基于HPLC測定黃柏不同炮制品中黃柏堿與小檗堿的含量

楊永樂 胡振宇 阿麗牙·阿布來提 葉喜德

1萬年縣中醫(yī)院質(zhì)控科，上饒 335500；2江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南昌 330004

黃柏為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinenseSchneid.的干燥樹皮，樹皮內(nèi)層經(jīng)炮制后入藥［1］。依照其來源，可分為川黃柏和關(guān)黃柏［2］。黃柏首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，又名“檗木”，列為上品，其味苦，寒，無毒，隨后歷代本草均有記載［3］。黃柏具清熱解毒、瀉火燥濕之功效，主要用治火熱毒邪氣、濕熱等證，臨床應(yīng)用廣泛［4-8］。其主要生物活性成分為生物堿，包括小檗堿、巴馬汀、藥根堿和黃柏堿等［9-12］。其中小檗堿、巴馬汀、藥根堿為抗病原微生物的有效成分，而黃柏堿則具有降壓作用［13-15］。此外，黃柏還具有調(diào)節(jié)免疫功能、強心、抗?jié)兊茸饔茫?6-17］。目前，對黃柏的研究多數(shù)集中在成分分析和藥效研究，鮮有基于炮制方法開展其主要有效成分差異性的研究報道［18-22］。黃柏炮制方法較多，主要有鹽炙、酒炙和炒炭等［23-24］。由于不同炮制方法存在輔料、加工方法和炮制程度的差異，這勢必會影響藥材的質(zhì)量與療效。黃柏堿與小檗堿是黃柏的主要有效成分，也是發(fā)揮藥效的關(guān)鍵因素。因此，本研究以黃柏為原藥材，采用不同炮制方法制備不同炮制品，建立黃柏堿與小檗堿的含量測定方法，并在同一條件下比較黃柏不同炮制品之間的含量差異，為其深入研究提供參考。

儀器與試藥

1.藥品

黃柏原藥材（產(chǎn)自安徽匯仁堂中藥飲片有限公司）經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)劉應(yīng)蛟副教授鑒定為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron amurenseRupr.的干燥樹皮。黃柏堿（批號：wkq21031209，純度≥98%）、小檗堿（產(chǎn)品批號：20233011，純度≥98.96%）均由成都克洛瑪生物科技有限公司提供。

2.儀器

安捷倫1100高效液相色譜儀（VWD檢測器，安捷倫儀器有限公司），昆山-500E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），F(xiàn)A1004N 1000000電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司），TDL-80-2C低速離心機（上海安翔科學(xué)儀器廠）。

3.試劑

乙腈（色譜純，含量≥99.9%，格瑞斯化工科技有限公司），甲醇（色譜純，格瑞斯化工科技有限公司），甲酸（色譜純，含量≥98.0%，天津市大茂化學(xué)試劑廠），雙蒸水（自制）。

方法與結(jié)果

1.色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Dikma）；流動相：乙腈-0.1%甲酸（磷酸調(diào)至pH=2.5），梯度洗脫：0～5 min，90%乙腈；6～14 min，79%乙腈；15～22 min，70%乙腈；流速：1.0 ml·min-1；運行時間：22 min；柱溫：25 ℃；檢測波長：284 nm；進樣量：20 μl。理論塔板數(shù)根據(jù)2020年版《中華人民共和國藥典》［1］計算，黃柏堿峰結(jié)果＞6 000，小檗堿峰結(jié)果＞4 000。

2.溶液的制備

2.1.對照品儲備液的制備 精密稱量黃柏堿1.09 mg、小檗堿1.07 mg，分別加甲醇10 ml，稀釋，制備成對照品儲備溶液，冷藏，備用。

2.2.混合對照品溶液的制備 精密量取黃柏堿儲備液30 μl、小檗堿儲備液150 μl，加甲醇定容至10 ml，超聲提取15 min，得黃柏堿為0.032 mg·L-1和小檗堿為0.178 mg·L-1的混合對照品溶液，0.22 μm微孔膜過濾，得濾液，待測。

2.3.供試品溶液的制備

2.3.1.黃柏不同炮制品的制備 （1）生黃柏：取原藥材，洗凈，浸潤，待藥材軟化切成絲，即得。（2）鹽黃柏：稱取1.0 g食鹽，加適量純凈水溶解后濾過，放置一旁備用。然后取50.0 g干燥黃柏絲放入濾過后的鹽水中拌勻，稍悶，待鹽水被吸盡后，置入炒制容器內(nèi)，用文火加熱，不斷翻炒，待表面炒干后取出放涼，篩去碎屑，即得。黃柏與食鹽比例為50∶1。（3）酒黃柏：取黃柏生品50.0 g，于一定比例黃酒浸潤，悶透，置入炒制容器內(nèi)，用文火加熱至表面棕黃色時，取出放涼，篩去碎屑，即得。黃柏與黃酒的比例為10∶1。（4）黃柏炭：取黃柏生品50.0 g，置熱鍋內(nèi)，武火加熱至表面焦黑色，內(nèi)部焦黃色時取出，噴灑少許清水，晾干，篩去碎屑，即得。

2.3.2.黃柏樣品制備 精密稱取生黃柏、鹽黃柏、酒黃柏、黃柏炭粉末各1 g，研磨成細粉，分別裝入15 ml EP 管中，加入5.5 ml 50%甲醇溶液，搖勻，待溶劑被吸收后，超聲提取30 min，取出，3000 r·min-1離心（離心半徑為14.7 cm）10 min，傾取上清液，放入10 ml 容量瓶中，連續(xù)反復(fù)提取2 次，合并上清溶液，用0.22 μl 微孔濾膜過濾，得黃柏不同炮制品樣品溶液，分別保存在4 ℃冰箱內(nèi)，待測。

3.方法學(xué)考察

3.1.專屬性考察 精密吸取“2.2.”項中混合標準溶液5 μl，根據(jù)“1.”項色譜條件進行檢測。黃柏堿和小檗堿色譜峰見圖1，結(jié)果表明，黃柏堿和小檗堿分離和峰型良好。

圖1 黃柏不同炮制品中黃柏堿和小檗堿的高效液相色譜法（HPLC）圖

3.2.線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.”項中混合對照品溶液5 μl，根據(jù)“1.”項色譜條件進行檢測。以峰面積積分值（Y）、注射量（X）進行線性回歸方程，計算得回歸方程，分別得黃柏堿Y=17.65X+35.97，R2=0.999 2，線性范圍0.354～0.760 g·L-1；小檗堿Y=846.54X+18.92，R2=0.999 9，線性范圍3.865～7.530 g·L-1。黃柏堿與小檗堿成分的線性關(guān)系考察結(jié)果見圖2，結(jié)果表明黃柏堿和小檗堿具有良好線性關(guān)系。

圖2 混合對照品溶液中黃柏堿（A）與小檗堿（B）線性關(guān)系考察結(jié)果

3.3.精密度試驗 精密吸取“2.2.”項中混合對照品溶液5 μl，反復(fù)取樣6 次，得高效液相色譜法（HPLC）色譜圖。計算得黃柏堿、小檗堿峰面積的相對標準偏差（RSD）值分別為0.90%、0.70%，RSD≤2%，結(jié)果表明，該法精密度良好。見表1。

表1 混合對照品溶液中黃柏堿與小檗堿的精密度試驗結(jié)果（6份）

3.4.重復(fù)性試驗 精密吸取“2.3”項中生黃柏供試品溶液，設(shè)為3 組，每組2 份，共6 份，上樣測定，得各樣品HPLC色譜圖。利用出峰時間和峰面積計算可知，黃柏堿、小檗堿峰面積RSD 值分別為2.50%、1.30%，RSD≤3%，說明該法重復(fù)性良好。見表2。

表2 生黃柏供試品溶液中黃柏堿與小檗堿重復(fù)性試驗結(jié)果（6份）

3.5.穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.3”項中生黃柏供試品溶液常溫下靜置，于0、3、6、9、12、24 h取樣檢測，得HPLC色譜圖，黃柏堿與小檗堿峰面積RSD 值分別為1.50%、0.29%，RSD≤2%，說明生黃柏供試品溶液在常溫環(huán)境下靜置24 h穩(wěn)定性良好。見表3。

表3 常溫下靜置不同時間的生黃柏供試品溶液中黃柏堿與小檗堿穩(wěn)定性試驗結(jié)果

3.6.加樣回收試驗 稱取同一供試品6 份（生黃柏），每份精密稱定1.0 g，將一定量黃柏堿和小檗堿對照品溶液分別加入每份供試品中，按“2.3”項方法制備，測定并計算加樣回收率，黃柏堿和小檗堿的回收率分別為99.84%、99.97%，RSD 分別為0.40%、0.17%，說明該法回收率良好。見表4、表5。

表4 生黃柏供試品黃柏堿加樣回收試驗結(jié)果（6份）

表5 生黃柏供試品小檗堿加樣回收率考察結(jié)果（6份）

4.樣品測定

精密吸取已制備好的4 種黃柏炮制品供試品溶液，根據(jù)“1.”項色譜條件進樣檢測，每組炮制品種進樣3 次，計算黃柏堿與小檗堿的含量，見表6。結(jié)果表明黃柏不同炮制品中黃柏堿和小檗堿含量差異較大，黃柏堿含量由低到高順序為：黃柏炭＜黃柏生品＜鹽黃柏＜酒黃柏；小檗堿含量由低到高的順序為黃柏炭＜鹽黃柏＜黃柏生品＜酒黃柏。

表6 4種黃柏炮制品供試品溶液黃柏堿與小檗堿的含量測定結(jié)果

討論

黃柏為一味常用中藥，其性寒，味苦，具清熱燥濕、瀉火解毒、除骨蒸之功效，臨床常用治濕熱瀉痢、黃疸尿赤、帶下陰癢、濕疹濕瘡等證［25］，所含小檗堿、黃柏堿、藥根堿等生物堿類成分具有抗菌、消炎、利尿、抗心律等多種藥效作用［26］，易受外界環(huán)境的影響而發(fā)生變化［27］。因此，不同炮制方法對其化學(xué)成分影響的差異性較大，進而影響藥材質(zhì)量。從成分研究來看，黃柏藥材中小檗堿含量相對較多，常作為評價藥材質(zhì)量的關(guān)鍵指標［28-29］。但由于許多藥材，如黃連、三顆針等均含有該成分［30-31］，故評價黃柏藥材質(zhì)量及優(yōu)選優(yōu)質(zhì)的炮制品，常選擇兩種或兩種以上的有效成分進行研究。為此，本研究選用黃柏堿和小檗堿作為檢測指標，以比較黃柏不同炮制品之間的含量差異，目的是探討不同炮制方法對藥材質(zhì)量的影響。

為確保本研究方法準確、可靠，實驗對流動相條件進行了優(yōu)化。研究比較了3 種不同系統(tǒng)的分離效果，即乙腈-水溶液、乙腈-50%甲醇溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液（磷酸調(diào)至pH=2.5），結(jié)果表明乙腈-水流動相系統(tǒng)洗脫能力不足，樣品分離度不如乙腈-50%甲醇溶液洗脫能力好；甲醇溶液洗脫能力較強，但峰型比乙腈-0.1%甲酸溶液（磷酸調(diào)至pH=2.5）差；綜合比較后發(fā)現(xiàn)，以乙腈-0.1%甲酸溶液（磷酸調(diào)至pH=2.5）為流動相所得樣品峰形及分離程度最好，可有效防止拖尾現(xiàn)象發(fā)生［32］。因此，本研究以乙腈-0.1%甲酸溶液（磷酸調(diào)至pH=2.5）作為流動相。

對于檢測波長，小檗堿波長常選擇345 nm，雖然其在該波長范圍內(nèi)靈敏度較高，但對黃柏堿的靈敏度不高［12］。而選擇220 nm 設(shè)為檢測波長時，雖然有利于黃柏堿的檢測，但小檗堿的靈敏度較低，吸收波長明顯變短。經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn)，兩者在284 nm 波長范圍靈敏度較高，故以284 nm 為檢測波長。本研究結(jié)果表明，黃柏經(jīng)不同方法炮制后，其主要成分黃柏堿和小檗堿含量會發(fā)生較大變化，其中酒炙品含量最高，而經(jīng)炒炭后2 種成分含量均明顯降低，說明黃柏化學(xué)成分受加工炮制的影響。推測可能是由于黃酒為弱有機溶劑，黃柏酒炙后能增加生物堿的溶解度而增高其含量。而黃柏炒炭后，經(jīng)過長時間高溫加熱，黃柏堿和小檗堿發(fā)生成分轉(zhuǎn)化而含量降低。因此，不同炮制方法會對黃柏的主要有效成分黃柏堿和小檗堿含量產(chǎn)生影響，且有可能影響藥效。但這種成分含量的變化，如何影響藥效及其作用機制仍未完全闡明，希望本文能為深入研究黃柏提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明楊永樂：醞釀和設(shè)計試驗，實施研究，文章撰寫，獲取研究經(jīng)費，行政；胡振宇：分析/解釋數(shù)據(jù)，對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱，統(tǒng)計分析；阿麗牙·阿布來提：采集數(shù)據(jù)，起草文章；葉喜德：技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)，支持性貢獻