94份水稻骨干材料抗稻瘟病基因和恢復(fù)基因的分子檢測(cè)與分析

張金霞 張倩倩 王書玉 劉賀梅 孫建權(quán) 胡秀明 殷春淵 王和樂 張玉紅

摘要：為明確6個(gè)抗稻瘟病基因（Pita、Pi54、Pia、Pib、Pikm、Pikh）和1個(gè)恢復(fù)基因（Rf1a）在水稻骨干材料及新品系中的基因型和分布情況，從而為今后抗稻瘟病基因和恢復(fù)基因的合理利用及分子標(biāo)記輔助育種提供依據(jù)，利用6對(duì)擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定的抗稻瘟病基因特異性分子標(biāo)記對(duì)48份水稻品系的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用恢復(fù)基因分子標(biāo)記Rf1a對(duì)46份外引及自育恢復(fù)系材料進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，在48份水稻骨干材料及品系中，單個(gè)種質(zhì)攜帶的抗稻瘟病基因?yàn)?～6個(gè)，攜帶4個(gè)抗稻瘟病基因的品系最多，占總數(shù)的33.33%，其次為攜帶3個(gè)（22.92%）、2個(gè)（18.75%）抗稻瘟病基因的品系，攜帶6個(gè)抗稻瘟病基因的種質(zhì)資源最少（4.17%）；6個(gè)抗稻瘟病基因在48份水稻種質(zhì)中的分布差異較大，Pib、Pikh、Pi54在供試粳稻中的分布最廣泛，分布頻率分別達(dá)到77.08%、64.58%、62.50%，其次為Pita、Pikm、Pia，分布頻率分別為47.92%、41.67%、33.33%；48份水稻種質(zhì)共有抗稻瘟病基因組合22個(gè)，其中組合Pia+Pi54+Pikh+Pib和組合Pi54+Pikh+Pib的水稻材料數(shù)量最多（各6份）。在46份外引及自育恢復(fù)系材料中，攜帶恢復(fù)基因Rf1a的占93.48%。通過分子標(biāo)記手段明確了相關(guān)種質(zhì)的抗稻瘟病基因類型，為抗稻瘟病和恢復(fù)系新品系的選育及親本組配提供了較好的遺傳信息。

關(guān)鍵詞：水稻；骨干材料；抗稻瘟病基因；恢復(fù)基因

中圖分類號(hào)：S435.111.4+1? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）05-0058-06

水稻（Oryza sativa L.）是重要的糧食作物之一，水稻的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)對(duì)于維護(hù)我國(guó)糧食安全具有重要意義［1］。隨著農(nóng)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革的深入推進(jìn)和鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略的全面實(shí)施，我國(guó)優(yōu)質(zhì)稻生產(chǎn)迎來新的變革，水稻生產(chǎn)由高產(chǎn)逐漸向穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、增效方向轉(zhuǎn)變。

稻瘟病是水稻三大病害之一［2］，稻瘟病的發(fā)生會(huì)嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量［3］，輕發(fā)區(qū)域減產(chǎn)達(dá)10%～20%，嚴(yán)重區(qū)域減產(chǎn)達(dá)到40%～50%，甚至導(dǎo)致顆粒無收［4］，極大地阻礙了水稻產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。目前，對(duì)稻瘟病的防治主要采取培育抗病新品種、生物防治、化學(xué)防治和栽培管理等策略［5］。研究發(fā)現(xiàn)，培育和合理利用抗稻瘟病品種是防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效的方法，但是由于稻瘟病生理小種的多樣性且復(fù)雜多變，使得抗稻瘟病品種的抗性可能會(huì)發(fā)生變化［6］。因此，只有加強(qiáng)對(duì)水稻種質(zhì)資源抗稻瘟病的鑒定與評(píng)價(jià)，才能挖掘更多的抗稻瘟病基因，從而培育持久廣譜的抗稻瘟病品種［7］。相關(guān)研究表明，稻瘟病生理小種在不同地區(qū)、年份、種植條件下明顯不同［8-10］，因此，同一品種在不同地區(qū)種植，其抗性表現(xiàn)不一定相同，隨著連續(xù)大規(guī)模種植的推廣，一個(gè)抗病品種的抗性也會(huì)降低或喪失［11］。在傳統(tǒng)水稻育種工作中，稻瘟病抗性育種主要依靠接種鑒定和表型選擇［10］，導(dǎo)致選育周期長(zhǎng)且容易產(chǎn)生誤差。

雜交水稻以其高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、植株健壯、根系發(fā)達(dá)、分蘗力強(qiáng)、穗大粒多、米質(zhì)優(yōu)良等特性，在豐產(chǎn)和抗病等方面比常規(guī)種更具優(yōu)勢(shì)［12］。隨著超級(jí)稻“四期”育種目標(biāo)的成功實(shí)現(xiàn)，我國(guó)雜交水稻育種已步入新的發(fā)展階段，雜交稻的推廣應(yīng)用對(duì)國(guó)內(nèi)的水稻生產(chǎn)起到了重要作用［13］。雜交稻分為“三系”和“兩系”，其共同的親本都含有恢復(fù)系，恢復(fù)系的好壞直接決定雜交稻的產(chǎn)量。恢復(fù)系對(duì)育性的恢復(fù)能力與恢復(fù)基因（fertility restorer gene，Rf）密切相關(guān)，但強(qiáng)效恢復(fù)基因在粳稻中所占比例較低［14］，許多恢復(fù)基因是從秈稻中引入的，而秈粳雜交的后代群體存在層次不齊、性狀穩(wěn)定困難、恢復(fù)基因?qū)敫怕实偷葐栴}。

隨著功能基因組及分子育種技術(shù)的快速發(fā)展，大量可用于水稻遺傳育種的功能基因被挖掘，使稻米產(chǎn)量、品質(zhì)得到較大提高，育種已進(jìn)入以基因組為支撐、以生物信息大數(shù)據(jù)分析為輔助、以產(chǎn)業(yè)重大需求和科技引領(lǐng)相結(jié)合為導(dǎo)向、以現(xiàn)代分子遺傳技術(shù)為手段的分子設(shè)計(jì)育種時(shí)代。隨著越來越多高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病蟲、抗逆基因被克隆，分子標(biāo)記輔助選擇（marker assisted selection，MAS）已在遺傳改良方面發(fā)揮重要作用，通過與目標(biāo)性狀基因型緊密連鎖的功能標(biāo)記，在DNA水平上直接確定基因型并對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行改良，已經(jīng)成為新品種（品系）選育的常用方法［15］。目前，已有110多個(gè)稻瘟病抗性基因和500多個(gè)數(shù)量性狀基因座（QTLs）被鑒定［16］，它們分布于水稻12條染色體上的不同位點(diǎn)，其中至少有26個(gè)已被克隆，包括Pi9、Pigm、Pi7、pi21、Pi50、Pi57和Ptr等為廣譜抗性基因［17］。在當(dāng)前生產(chǎn)上應(yīng)用面積最大的粳稻不育系為包臺(tái)型（CMS-BT），其育性恢復(fù)性受1對(duì)顯性基因控制。截至目前，已有4個(gè)育性恢復(fù)QTL被定位到水稻10號(hào)染色體上［18］。王東元等利用特異性分子標(biāo)記對(duì)107份粳稻材料的恢復(fù)基因及10個(gè)抗稻瘟病基因進(jìn)行檢測(cè)和分析，明確了不同材料攜帶的基因類型，為稻瘟病、恢復(fù)基因的利用提供了借鑒［19］。陳志偉等通過回交育種結(jié)合MAS（分子標(biāo)記輔助選擇），選育出10個(gè)導(dǎo)入Pi1、Pi9和Pikh等抗稻瘟病基因的福恢673近等基因系，這些近等基因系及其與不育系宜香A配制的雜種一代均表現(xiàn)出對(duì)稻瘟病的抗性，且抗性明顯強(qiáng)于對(duì)照?；?73，半數(shù)以上雜種一代基本保留了原組合的主要優(yōu)點(diǎn)［20］。呂軍等利用自主開發(fā)的香味基因fgr的功能標(biāo)記與抗稻瘟病基因Pita的分子標(biāo)記將這2個(gè)基因聚合到一起，篩選到4個(gè)綜合性狀優(yōu)良的抗稻瘟病香稻新品系遼粳香 1～4號(hào)［21］。

為進(jìn)一步深入研究當(dāng)前水稻品種（品系）中稻瘟病抗性基因的組合特征，明析水稻種質(zhì)資源的基因型，本研究利用Pita、Pi54、Pia、Pib、Pikm和Pikh共6個(gè)抗稻瘟病基因和1個(gè)恢復(fù)基因Rf1a的功能性分子標(biāo)記，對(duì)94份水稻骨干種質(zhì)和品系抗稻瘟病基因和恢復(fù)基因進(jìn)行檢測(cè)與分析，旨在明確骨干材料的抗病基因型，為今后選育持久廣譜的抗稻瘟病品種及合理利用抗稻瘟病種質(zhì)資源提供依據(jù)，為水稻恢復(fù)系MAS和定向創(chuàng)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

抗稻瘟病基因檢測(cè)供試材料為48份水稻骨干材料，編號(hào)為J1～J48，其中J1～J19為已審定的品種，J20～J48為新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育出的穩(wěn)定品系（表1）；恢復(fù)基因檢測(cè)材料的編號(hào)為R1～R46，R1～R23為外引材料，R24～R46為新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育出的恢復(fù)系品系（表2）。

1.2 水稻葉片DNA的提取

在水稻的分蘗期或拔節(jié)期，取新鮮劍葉作為試驗(yàn)材料，分別裝在2 mL離心管中，放入加有冰袋的泡沫箱中密封，后存放在-80 ℃超低溫冰箱中。保存的鮮葉片現(xiàn)用現(xiàn)取，在液氮中充分研磨，隨后用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取DNA。

1.3 SSR引物

本研究中的7對(duì)簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）引物標(biāo)記（表3）用于對(duì)48份粳稻材料的抗稻瘟病基因和46份材料恢復(fù)基因進(jìn)行檢測(cè)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系為10 μL，其中Mix 5 μL、F/R引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，加3 μL水補(bǔ)齊。PCR擴(kuò)增程序如下：95 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，53 ℃或55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，12 ℃保溫。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%～2%瓊脂糖凝膠電泳，于180 V電泳30 min后用凝膠成像儀拍照記錄，將基因型條帶信息記錄在Excel中。

1.5 數(shù)據(jù)處理

基因型條帶信息用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗稻瘟病基因和恢復(fù)基因檢測(cè)

本研究用6個(gè)抗稻瘟病基因（Pita、Pi54、Pia、Pib、Pikm、Pikh）對(duì)48份水稻骨干材料進(jìn)行檢測(cè)，用1個(gè)恢復(fù)基因Rf1a對(duì)46份材料進(jìn)行檢測(cè)（圖1）。通過分析48份水稻材料攜帶的抗稻瘟病基因數(shù)目，發(fā)現(xiàn)單份水稻材料攜帶4個(gè)抗稻瘟病基因的材料最多，有16份，占比為33.33%；其次為攜帶3、2個(gè)抗稻瘟病基因的材料，分別有11、9份，占比分別為22.92%、18.75%；攜帶6個(gè)抗稻瘟病基因的材料最少，有2份，占比為4.17%。從以上結(jié)果可知，同時(shí)攜帶3個(gè)以上抗稻瘟病基因的粳稻占70.84%（表4）。在引進(jìn)和自育恢復(fù)系材料中，有4份材料不含Rf1a基因。

2.2 不同抗稻瘟病基因和恢復(fù)基因水稻骨干材料中的分布

通過對(duì)48份骨干材料中各個(gè)抗稻瘟病基因的檢出率進(jìn)行分析， 發(fā)現(xiàn)這6個(gè)抗稻瘟病基因的檢出率為33.33%～77.08%，存在較大差異。其中，Pib的檢出率最高，攜帶該基因的材料有37份，檢出率為77.08%；其次是Pi54、Pikh，攜帶這2個(gè)基因的材料分別有30、31份，檢出率分別為62.50%、64.58%；攜帶Pita的材料有23份，檢出率為47.92%；攜帶Pikm的材料有20份，檢出率為41.67%；攜帶Pia的材料最少，有16份，檢出率為33.33%。通過對(duì)46份恢復(fù)系材料恢復(fù)基因Rf1a檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)攜帶恢復(fù)基因Rf1a的材料有42份，恢復(fù)基因檢出率為93.48%（表5）。

2.3 48份水稻骨干親本抗稻瘟病基因的組合類型

通過對(duì)48份骨干材料的抗稻瘟病基因組合進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)48份材料中共有抗稻瘟病基因組合22個(gè)。其中，組合為Pia+Pi54+Pikh+Pib，Pi54+Pikh+Pib的材料最多，各有6份；其次組合為Pi54+Pikh+Pib+Pita、Pib+Pikm的材料，各有4份；組合為Pia+Pi54+Pikh+Pib+Pikm+Pita、Pi54+Pikh+Pib+Pikm+Pita、Pia+Pi54+Pikh+Pib+Pita、Pi54+Pikh+Pib+Pikm、Pia+Pi54+Pikh+Pikm、Pi54+Pikh+Pita、Pib+Pikm+Pita、Pib+Pita、Pib 、Pikm的材料各有2份；組合為Pia+Pikm+Pita+Pi54+Pikh、Pi54+Pikh+Pikm+Pita、Pia+Pib+Pikm+Pita、Pia+Pib+Pita、Pia+Pita、Pikm+Pita、Pikh+Pib、Pita的材料各有1份（表6）。

3 討論

稻瘟病是影響水稻生長(zhǎng)最主要的真菌性疾病之一。稻瘟病菌具有快速變異的特點(diǎn)，育成品種的稻瘟病抗性很容易喪失［17］。黃淮稻麥兩熟區(qū)是我國(guó)糧食生產(chǎn)核心區(qū)，對(duì)于保障國(guó)家口糧安全有著至關(guān)重要的戰(zhàn)略地位。該區(qū)粳稻常年種植面積約為183.33萬hm2，是我國(guó)優(yōu)質(zhì)稻米主產(chǎn)區(qū)之一。然而，由于年際氣候不穩(wěn)定，尤其是在粳稻抽穗灌漿期間經(jīng)常遭遇高溫、低溫、陰雨寡照等多種災(zāi)害性天氣，導(dǎo)致稻瘟病頻繁發(fā)生，稻米產(chǎn)量和品質(zhì)下降。因此，利用抗稻瘟病分子標(biāo)記檢測(cè)水稻材料中含有的抗稻瘟病基因類型和組合，對(duì)選育抗稻瘟病新品種具有重要參考價(jià)值。

本研究采用6個(gè)具有廣譜抗性的稻瘟病分子標(biāo)記（Pia、Pi54、Pikh、Pib、Pita和Pikm）對(duì)水稻骨干材料進(jìn)行分析。通過分子標(biāo)記輔助育種手段，將不同類型廣譜抗稻瘟病基因聚合起來以增強(qiáng)抗病性，為水稻的抗病分子育種奠定基礎(chǔ)。在48份水稻材料中，Pi54、Pikh和Pib這3個(gè)基因的分布頻率達(dá)到50%以上，說明它們?cè)诠歉刹牧现械姆植驾^為廣泛，可作為后續(xù)育種的抗病親本。而Pia、Pikm的分布頻率相對(duì)較低，需要在選育過程中加強(qiáng)對(duì)其利用以提高稻瘟病的廣譜抗性。在檢測(cè)的6個(gè)基因中，Pib基因所占比例最高，達(dá)到77.08%。Pib基因是首個(gè)被克隆的抗稻瘟病基因［23］，位于水稻第2染色體長(zhǎng)臂近末端區(qū)域，與Pita基因有43.2%的相似性［24］。之前的研究也表明，Pib基因在不同的水稻品種中分布廣泛，如上海的22種常規(guī)粳稻和浙江的12個(gè)晚粳品種中均檢測(cè)到Pib基因［25-26］。Pi54、Pikh基因的分布比例也較高，達(dá)到65%左右，有研究表明，這2個(gè)基因是由同一個(gè)稻瘟病的病原菌開發(fā)的2個(gè)標(biāo)記。有研究發(fā)現(xiàn)，含有Pikh基因的單基因系表現(xiàn)出了廣譜抗性，抗譜達(dá)到了89.6%［27］。因此可見，Pi54、Pikh基因的利用也應(yīng)受到重視，以提高水稻的抗病性。

在48份水稻材料中，有2份材料攜帶6個(gè)抗稻瘟病基因，有5份材料攜帶5個(gè)抗稻瘟病基因，16份材料攜帶4個(gè)基因，11份材料攜帶3個(gè)基因，9份材料攜帶2個(gè)基因，5份材料攜帶1個(gè)基因。通過篩選，共得到42份攜帶Rf1a恢復(fù)基因的材料，將這些攜帶多個(gè)抗病基因和恢復(fù)基因的材料結(jié)合，可以提高抗性并增強(qiáng)花粉育性，達(dá)到基因聚合的效果。Jiang等利用9個(gè)稻瘟病抗性基因（Pi37/Pit/Pid3/Pigm/Pi36/Pi5/Pi54/Pikm/Pib）對(duì)不育系Y58S、廣占63S、C815S和HD9802S進(jìn)行改良，得到31個(gè)單基因衍生系和20個(gè)雙基因組合系［28］。Xiao等通過MAS，將2個(gè)抗性基因Pi46、Pita以及影響水稻胚芽直鏈淀粉含量（AC）的基因Wxb導(dǎo)入稻瘟病抗性弱、籽粒品質(zhì)差的秈稻恢復(fù)系R8166中，得到了R163、R167這2個(gè)改良品系及其衍生雜交種，籽粒直鏈淀粉含量、膠稠度、堊白粒率和堊白度等品質(zhì)性狀都得到改善［29］。黃乾龍等分析了重慶地區(qū)73個(gè)水稻骨干種質(zhì)的稻瘟病抗性，結(jié)果顯示，攜帶3～4個(gè)抗稻瘟病基因的水稻材料的抗病率都能達(dá)到100%，表明聚合抗稻瘟病基因能夠顯著提高水稻的抗病性［30］。在本研究中，70%以上的材料攜帶3個(gè)及以上抗病基因，這類材料可以作為育種工作中的骨干親本，同時(shí)根據(jù)不同基因之間的組合，可以有目的地將這類粳稻材料作為育種材料進(jìn)行改良，并建立資源庫(kù)。

本試驗(yàn)只針對(duì)6個(gè)稻瘟病抗性基因的分布情況進(jìn)行了檢測(cè)和分析，但是在田間，水稻品種的具體抗病表現(xiàn)是由多種因素共同作用的結(jié)果，這些因素包括水稻品種特性、種植環(huán)境、致病菌株的多樣性、聚合基因的表達(dá)、抗稻瘟病基因的防治等級(jí)及其他未知因素。

4 結(jié)論

本研究利用6個(gè)抗稻瘟病分子標(biāo)記（Pia、Pi54、Pikh、Pib、Pita和Pikm）和1個(gè)恢復(fù)基因（Rf1a），明確了48個(gè)水稻新品系攜帶的抗稻瘟病基因類型和46份恢復(fù)系材料的恢復(fù)基因。但是，這些品系的實(shí)際稻瘟病抗性需要進(jìn)一步結(jié)合田間試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

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