)Fig 2 Positive HPV 16/18 seen in the basal and medial layers in case of CINⅠ (×200)

圖3 宮頸CINⅡ～Ⅲ級細(xì)胞核HPV16/18檢測呈陽性原位雜交(×200)Fig 3 Positive HPV 16/18 observed in nucleus in cases of CINⅡ－Ⅲ (×200)

圖4 宮頸CINⅡ～Ⅲ級細(xì)胞核HPV16/18檢測呈陽性原位雜交(×400)Fig 4 Positive HPV 16/18 found in nucleus in cases of CINⅡ－Ⅲ (×400)

圖5 宮頸鱗癌HPV16/18檢測呈陽性原位雜交(×400)Fig 5 Positive HPV 16/18 detected in case of cervical squamous carcinoma(×400)

表1 HPV在不同宮頸病變中的表達(dá)Tab 1 HPV expressed in distinct cervical lesions

2.2 P16、Ki-67蛋白在不同宮頸病變中的表達(dá)(表2)P16蛋白和Ki-67蛋白在宮頸對照組表達(dá)均為陰性。P16蛋白在不同程度的宮頸鱗狀上皮病變中為胞核和胞質(zhì)均著色的強(qiáng)陽性表達(dá)(圖6)，在CINⅠ級、CINⅡ～Ⅲ級和鱗狀細(xì)胞癌陽性表達(dá)率分別為72%、100%、100%，在宮頸病變及不同級別間表達(dá)有顯著性差異(χ2=110.807，P ＜0.01)，且隨著級別的增高表達(dá)增強(qiáng)。Ki-67蛋白表達(dá)(圖7)情況與P16蛋白相似，呈遞增趨勢(χ2=113.283，P ＜0.01)。CINⅡ～Ⅲ和鱗狀細(xì)胞癌組的 P16、Ki-67蛋白陽性表達(dá)率均高于宮頸非腫瘤性宮頸上皮病變組;宮頸尖銳濕疣組的陽性表達(dá)率低于CINⅠ級且主要呈弱陽性表達(dá)。

圖6 P16蛋白在宮頸CINⅢ級細(xì)胞質(zhì)和胞核陽性表達(dá)IHC(×100)Fig 6 P16 is positively expressed in the cytoplasm and nucleus in case of CINⅢ (×100)

圖7 Ki-67蛋白在宮頸鱗癌中陽性表達(dá)(×200)Fig 7 Positive expression of Ki-67 in case of cervical squamous carcinoma(×200)

表2 P16、Ki-67蛋白在不同宮頸病變中的表達(dá)Tab 2 Expression of protein P16/Ki-67 in distinct cervical lesions

2.3 HPV檢測與P16、Ki-67蛋白表達(dá)之間的關(guān)系(表3) 高危型HPV16/18感染組中，P16和Ki-67蛋白表達(dá)率明顯高于低危型HPV 6/11感染組。高危型HPV16/18感染組與P16和Ki-67蛋白表達(dá)之間呈正相關(guān)性(rs分別為 0.612、0.484，P ＜ 0.05)。在HPV陰性組中，P16和Ki-67蛋白也有不同程度的表達(dá)，兩者在低危型HPV 6/11組中表達(dá)率分別為38%和25%，在高危型HPV 16/18組中分別為50%和58%。

表3 HPV檢測與P16、Ki-67蛋白表達(dá)之間的關(guān)系Tab 3 Results of HPV detection and P16/Ki-67 expression

3 討論

國際癌癥研究中心2004年總結(jié)提出，HPV感染是宮頸鱗狀細(xì)胞癌和上皮內(nèi)瘤發(fā)生的必要因素，沒有持續(xù)HPV感染，女性發(fā)生宮頸癌的可能性幾乎為零［1］。有研究認(rèn)為，高危型HPV感染與宮頸鱗狀細(xì)胞癌和癌前病變的發(fā)生關(guān)系密切［2，3］，致癌作用與HPV DNA的整合有關(guān)，其中的E6和E7干擾細(xì)胞增殖周期，使細(xì)胞無限增殖，這是目前認(rèn)為HPV導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的分子學(xué)基礎(chǔ)。本組對宮頸尖銳濕疣性病變、CIN、鱗狀細(xì)胞癌的200例標(biāo)本以及10例對照病例的HPV原位雜交檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病變組織陽性率為64%，其中HPV 16/18感染率為48%，HPV 6/11陽性率為16%，10例對照組HPV全部為陰性，提示宮頸鱗狀上皮病變與HPV感染密切相關(guān)。在鱗狀細(xì)胞癌、CINⅡ～Ⅲ級病變組中以HPV 16/18型感染明顯，宮頸尖銳濕疣病變組中以HPV 6/11感染為主。HPV 16/18在宮頸CINⅠ級和CINⅡ～Ⅲ級病變中的陽性表達(dá)率呈遞增趨勢，但CINⅡ～Ⅲ級和宮頸癌兩組之間無明顯差異，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致［2，3］。我們認(rèn)為檢測高危型 HPV對宮頸CIN級別的診斷及宮頸癌早期診斷有著重要的參考價(jià)值，可作為宮頸癌篩查和追蹤管理中有效、可行的方法之一。

正常細(xì)胞周期進(jìn)程是在一系列細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控下通過DNA合成和有絲分裂而完成的。若細(xì)胞周期異?；虬┗蚧罨鸵职┗蚴Щ?，細(xì)胞將進(jìn)入異常增殖狀態(tài)，造成細(xì)胞過度增殖，凋亡減少，最終導(dǎo)致癌變發(fā)生。P16蛋白作為一種抑癌基因，參與細(xì)胞周期調(diào)控，本組對抑癌基因P16蛋白的檢測結(jié)果顯示，對照組中P16蛋白表達(dá)為陰性，而在CIN組、鱗狀細(xì)胞癌中均有較高表達(dá)，且隨著病變級別的增加，陽性表達(dá)率也增加，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［4］。提示P16蛋白表達(dá)上調(diào)在宮頸癌前病變、鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)展過程中起著一定作用，可能與宮頸癌的發(fā)生相關(guān)［5］。我們認(rèn)同P16蛋白免疫組化檢測對確診宮頸CIN有診斷價(jià)值，并可作為檢測宮頸癌的較特異的指標(biāo)［6］。另外，我們發(fā)現(xiàn)P16蛋白在宮頸尖銳濕疣病變組中呈弱陽性表達(dá)，而在CINⅡ～Ⅲ級和鱗狀細(xì)胞癌組中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，提示P16蛋白可作為宮頸鱗狀上皮腫瘤性增生與非腫瘤性增生鑒別診斷的標(biāo)記物［7］。

P16與HPV的關(guān)系，文獻(xiàn)報(bào)告高危HPV的基因可整合入宿主基因組，干擾控制增生的癌基因和抑癌基因的表達(dá)［8］。高危HPV誘導(dǎo)P16蛋白過表達(dá)的機(jī)制主要是HPV的E7基因編碼蛋白可與P16蛋白結(jié)合，阻斷了P16蛋白抑制細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)級聯(lián)，致P16蛋白功能失活［9］。提示高危型HPV感染可能同通過抑癌基因P16蛋白突變導(dǎo)致宮頸CIN病變。因此聯(lián)合檢測HPV和P16蛋白可作為篩選子宮頸癌及癌前高危個(gè)體的生物學(xué)指標(biāo)，對子宮頸癌的篩查和預(yù)防具有重要意義［10］。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持上述觀點(diǎn)。

Ki-67蛋白為細(xì)胞核內(nèi)與細(xì)胞分裂增殖相關(guān)的核抗原，是目前應(yīng)用最廣泛的多種腫瘤的增殖活性細(xì)胞標(biāo)記物。本組結(jié)果顯示隨著CIN級別增高，其陽性表達(dá)以及強(qiáng)度也明顯上升，支持細(xì)胞增殖活性改變可作為癌前病變至癌變過程一個(gè)有用的生物學(xué)指標(biāo)的觀點(diǎn)［3］。關(guān)于Ki-67蛋白免疫定量判定CIN的級別，余俐等［6］認(rèn)為Ki-67蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞多少與CIN級別無關(guān)，而其在宮頸鱗狀上皮中的位置分布(即宮頸鱗狀上皮下1/3，下1/3～2/3，下2/3以上或全層)與CIN級別相關(guān)。因此，判定Ki-67蛋白是否陽性需要定位準(zhǔn)確。另外，在本組HPV感染的病例中Ki-67蛋白顯示高表達(dá)，并且實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)宮頸尖銳濕疣病變中挖空細(xì)胞的核也有陽性表達(dá)，因此我們認(rèn)為檢測Ki-67蛋白可作為診斷HPV感染的一個(gè)輔助性標(biāo)記物，對宮頸癌的診斷和CIN的分級有輔助診斷價(jià)值。

宮頸CIN是與宮頸癌密切相關(guān)的一組癌前病變，這個(gè)病變過程有很多因子參與，HPV感染是宮頸癌的重要致病因素。本組實(shí)驗(yàn)顯示高危型HPV16/18感染和P16、Ki-67蛋白在宮頸CIN病變中表達(dá)隨CIN級別增加而不斷加重，因此認(rèn)為抑癌基因P16蛋白的表達(dá)上調(diào)參與了宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程。相關(guān)分析也證實(shí)宮頸鱗癌中高危型HPV16/18與P16和Ki-67蛋白表達(dá)間呈正相關(guān)(P＜0.05)。P16、Ki-67蛋白幾乎在宮頸CIN和宮頸鱗癌組中均呈過表達(dá)，在HPV檢測陰性組中P16和Ki-67蛋白也有不同程度的檢出率，因此認(rèn)為HPV與P16、Ki-67蛋白聯(lián)合應(yīng)用可起到互補(bǔ)作用，能共同監(jiān)測宮頸鱗狀上皮病變的進(jìn)展，提高宮頸癌及癌前病變的病理診斷。

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