β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的穩(wěn)定性與降解反應(yīng)特性

摘要：β-內(nèi)酰胺酶抑制劑與廣譜β-內(nèi)酰胺抗生素的聯(lián)合使用是一種有效解決細(xì)菌耐藥的策略之一。目前上市的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑按其化學(xué)結(jié)構(gòu)主要包括氧青霉烯類（克拉維酸）、青霉烷砜類（舒巴坦和他唑巴坦）和二氮雜二環(huán)辛烷類化合物（阿維巴坦），本文對臨床常見的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的穩(wěn)定性與降解反應(yīng)特性進(jìn)行綜述，并結(jié)合當(dāng)前藥典標(biāo)準(zhǔn)中的有關(guān)物質(zhì)檢查項，探討上述β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的雜質(zhì)譜控制策略。

關(guān)鍵詞：β-內(nèi)酰胺酶抑制劑；穩(wěn)定性；降解反應(yīng)；雜質(zhì)譜控制

中圖分類號：R978.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Stability and degradation characteristics of β-lactamase inhibitors

AbstractThe combination of β-lactamase inhibitors with broad-spectrum β-lactam antibiotics is one of the effective strategies to meet the challenge of bacterial resistance. Currently， β-lactamase inhibitors mainly used on the market include oxapenems （clavulanic acid）， penicillane sulfones （sulbactam and tazobactam） and diazabicyclooctanes （avibactam）， according to their chemical structure. In this paper， the stability and degradation mechanisms/characteristics of the β-lactamase inhibitors were reviewed. Combined with the methods of related substance determination in the specifications of pharmacopeia， the strategy for the impurity profiling control of the β-lactamase inhibitors was discussed.

Key words β-lactamase inhibitor; Stability; Degradation mechanism; Impurity profiling

β-內(nèi)酰胺類抗生素是臨床中最重要的一類抗感染藥物。β-內(nèi)酰胺類抗生素的研發(fā)歷程貫穿于人類與微生物博弈的全過程（圖1）。第一個β-內(nèi)酰胺抗生素（青霉素G）的上市被認(rèn)為是現(xiàn)代化療的標(biāo)志性里程碑。從那時起，青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類、青霉烯類和單環(huán)類β-內(nèi)酰胺抗生素被逐漸引入臨床，徹底改變了人類對抗細(xì)菌感染治療的認(rèn)知。然而，伴隨著β-內(nèi)酰胺抗生素的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌逐漸產(chǎn)生耐藥性，又使得β-內(nèi)酰胺抗生素的抗菌功效受到抑制。在諸多的細(xì)菌耐藥機(jī)制中，最普遍且最重要的耐藥機(jī)制是細(xì)菌通過產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶滅活β-內(nèi)酰胺抗生素。β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的發(fā)現(xiàn)，酶抑制劑與廣譜β-內(nèi)酰胺抗生素的聯(lián)合使用是一種有效解決細(xì)菌耐藥的策略之一。

目前已上市的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑均為絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶（SBLs）抑制劑（圖2），按其化學(xué)結(jié)構(gòu)包括氧青霉烯類（克拉維酸）、青霉烷砜類（舒巴坦和他唑巴坦）、二氮雜二環(huán)辛烷類化合物（DBO）（阿維巴坦）和有機(jī)硼酸類化合物（法硼巴坦）。對β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的作用機(jī)理、抑酶特性和臨床應(yīng)用等國內(nèi)外均已經(jīng)有較全面的綜述[2-8]，β-內(nèi)酰胺酶抑制劑通常與β-內(nèi)酰胺抗生素組成復(fù)方制劑。按現(xiàn)代藥物雜質(zhì)譜控制的理念，需對復(fù)方制劑中β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的雜質(zhì)譜進(jìn)行控制。然而，對β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的穩(wěn)定性與降解反應(yīng)特性的綜述尚較少見。本文對目前臨床常見的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的穩(wěn)定性與降解反應(yīng)特性進(jìn)行綜述，并結(jié)合當(dāng)前藥典標(biāo)準(zhǔn)中的有關(guān)物質(zhì)檢查項，探討上述β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的雜質(zhì)譜控制策略。

1 克拉維酸

克拉維酸（clavulanic acid）是首個由棒狀鏈霉菌 （Streptomyces clavuligerus）產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，是氧青霉烷類β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的典型代表。上市的克拉維酸產(chǎn)品為克拉維酸鉀，其標(biāo)準(zhǔn)品為克拉維酸鋰；臨床中最常見的復(fù)方制劑是各種規(guī)格的阿莫西林（鈉）-克拉維酸鉀注射劑和口服制劑。

1.1 固體穩(wěn)定性

克拉維酸鉀對水分十分敏感，克拉維酸鉀與二氧化硅、微晶纖維素或與阿莫西林三水合物混合后，均可以降低其中能自由逸出可以與克拉維酸發(fā)生反應(yīng)的水分子的量，因而可以使其穩(wěn)定性顯著提高。通常用水分活度表征樣品中水的逸出能力（數(shù)值介于0～1），水分活度是影響克拉維酸鉀固體穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。藥物水分活度與水分含量的關(guān)系可用吸附-解吸附等溫線（moisture sorption-desorption isotherms）表示。對3種含克拉維酸鉀藥物25 ℃時的水分等溫吸附曲線進(jìn)行分析（圖3a），樣品中水分含量的變化呈階梯狀： O→A段，水分活度與水分含量均緩慢增加； A→B段，水分含量基本不變，但水分活度快速增加；B→C段，水分含量快速增加，水分活度基本不變；C→D段，水分含量與水分活度均快速增加。進(jìn)一步比較30 ℃時不同水分活度（aw）的克拉維酸鉀-二氧化硅（1：1）樣品的穩(wěn)定性（圖3b）：當(dāng)樣品中的水分活度大于0.15 aw（水分含量約大于5%）時，克拉維酸鉀迅速降解；樣品3與樣品4中的水分含量僅差0.3%，前者的水分活度值為0.335 aw，后者為0.598 aw，樣品4在0.5 d就降解了約50%，降解反應(yīng)速率明顯快于樣品3。進(jìn)一步分析水分活度-降解反應(yīng)的關(guān)系：某樣品在加速實驗（30 ℃）中水分活度逐漸增大，在第5天時大于0.15 aw（約為0.2 aw）；在前5天的加速實驗中，基本觀測不到該樣品的降解，但第5天后，樣品發(fā)生明顯的降解反應(yīng)（圖3c）；提示30 ℃時引起克拉維酸鉀發(fā)生降解反應(yīng)的水分活度閾值約為0.15 aw。上述結(jié)果提示，根據(jù)貯存溫度引起藥物降解反應(yīng)的水活度閾值，控制藥物中水分的含量，可以保證樣品貯存期的穩(wěn)定性。

樣品中的水分活度與其基質(zhì)的特性有關(guān)，相同水分條件下，基質(zhì)對水分的吸附作用越強(qiáng)，樣品的水活度越低；25 ℃時，克拉維酸鉀-微晶纖維素（1：1）樣品的水分活度為0.430，克拉維酸鉀-二氧化硅（1：1）樣品的水分活度為0.327，阿莫西林-克拉維酸鉀（5：1）樣品的水分活度為0.223；室溫貯存時，阿莫西林-克拉維酸鉀樣品相對最穩(wěn)定。由于水分活度隨溫度的增加而增大，貯存溫度越高，樣品中的水分含量應(yīng)控制得更低，才能保證其穩(wěn)定性。

1.2 溶液穩(wěn)定性

克拉維酸鉀在溶液中對溫度和pH均非常敏感，利用一級動力學(xué)方程可以較好地解釋其在溶液中的水解動力學(xué)特性，Arrhenius方程可以較好地表征不同pH條件下降解速率常數(shù)與溫度的關(guān)系；克拉維酸在發(fā)酵培養(yǎng)基中較其在標(biāo)準(zhǔn)品溶液和制劑溶液中更不穩(wěn)定[9]。對克拉維酸鉀在不同pH、溫度和不同鹽溶液中的穩(wěn)定性研究表明， 20 ℃、pH 6.0～7.2時克拉維酸的穩(wěn)定性較好；溶液中鹽對其穩(wěn)定性的影響依次為Na2SO4>MgSO4>氯化鈣>氯化鈉[10]。在水溶液（35 ℃、?=0.5、pH 3～10）中，pH為6.39時克拉維酸最穩(wěn)定；在堿性介質(zhì)中克拉維酸的降解速度較酸性介質(zhì)中快10倍；且緩沖鹽的催化作用對降解反應(yīng)的影響顯著（緩沖液濃度越大，降解反應(yīng)越快）[11]。

1.3 降解反應(yīng)途徑

對克拉維酸在水溶液中的降解反應(yīng)途徑研究表明，其首先水解形成開環(huán)物；由于開環(huán)物非常不穩(wěn)定，在開環(huán)的同時氧青霉烯母核中的C-O鍵斷裂，形成降解物VI，經(jīng)脫乙酸甲醛和二氧化碳后，形成主要水解產(chǎn)物1 -氨基-4-羥基丁烷-2-酮（IX）；降解物IX是后續(xù)形成吡嗪衍生物的重要中間體（圖4）。在酸性條件下降解物IX比較穩(wěn)定；在中性和堿性溶液中，降解物IX會發(fā)生自縮合反應(yīng)，首先形成二氫吡嗪衍生物（降解物X，EP中的雜質(zhì)A），再進(jìn)一步形成降解物I（2，5-雙（2-羥乙基）吡嗪）和降解物IV（3-乙基-2，5-雙（2-羥乙基）吡嗪，EP中的雜質(zhì)C）等吡嗪衍生物 [12]。在弱堿性溶液中已鑒定出4個吡嗪衍生物，包括降解物I、降解物II（3-甲基-2，5-雙（2-羥乙基）吡嗪）、降解物III（3-（2-羧乙基）-2，5-雙-（2-羥乙基）吡嗪，EP中的雜質(zhì)B）和降解物IV[13]。降解物X在空氣中氧化即可形成降解物I，與克拉維酸降解過程中產(chǎn)生的甲醛、乙酸甲醛、乙醛反應(yīng)，則分別形成降解物II、降解物III和降解物IV。克拉維酸在60 ℃條件下水解，可降解形成4種吡嗪衍生物； 但35 ℃條件下不能形成降解物II， 100 ℃下不能形成降解物III[13]。

在堿性水溶液中，克拉維酸鉀降解物VII（8-羥基-6-氧-4-氮雜-2-辛酸）的λmax為260 nm[14]。在甲醇和飽和NaOH甲醇溶液中，則形成8-羥基-6-氧-4-氮雜-2-辛酸甲酯（降解物VII甲酯），其λmax為268nm（甲醇）；降解物VII甲酯經(jīng)堿催化的重排反應(yīng)，分子內(nèi)縮合可形成4-（2-羥乙基）吡咯-3-甲酸甲酯（3，4-二取代吡咯衍生物）[15]；克拉維酸與咪唑反應(yīng)可形成1-（8-羥基-6-氧-4-氮雜-2-辛酸）咪唑（咪唑衍生物），經(jīng)酸水解后形成降解物VII[16]；降解物VII和其甲酯酸化后，紫外吸收幾乎消失，但堿化后可再次出現(xiàn)（圖5）[14]。

1.4 對降解雜質(zhì)的控制

歐洲藥典（EP11.0）在克拉維酸鉀各論中，列出了部分特定雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)，其中雜質(zhì)A、B、C分別為克拉維酸降解形成的吡嗪衍生物（雜質(zhì)X、雜質(zhì)III和雜質(zhì)IV）；雜質(zhì)D為降解物VII經(jīng)堿催化分子內(nèi)縮合形成的重排產(chǎn)物?！吨袊幍洹?020年版采用HPLC主成分自身對照法對克拉維酸鉀中的雜質(zhì)進(jìn)行控制，但沒有對特定降解雜質(zhì)進(jìn)行針對性的控制。從雜質(zhì)譜控制角度，EP對克拉維酸鉀降解雜質(zhì)的控制較《中國藥典》更為完善。但EP未對克拉維酸鉀降解形成的雜質(zhì)I和雜質(zhì)II這兩個重要的吡嗪衍生物進(jìn)行控制，使其略顯不足。此外，目前藥品質(zhì)控方法均采用HPLC-UV色譜系統(tǒng)進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查，而克拉維酸鉀的直接降解產(chǎn)物如降解物IX等，由于沒有明顯的紫外吸收不適宜采用UV檢測器直接檢測，因而采取測定他們的縮合產(chǎn)物控制其降解反應(yīng)的策略。如采用電化學(xué)檢測，則可能促使其雜質(zhì)譜控制方法更為完善。

已發(fā)表的對阿莫西林-克拉維酸鉀制劑雜質(zhì)譜的分析方法，通常均僅對阿莫西林產(chǎn)生的特定雜質(zhì)進(jìn)行了歸屬[17-18]，雖然克拉維酸鉀在復(fù)方制劑中較阿莫西林更不穩(wěn)定[18]，但由于在HPLC-UV色譜系統(tǒng)中，克拉維酸鉀降解產(chǎn)物與阿莫西林雜質(zhì)相比響應(yīng)值較低不宜被檢測，因而在分析時通常均被忽略。開發(fā)適宜的色譜系統(tǒng)分析阿莫西林-克拉維酸鉀復(fù)方制劑中克拉維酸鉀的降解雜質(zhì)，對評價復(fù)方制劑的質(zhì)量具有重要的意義。

2 青霉烷砜類酶抑制劑

青霉烷砜類化合物是由6-氨基青霉烷酸（6-APA）為起始物合成得到的一類衍生物，其中舒巴坦和他唑巴坦對β-內(nèi)酰胺酶具有很強(qiáng)的抑制作用，分別于1978年和1984年上市。舒巴坦、他唑巴坦均為競爭性不可逆的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，臨床中常見的制劑有注射用氨芐西林鈉/舒巴坦鈉、注射用頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉、注射用哌拉西林鈉/他唑巴坦鈉等。青霉烷砜類β-內(nèi)酰胺酶抑制劑較克拉維酸鉀的穩(wěn)定性要好，但在溶液中特別是在堿性溶液中仍易降解。

2.1 舒巴坦

2.1.1 固體穩(wěn)定性

舒巴坦的常見藥用形式是舒巴坦鈉，通常由結(jié)晶工藝生產(chǎn)，其在固態(tài)狀態(tài)下較為穩(wěn)定。在藥物制劑中舒巴坦鈉的穩(wěn)定性與生產(chǎn)工藝有關(guān)。如注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉，可以由冷凍干燥工藝生產(chǎn)，產(chǎn)品為無定型粉末；也可以由無菌分裝工藝生產(chǎn)，產(chǎn)品為無定型頭孢哌酮鈉/結(jié)晶型舒巴坦鈉和結(jié)晶型頭孢哌酮鈉/結(jié)晶型舒巴坦鈉。對頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉的產(chǎn)品穩(wěn)定性考察發(fā)現(xiàn)，固體狀態(tài)下頭孢哌酮鈉較舒巴坦鈉更不穩(wěn)定，影響復(fù)方注射劑質(zhì)量的關(guān)鍵因素是頭孢哌酮鈉的質(zhì)量。選擇理想的頭孢哌酮晶體，同時根據(jù)產(chǎn)品的水活度特性控制產(chǎn)品中的水分含量是提高產(chǎn)品穩(wěn)定性的關(guān)鍵。

2.1.2 降解反應(yīng)

舒巴坦鈉的主要降解反應(yīng)為水解反應(yīng)。舒巴坦鈉在水溶液（35 ℃，離子強(qiáng)度=0.5）中，最穩(wěn)定的pH范圍為3.0～7.0；在不同pH條件（pH 1～10）下的降解反應(yīng)均遵循一級動力學(xué)反應(yīng)特性[19]。舒巴坦鈉水解時首先β-內(nèi)酰胺環(huán)開環(huán)，并快速形成降解物IV（5-羧基-6-甲基-6-亞磺酸基-4-氮雜-2-庚烯酸，EP中的雜質(zhì)G），其紫外光譜的λmax為267 nm；再分解成2-氨基-3-甲基-3-亞磺酸基丁酸（VIII，EP中的雜質(zhì)A）和乙酸甲醛（VI）。在堿性甲醇溶液中，則先形成2-氨基-3-甲基-3-亞磺酸基丁酸甲酯（II），其紫外光譜λmax為279 nm；再進(jìn)一步分解（圖6）[20]。降解物II和降解物IV在酸性水溶液中進(jìn)一步水解后，紫外吸收幾乎消失，但堿化后乙酸甲醛烯醇化后再次顯現(xiàn)紫外吸收。

2.2 他唑巴坦

2.2.1 固體穩(wěn)定性

影響他唑巴坦固體穩(wěn)定性的主要因素與其物理狀態(tài)（結(jié)晶型或無定型）及樣品中水分的存在形式有關(guān)。他唑巴坦為多晶型藥物，可以形成無水物和二種具有不同晶格結(jié)構(gòu)的半水合物晶體。他唑巴坦無水無物晶體為正交晶系（在乙醇-水=70：30的溶液中結(jié)晶），空間群為P212121；晶胞參數(shù)：a=10.230（2）， b=14.396（2）， c=17.291（2） ?；Z=8；化學(xué)計量式： C10H12N4O5S。晶胞中C（2）羧酸中的質(zhì)子和三唑基的N（4）氮原子存在分子間氫鍵[21]。半水合物晶體I為單斜晶系（在2～8 ℃，pH 1.7的水溶液中結(jié)晶），空間群為P21；晶胞參數(shù)：a=9.9008（5）， b=12.2025（6），c= 12.0204（5） ?，β=111.4777（14）°；Z=2；化學(xué)計量式： C10H12N4O5S·0.5H2O，1個不對稱單元含有2分子他唑巴坦分子和1分子結(jié)晶水。與無水物晶體相似，晶胞中三唑環(huán)的N和羧基的H通過氫鍵連接；但水分子通過3個氫鍵分別與他唑巴坦分子的三唑基、羧基和磺?；Y(jié)合（距離分別為2.770 ? 、2.594 ? 和2.735 ?），因而晶格結(jié)構(gòu)與無水物晶體不同[22]。半水合物晶體II為正交晶系（在5 ℃，乙醇-水=70：30（V/V）的飽和溶液中結(jié)晶）；晶胞中他唑巴坦羧基的H與β-內(nèi)酰胺環(huán)的N之間存在分子內(nèi)的氫鍵，不對稱單元中二個分子的氫鍵鍵長分別為2.654 ?和2.681 ?，與半水合物I分子間的作用方式不同；此外，水分子與他唑巴坦的羧基和羰基分別形成二個氫鍵（距離分別為2.579 ?和3.075 ?），水分子在晶格中十分穩(wěn)定，至熔融分解時才釋放；而他唑巴坦分子間不存在氫鍵聯(lián)系[23]?？傮w而言，他唑巴坦的固體穩(wěn)定性通常較好。

在藥物制劑中他唑巴坦通常以他唑巴坦鈉的形式存在，其穩(wěn)定性與生產(chǎn)工藝有關(guān)。如注射用哌拉西林鈉他唑巴坦鈉常以哌拉西林酸與他唑巴坦水合物為原料，與成鹽劑（碳酸鈉）成鹽后，由冷凍干燥工藝得到。制劑中的哌拉西林鈉與他唑巴坦鈉均為無定形產(chǎn)品，因而，對其水分含量的控制是穩(wěn)定性的關(guān)鍵。

2.2.2 降解反應(yīng)

他唑巴坦與舒巴坦中在溶液中的降解反應(yīng)途徑不完全相似（圖7）[24-25]。在堿性水溶液中，他唑巴坦可形成降解物I；降解物I僅在堿性環(huán)境下穩(wěn)定，在酸性和中性溶液中可迅速分解成降解物II（2-氨基-3-甲基-3-亞磺酸基-4-（1氫-1，2，3-三氮唑-1-基）-丁酸，USP中的雜質(zhì)A）和降解物III（乙酸甲醛）；在酸性溶液中，降解物II可以繼續(xù)降解為三氮雜和多個結(jié)構(gòu)未知的降解物（降解物IIIa-IIId）。在不同pH條件下，他唑巴坦不僅降解反應(yīng)速度不同，降解途徑也不完全相同，因而所能檢測到的降解產(chǎn)物也不完全相同。在堿性甲醇溶液中他唑巴坦則可形成一對順反異構(gòu)體（Ia，Ib）。在固態(tài)下如冷凍干燥的樣品中，他唑巴坦的降解反應(yīng)途徑與其在溶液中的反應(yīng)相似，但由于降解物I非常不穩(wěn)定，通常檢測不到它的存在，而僅能檢測到降解物II和降解物III；此外，固態(tài)條件下還可以檢測到降解物IV，其仍可能源于降解物I的進(jìn)一步降解。

2.3 對降解雜質(zhì)的控制

由于舒巴坦降解物的響應(yīng)值在藥典收載的HPLC-UV色譜系統(tǒng)（檢測波長215 nm）中均較低，因而各國藥典對其降解雜質(zhì)的控制策略不同。EP11.0在列出的有關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)中，明確了雜質(zhì)A（降解雜質(zhì)VIII）和雜質(zhì)G（降解雜質(zhì)IV）（圖6）的結(jié)構(gòu)，但僅對雜質(zhì)A作為特定雜質(zhì)進(jìn)行控制，雜質(zhì)G作為非特定雜質(zhì)進(jìn)行控制?！吨袊幍洹?020年版采用HPLC主成分自身對照法控制舒巴坦中的雜質(zhì)，采用2-氨基-3-甲基-3-亞磺酸基丁酸（降解雜質(zhì)VIII）進(jìn)行系統(tǒng)適用性實驗，但未對降解雜質(zhì)作為特定雜質(zhì)進(jìn)行控制。

對他唑巴坦降解雜質(zhì)的控制情況與舒巴坦相似。USP（2020）有關(guān)物質(zhì)測定采用HPLC-UV色譜系統(tǒng)，檢測波長為210 nm；并將降解雜質(zhì)II（圖7）作為特定雜質(zhì)進(jìn)行控制，并利用降解雜質(zhì)II對照品（USP雜質(zhì)A對照品）進(jìn)行系統(tǒng)適用性實驗，保證色譜系統(tǒng)的有效性?！吨袊幍洹?020年版收載的檢測方法色譜流動相與檢測波長均與USP不同，且未提供任何與他唑巴坦降解雜質(zhì)相關(guān)的信息，因而無法判斷其對他唑巴坦降解雜質(zhì)的檢測能力。

在對其復(fù)方制劑如氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦復(fù)方制劑的分析中，由于舒巴坦/他唑巴坦降解雜質(zhì)與氨芐西林/哌拉西林降解雜質(zhì)紫外響應(yīng)因子的巨大差異，且舒巴坦/他唑巴坦降解雜質(zhì)的保留值通常均較小，因而在分析中非常容易被忽略，如對氨芐西林/舒巴坦有關(guān)物質(zhì)的分析[26]等。

綜上，對青霉烷砜類酶抑制劑降解雜質(zhì)的控制是雜質(zhì)譜控制的薄弱環(huán)節(jié)，其原因為在目前的HPLC-UV色譜系統(tǒng)中，其降解產(chǎn)物的紫外響應(yīng)值較低且保留值也較小，在分析中特別是在對其復(fù)方制劑的雜質(zhì)譜分析中很容易被忽略。開發(fā)針對紫外吸收較弱、極性較強(qiáng)的舒巴坦/他唑巴坦降解雜質(zhì)的適宜色譜系統(tǒng)是其雜質(zhì)譜控制的發(fā)展方向之一。

3 阿維巴坦鈉

20世紀(jì)90年代中期，科學(xué)家預(yù)測二氮雜二環(huán)辛烷（diazabicycloocatanes，DBOs）類化合物可能具有與β-內(nèi)酰胺類抗生素相似的抗菌作用，但由于其結(jié)構(gòu)與β-內(nèi)酰胺類化合物完全不同，因而可能具有耐β-內(nèi)酰胺酶的特性。雖然后期的研究中未能從中篩選出具有強(qiáng)抑菌活性的化合物，但發(fā)現(xiàn)阿維巴坦（avibactam）和MK-7655均具有較好的抑制β-內(nèi)酰胺酶的作用[6]。阿維巴坦（（2S，5R）-7-氧-6-（亞氧基）-1，6-重氮雜環(huán)[3，2，1]辛烷-2-羧酰胺） 是第一個完成臨床試驗的非β-內(nèi)酰胺型β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，它對A類、C類和一些D類β-內(nèi)酰胺酶均用較好的抑制作用，其復(fù)方制劑注射用頭孢他啶阿維巴坦鈉已在臨床應(yīng)用。

阿維巴坦鈉是多晶型藥物，可以形成二水合物（晶型E）、一水合物（晶型A）和兩種無水物（晶型B和晶型D）晶體，4種晶體的單晶結(jié)構(gòu)不同，且表現(xiàn)出不同的粉末X衍射特征（圖8a）[27]。晶型E（二水合物）晶體為正交晶系，空間群為P212121；晶胞參數(shù)：a=7.7815（16）?， b=12.374（3）?，c=12.931（3）?；Z=4；化學(xué)計量式： C7H10N3NaO6S·2H2O; 晶型A（一水合物）晶體為單斜晶系，空間群為P21；晶胞參數(shù)：a=8.6213（17）?，b=6.9281（14）?，c=10.391（2）?；β=91.82（3）°；Z=2；化學(xué)計量式： C7H10N3NaO6S·H2O; 晶型B（無水合物）晶體為單斜晶系，空間群為P21；晶胞參數(shù)：a=8.5289（17）?，b=6.2868（13）?，c=10.219（2）?；β=93.77（3）°；Z=2；化學(xué)計量式： C7H10N3NaO6S; 晶型D（無水合物）晶體為單斜晶系，空間群為P21；晶胞參數(shù)：a=8.0823（16）?， b=6.4168（13）?，c=10.434（3）?；β=104.13（3）°；Z=2；化學(xué)計量式： C7H10N3NaO6S。

采用TG結(jié)合DSC分析阿維巴坦鈉4種晶體的熱穩(wěn)定性，探討水分子對晶體穩(wěn)定性的影響（圖8b～c）。在晶型A（一水合物）的TG圖譜中，在溫度378～389 K范圍可見明顯的失重（約5.9%），對應(yīng)的DSC曲線中也出現(xiàn)明顯的放熱峰，提示結(jié)晶水的丟失；在510 K時樣品分解。在晶型B和晶型D（無水物）的TG圖譜中，在500 K之前未見明顯失重，二者分別在510 K和502 K處分解，提示晶型B較晶型D對熱更穩(wěn)定。在晶型E（二水合物）的TG圖譜中，樣品失重約為11.20%，與理論含水量11.11%基本一致；在約509 K時分解，分解溫度與晶型A和晶型B相似；在對應(yīng)的DSC曲線中，晶型E在359～372 K和375～391 K處顯示出兩個吸熱峰，提示其脫水過程分為兩步，第一步丟失僅通過氫鍵相連接的水分子[H2O（1）]，第二步丟失與Na+離子配位結(jié)合的水分子[H2O（2）]。

采用動態(tài)水分吸附實驗（DVS）分析阿維巴坦鈉不同晶型的吸水/脫水特性，并通過粉末-X衍射（PXRD）試驗對晶型的轉(zhuǎn)變進(jìn)行確證。晶型A在相對濕度（RH）>85%時開始吸水；當(dāng)RH達(dá)到95%時吸收水分約6%；當(dāng)RH降至85%時，形成了二水合物（晶型E）（圖9a）。晶型B（無水物）的水合/脫水過程可分為二個階段：在RH 70%～85%范圍吸附約6.2%的水，首先形成晶型A；再隨著RH的增加持續(xù)吸收水分，當(dāng)RH達(dá)到95%時吸水量為21.2%；當(dāng)RH再降至85%時，吸水量為12.1%，形成了二水合物（晶型E）（圖9b）。該結(jié)果提示晶型B的第一步水合作用具有較低的能壘，也說明晶型A晶體和晶型B的結(jié)構(gòu)較相似。晶型D（無水物）與晶型B的水合特性不同，吸收水分后直接轉(zhuǎn)化為二水合物（圖9c）：晶型D當(dāng)RH在0～80%范圍水分含量基本不變；之后開始逐漸吸附水分，當(dāng)RH達(dá)到95%時，吸水量約15%；RH再次下降到80%時，吸水量約12.4%，形成了晶型E（二水合物）。晶型D與晶型A晶格結(jié)構(gòu)的差異使其無法直接轉(zhuǎn)變成晶型A。晶型E在RH大于80%時開始吸水，當(dāng)HR為95%時可吸收約4%的水（圖9d）；其對水分的高度穩(wěn)定性可能與水分子與API分子之間具有較強(qiáng)的配位鍵和豐富的氫鍵有關(guān)。上述結(jié)果提示，無水物晶體中分子間的相互作用保證了晶體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，而在水合物晶體中，分子間較強(qiáng)的配位鍵和豐富的氫鍵相互作用保證了水合物晶體的穩(wěn)定性。不同晶型的阿維巴坦鈉對水的穩(wěn)定性依次為晶型B<晶型D<晶型A<晶型E。

對阿維巴坦鈉的晶體穩(wěn)定性特性揭示，雖然其可以形成多種不同的晶型，但不同晶型在固體狀態(tài)均較穩(wěn)定。對阿維巴坦鈉的水解反應(yīng)等降解反應(yīng)特性的報道目前尚較少見，脫羰基阿維巴坦（CAS：2243810-78-6）（decarbonylated avibatan）可能是其主要的降解（水解）產(chǎn)物。因而，系統(tǒng)地揭示阿維巴坦鈉的水解反應(yīng)途徑是阿維巴坦鈉及制劑雜質(zhì)譜控制的關(guān)鍵。

參 考 文 獻(xiàn)

Lima L M， Monteiro da Silva B N， Barbosa G， et al. β-Lactam antibiotics： An overview from a medicinal chemistry perspective[J]. Eur J Med Chem， https：//doi.org/10.1016/j.ejmech.2020.112829.

韓江雪， 劉憶霜， 肖春玲. β-內(nèi)酰胺酶抑制劑研究進(jìn)展[J]. 中國抗生素雜志， 2019， 44（6）： 647-653.

鄭衛(wèi). β-內(nèi)酰胺酶及其抑制劑研究進(jìn)展[J]. 國外醫(yī)藥抗生素分冊， 2001， 22（2）： 49-56.

宋丹青， 張致平. 青霉烷砜類β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的研究進(jìn)展[J]. 國外醫(yī)藥抗生素分冊， 2000， 21（2）： 68-70.

曾志旋， 曹勝華， 陳林. 新型β-內(nèi)酰胺酶抑制劑—阿維巴坦的研究進(jìn)展[J]. 國外醫(yī)藥抗生素分冊， 2014， 35（2）： 58-62.

Coleman K. Diazabicyclooctanes （DBOs）： A potent new class of non-beta-lactam beta-lactamase inhibitors[J]. Curr Opin Microbiol， 2011， 14（5）： 550-555.

Wang D Y， Abboud M I， Markoulides M S， et al. The road to avibactam： the first clinically useful non-β-lactam working somewhat like a β-lactam[J]. Future Med Chem， 2016， 8（10）： 1063-1084.

Docquiera J D， Manganib S. An update on β-lactamase inhibitor discovery and development[J]. Drug Resist Update， 2018， 36： 13-29.

Bersanetti P A， Almeida R M R G， Barboza M， et al. Kinetic studies on clavulanic acid degradation[J]. Biochem Eng J， 2005， 23（1）： 31-36.

Santos V C， Pereira J F B， Haga R B， et al. Stability of clavulanic acid under variable pH， ionic strength and temperature conditions. A new kinetic approach[J]. Biochem Eng J， 2009， 45（2）： 89-93.

Haginaka J， Nakagawa T， Uno T. Stability of clavulanic acid in aqueous solutions[J]. Chem Pharm Bull， 1981， 29（11）： 3334-3341.

Finn M J， Harris M A， Hunt E， et al. Studies on the hydrolysis of clavulanic acid[J]. J Chem Soc Perkin Trans 1， 1984： 1345-1349.

Haginaka J， Yasuda H， Uno T， et al. Degradation of clavulanic acid in aqueous alkaline solution： Isolation and structural investigation of degradation products[J]. Chem Pharm Bull， 1985， 33（1）： 218-224.

Haginaka J， Yasuda H， Uno T， et al. Alkaline degradation of clavulanic acid and high performance liquid chromatographic determination by post-column alkaline degradation[J]. Chem Pharm Bull， 1983， 31（12）： 4436-4447.

Davies J S， Howarth T T. Clavulanic acid. Rearrangement to 3， 4-disubstituted pyrroles[J]. Tetrahedron Lett， 1982， 23（30）： 3109-3112.

Bird A E， Bellis J M， Gasson B C. Spectrophotometric assay of clavulanic acid by reaction with imidazole[J]. Analyst， 1982， 107（1279）： 1241-1245.

崇小萌， 李進(jìn)， 王琰， 等. 阿莫西林克拉維酸鉀片劑的關(guān)鍵質(zhì)量屬性與控制[J]. 藥學(xué)學(xué)報， 2016， 51（7）： 1121-1124.

薛晶， 朱克旭， 崇小萌， 等. 水分對阿莫西林克拉維酸鉀顆粒穩(wěn)定性的影響[J]. 中國藥學(xué)雜志， 2016， 51（3）： 224-229.

Haginaka J， Wakai J， Yasuda H， et al. Degradation kinetics of sodium sulbactam in aqueous solutions[J]. Chem Pharm Bull， 1985， 33（6）： 2461-2468.

Haginaka J， Wakai J， Yasuda H， et al. Alkaline degradation of sulbactam[J]. Chem Pharm Bull， 1985， 33（5）： 2035-2043.

Toomer C A， Schwalbe C H， Ringan N S， et al. Structural studies on tazobactam[J]. J Med Chem， 1991， 34（7）： 1944-1947.

Takahashi M， Uekusa H. Dehydration and rehydration mechanisms of pharmaceutical crystals： Classification of hydrates by activation energy[J]. J Pharm Sci， 2021. https：//doi.org/10.1016/j.xphs.2021.10.033.

袁耀佐， 胡昌勤， 金少鴻. 他唑巴坦中結(jié)晶水的研究[J]. 藥學(xué)學(xué)報， 2002， 37（2）： 144-147.

Marunaka T， Matsushima E， Minami Y， et al. Degradation of β-lactamase inhibitor， （2S，3R，5S）-3-methyl-7-oxo-3-（1H-1，2，3-triazol-1-yl-methyl）-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid 4，4-dioxide （YTR-830H）， in aqueous solutions and alkaline methanol solution： Pathway and structural elucidation of products[J]. Chem Pharm Bull， 1988， 36（11）： 4478-4487.

Matsushima E， Yoshida K I， Azuma R， et al. Degradation of β-lactamase inhibitor （2S， 3R， 5S）-3-methyl-7-oxo-3-（1H-1， 2， 3-triazol-1-yl-methyl）-4-thia-1-azabicyclo [3.2. 0]-heptane-2-carboxylic acid 4， 4-dioxide （YTR-830H） in the solid state： Structural elucidation[J]. Chem Pharm Bull， 1988， 36（11）： 4593-4596.

姚蕾， 施亞琴， 胡昌勤. 注射用氨芐西林鈉舒巴坦鈉中有關(guān)物質(zhì)HPLC檢測方法的改進(jìn)[J]. 中國抗生素雜志， 2009， 34（12）： 734-738.

Ding Z， Su W， Huang X， et al. Understanding the role of water in different solid forms of avibactam sodium and its affecting mechanism[J]. Cryst Growth Des， 2020， 20（2）： 1150-1161.