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    細胞外基質(zhì)對哮喘模型大鼠氣道平滑肌細胞免疫調(diào)節(jié)作用

    2015-01-16 05:38:38陳忠仁梁梅蘭
    醫(yī)學研究雜志 2015年1期
    關(guān)鍵詞:平滑肌緩沖液氣道

    陳忠仁 梁梅蘭

    支氣管哮喘是一種氣道慢性炎癥疾病,由多種細胞和細胞組分參與。作為維持氣道結(jié)構(gòu)和功能重要成分的氣道平滑肌細胞(airway smooth muscle cell,ASMCs)和細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM),在哮喘的疾病發(fā)生、發(fā)展 中 起了重要的作用[1,2]。ASMCs 在炎性反應(yīng)中作用比較活躍,能夠分泌多種炎性介質(zhì),產(chǎn)生一系列細胞因子,表達免疫細胞的黏附分子以及包括Fas 在內(nèi)的一些細胞表面分子標志物,ASMCs 所分泌的這些因子能夠促進ASMCs 自身的增殖[3~5]。ASMCs 還能夠產(chǎn)生細胞外基質(zhì)、基質(zhì)金屬蛋白酶和相關(guān)的抑制劑,促進有絲分裂的發(fā)生,是引起支氣管哮喘氣道狹窄的重要病理因素,如Ⅰ型膠原(type Ⅰcollagen,COL -1)、層黏蛋白(laminin,LA)等有顯著增加,兩者可相互影響。為了探討這一問題,本實驗將大鼠ASMCs 種植于用涂覆有ECM 的培養(yǎng)瓶中,采用Western blot 法檢測哮喘ASMCs eotaxin、TGF-β1 蛋白的表達,探討ECM 對哮喘大鼠ASMCs 免疫功能的調(diào)節(jié)作用。

    材料與方法

    1.材料:健康Wistar 雄性大鼠。卵清蛋白(ovalbumin,OVA)﹑COL-1、LA、胎牛血清(fetus bovine serum,F(xiàn)BS)、木瓜蛋白酶﹑Ⅰ型膠原酶﹑牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)購于美國Sigma 公司。小鼠抗肌動蛋白(α -actin)和Trizol 溶液購自美國GIBCO 公司。單去污劑裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、10%分離膠、4%濃縮膠、0.15mol/L NaCl 溶液、2 ×(5 ×)SDS 上樣緩沖液、電泳緩沖液、轉(zhuǎn)移緩沖液、10 ×麗春紅染液、封閉液、TBST、TBS、洗脫抗體緩沖液、抗體、化學發(fā)光試劑。

    2.大鼠哮喘模型的建立及分組:(1)哮喘模型的建立:參照文獻[7]中的方法,在大鼠后腿內(nèi)側(cè)皮下注射1ml 體積的0.9%生理鹽水混合液(含有10mg 的OVA 以及200mg 的氫氧化鋁);注射后第8 天重復(fù)上述步驟;注射第15 天玻璃容器中進行含有2%OVA 生理鹽水的噴霧試驗,對大鼠進行噴霧處理,每次噴霧量控制在50ml,每周噴霧3 次,每次30min,共進行15 天。當大鼠出現(xiàn)躁狂、嗆咳、呼吸急促癥狀時,即哮喘模型制備成功。(2)大鼠分組:16 只大鼠隨機分為兩組,每組8只。哮喘組,利用OVA 制備模型;對照組,生理鹽水替代OVA。

    3.大鼠氣道平滑肌細胞(ASMCs)的培養(yǎng)、鑒定和分組:(1)大鼠ASMCs 的培養(yǎng):根據(jù)文獻[8]報道的方法分離大鼠肺葉支氣管的ASMCs。在OVA 或生理鹽水激發(fā)2 周后,在第24h 進行麻醉取材。取肺后移入超凈臺,置于冰盒上。倒入已加雙抗的D-HANKS 液,清洗肺部。清洗后的肺組織切成1~2mm 的組織塊,將其置于消化液(含1mg/mlⅠ型膠原酶、1mg/ml 木瓜蛋白酶、10mg/mlBSA 的D -HANKS 液)中,37℃消化15min。消化完畢后,加入無血清的DMEM 培養(yǎng)基,980r/min,離心10min。棄上清,加入約1ml 含20%FBS 的DMEM。移入細胞瓶中,37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng),每隔3 天換液1 次,大約1 周時間,當細胞長滿單層后,胰酶消化傳代培養(yǎng)。實驗所用的細胞培養(yǎng)至第2 ~5 代。ASMCs 的鑒定主要在顯微鏡觀察細胞形態(tài),并通過α-actin 進行細胞免疫熒光染色。

    4.培養(yǎng)瓶的處理:根據(jù)參考文獻[9]報道的方法,取無菌細胞培養(yǎng)瓶(50ml),將同一濃度的COL -1 以及LA(10μg/ml)加入細胞瓶中,加入的體積覆蓋瓶底即可,搖勻后放于37℃孵箱過夜培養(yǎng)。取出后無菌條件下加入0.1%的BSA 封閉,室溫作用30min,棄掉液體,無血清DMEM 培養(yǎng)液清洗瓶底,吸干液體,再自然風干,可直接使用,或封好瓶口待用。

    5.ASMCs 分組:分離培養(yǎng)得到兩組大鼠的ASMCs,隨機分為3 組。①空白組:細胞正常培養(yǎng);②COL-1 組:將ASMCs傳代接種在包被有COL -1(10μg/ml)的細胞瓶中;③LA 組:將ASMCs 傳代接種在包被有LA(10μg/ml)的細胞瓶中。每組各3 瓶。

    6. Western blot 法檢測ASMCs 中eotaxin、TGF -β1 蛋白的表達:參照Santa Cruz 公司提供的蛋白提取方法,應(yīng)用蛋白裂解緩沖液分別裂解細胞得到總蛋白。以牛血清蛋白作為標準品,繪制標準曲線,計算提取液的蛋白濃度。取總蛋白50μg,10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白分離,轉(zhuǎn)膜、封閉,一抗的工作濃度1∶500,β -actin 作為內(nèi)參照,封閉孵育二抗,工作濃度1∶1000。用ECL 化學發(fā)光試劑盒檢測雜交信號。

    7.統(tǒng)計學方法:采用SPSS 10.0 統(tǒng)計軟件,實驗數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差(±s)表示,進行方差分析和q 檢驗,P <0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    結(jié) 果

    1.大鼠ASMCs 鑒定:如圖1 所示,通過細胞形態(tài)及免疫熒光染色顯示,分離得到的細胞形態(tài)長梭型,與平滑肌細胞形態(tài)形似,并且α -actin 的表達為陽性,可以判定培養(yǎng)的細胞為大鼠平滑肌細胞。

    圖1 氣道平滑肌細胞α-actin DAB 染色陽性(SP,×400)

    2.Western blot 法檢測eotaxin、TGF -β1 蛋白的表達:如圖2、圖3 所示,通過分析每組條帶的灰度值,對蛋白含量進行計算比較。從表1、圖2、圖3 中可看出,eotaxin、TGF-β1 蛋白在各組皆有表達,并且表達量各有不同:在哮喘模型組當中,哮喘干預(yù)組顯著高于空白組,空白組含量顯著高于正常對照組(P<0.05);在正常對照組中,表達差異無統(tǒng)計學意義(P >0.05)。

    表1 大鼠氣道平滑肌細胞eotaxin、TGF-β1 的表達含量(±s)

    表1 大鼠氣道平滑肌細胞eotaxin、TGF-β1 的表達含量(±s)

    與哮喘空白組相比,#P <0.05;與正常對照組相比,* P <0.05

    組別 eotaxin TGF-β1哮喘LA 39182 ±62# 37165 ±53#哮喘COL-1 42663 ±41# 32465 ±37#哮喘空白 38633 ±56* 31888 ±82*正常LA 16656 ±61 16583 ±47正常COL-1 16575 ±47 16578 ±52正常對照16525 ±58 16590 ±49

    圖2 eotaxin 蛋白電泳圖

    圖3 TGF-β1 蛋白電泳圖

    討 論

    支氣管哮喘是一種氣道慢性非特異性炎癥疾病,但隨著疾病的進展,可出現(xiàn)氣道重塑,這與ASMCs 的功能狀況密切相關(guān)。ASMCs 是炎性因子的作用靶點,同時也可分泌多種細胞因子和免疫活性蛋白[10]。氣道平滑肌細胞有兩種表型:①以收縮功能為主的收縮型;②能合成、分泌及表達多種活性物質(zhì)的合成型[11]。合成型氣道平滑肌細胞可以旁分泌、自分泌等方式分泌多種活性物質(zhì)參與支氣管哮喘的病理、生理過程,啟動和維持哮喘氣道高反應(yīng),引起慢性炎癥和氣道重塑。以往觀點認為,ASMCs 在哮喘發(fā)病過程中,在神經(jīng)源性信號和炎性介質(zhì)調(diào)控下,參與氣管收縮和舒張的過程。隨著不斷地深入研究發(fā)現(xiàn),ASMCs 不僅可以調(diào)節(jié)支氣管的收縮和舒張,而且可分泌及表達多種免疫調(diào)節(jié)介質(zhì),參與氣道慢性炎癥和氣道重塑的發(fā)生和發(fā)展。近年來發(fā)現(xiàn)ASMCs 有新的生物學功能,如向黏膜層遷移使平滑肌層增厚、合成及炎癥網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)功能及動力學異常等。ASMCs 與ECM 由于其組織結(jié)構(gòu)特點,在哮喘的發(fā)生、發(fā)展過程中存在著緊密聯(lián)系,它們相互作用,發(fā)揮其功能特點,以減少對支氣管的不利影響。ASMCs 可分泌多種基質(zhì)蛋白,減緩ECM 的降解,加速氣道重建。受影響的ECM 又可調(diào)控ASMCs 的生存、增殖和遷移等生物學行為。研究表明,哮喘ASMCs 可分泌蛋白多糖、? 型膠原、硫酸軟骨素,使ECM 含量增加,這種作用不能被激素所抑制,并可分泌TIMP -1 和TIMP -2,抑制ECM 降解[12~14,15]。不同種類和數(shù)量的ECM 可影響ASMCs 的遷移速度、增殖效率、生存時間和上調(diào)平滑肌細胞的分泌功能,如FN 呈劑量依賴性促進ASMCs的增殖,種植于COL -1 和LA 的ASMCs 凋亡率下降[16]。目前還沒有研究發(fā)現(xiàn)ECM 在ASMCs 免疫反應(yīng)方面是否具有調(diào)節(jié)作用,以及怎樣參與信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

    在筆者的實驗研究中,將eotaxin 及TGF -β1 作為探討ASMCs 免疫功能的重要因素。嗜酸性粒細胞趨化因子(eotaxin)最早是在嗜酸性粒細胞浸潤的支氣管肺泡灌洗液中發(fā)現(xiàn)的,在人的多種組織中都能夠檢測到eotaxin mRNA 的表達,可由不同來源的細胞產(chǎn)生[17]。支氣管哮喘的典型病理特征即嗜酸性粒細胞廣泛浸潤,而eotaxin 對嗜酸性粒細胞具有趨化作用,使其靶向遷移至炎性反應(yīng)部位,加劇哮喘的炎性反應(yīng)。同時,研究表明,eotaxin 也會影響ASMCs 在炎性反應(yīng)時的遷移方向[18]。TGF -β 生物學主要功能與炎性反應(yīng)相關(guān),是一些炎性細胞的趨化劑,可由肺部多種免疫相關(guān)的細胞分泌;同時可以促進ECM 的表達并抑制其分解,對平滑肌細胞的增殖具有顯著作用,并通過多種通路調(diào)控哮喘的疾病過程,氣道平滑肌細胞可以分泌TGF -β[19,20]?;谶@兩種蛋白在免疫調(diào)節(jié)方面的功能,筆者將其作為研究ASMCs 的重要指標。

    總之,本實驗結(jié)果顯示,ECM 對ASMCs 中eotaxin,TGF-β1 的表達有正調(diào)控作用,對哮喘氣道平滑肌細胞的作用更為顯著,這為今后防治哮喘提供了一個新的思路和方法。但ECM 通過何種途徑調(diào)節(jié)哮喘ASMCs 的免疫功能還不是很清楚,這需要進行進一步研究。

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