體外模擬消化對鱘魚頭硒螯合肽結(jié)構(gòu)及抗氧化活性的影響

賈嬌 吳汶飛

摘要為了明確鱘魚頭蛋白肽和鱘魚頭硒螯合肽的抗氧化活性差異，體外模擬了口腔及胃腸道消化處理過程中鱘魚頭蛋白肽和鱘魚頭硒螯合肽的結(jié)構(gòu)及抗氧化活性變化。結(jié)果表明：鱘魚頭硒螯合肽的紫外光譜吸收峰在體外口腔胃腸模擬消化過程中比鱘魚頭蛋白肽更加穩(wěn)定。體外模擬消化導(dǎo)致鱘魚頭蛋白肽和鱘魚頭硒螯合肽的圓二色譜吸收峰強(qiáng)度顯著降低。粒徑分布結(jié)果也表明：鱘魚頭硒螯合肽在消化過程中具有更好的溶解性。ABTS、DPPH以及OH自由基清除活性結(jié)果顯示，在體外模擬消化后，鱘魚頭蛋白肽和鱘魚頭硒螯合肽的自由基清除活性進(jìn)一步增強(qiáng)，且鱘魚頭硒螯合肽的自由基清除能力最強(qiáng)。

關(guān)鍵詞鱘魚頭蛋白肽；硒螯合肽；結(jié)構(gòu)特性；體外模擬；抗氧化活性

中圖分類號TS254? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼A? 文章編號05176611（2024）07016905

doi：10.3969/j.issn.05176611.2024.07.040

Effects of in vitro Simulated Digestion on the Structure and Antioxidant Activity of Sturgeon Head Peptides-selenium

JIA Jiao1，2， WU Wen-fei1，2

（1.School of Food Science and Technology， Dalian Polytechnic University， Dalian， Liaoning 116034;2.National Engineering Research Center of Seafood， Dalian Polytechnic University， Dalian， Liaoning 116034）

AbstractIn order to clarify the difference in antioxidant activity of sturgeon head peptides and sturgeon head peptides-selenium， the structure and antioxidant activity changes of sturgeon head peptides and sturgeon head peptides-selenium during oral and gastrointestinal digestion were simulated in vitro. The results showed that the UV absorption peak of sturgeon head peptides-selenium is more stable than that of sturgeon head peptides during in vitro?simulated oral gastrointestinal digestion. in vitro?simulated digestion resulted in a significant decrease in the circular dichroism absorption peak intensity of sturgeon head peptides and sturgeon head peptides-selenium. The particle size distribution results also indicate that sturgeon head peptides-selenium has better solubility during digestion. The results of ABTS·+， DPPH· and ·OH scavenging activity showed that after simulated digestion in vitro， the free radical scavenging activities of sturgeon head peptides and sturgeon head peptides-selenium were further enhanced， and sturgeon head selenium-chelating peptide had the strongest free radical scavenging ability.

Key wordsSturgeon head peptides;Selenium-chelating peptides;Structural characteristics;in vitro simulation;Antioxidant activity

鱘魚（Sturgeon）隸屬于鱘形目硬骨魚綱［1］，是目前地球上最古老的軟骨硬鱗魚類之一［2］。鱘魚營養(yǎng)價(jià)值極其豐富，富含各種氨基酸、不飽和脂肪酸和膠原蛋白，營養(yǎng)價(jià)值遠(yuǎn)高于畜禽類［3］，其中P、Ca、Na、K、Mg、Cl等礦物質(zhì)含量高達(dá)2%［4］，蛋白含量高達(dá)21%［5］，是優(yōu)質(zhì)蛋白的重要來源，其藥用價(jià)值和保健功能在很多水產(chǎn)品之上［4］。近些年，隨著鱘魚年產(chǎn)量的逐年遞增［6］，有關(guān)其加工副產(chǎn)物的綜合利用與高值化也備受關(guān)注。鱘魚頭是鱘魚加工過程中的主要下腳料，在加工過程中被直接丟棄，造成了資源的浪費(fèi)，其優(yōu)質(zhì)的營養(yǎng)物質(zhì)也未被開發(fā)利用。

作為一種基本的微量營養(yǎng)元素，硒在人體中起著至關(guān)重要的作用。硒可以抑制多種致癌因子，從而起到輔助防癌抗癌作用，被稱為“抗癌之王”。硒在我國分布十分不均衡，大約有22個(gè)省、72%的縣處于缺硒或低硒狀態(tài)［7］。人體缺硒會導(dǎo)致40余種疾病，如糖尿病、腎病、腫瘤、癌變、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、白內(nèi)障、貧血等［8］，還會導(dǎo)致克山病、大骨節(jié)病等地方性疾?。?］，孕婦缺硒還會導(dǎo)致胎兒發(fā)育受損［10］。適量補(bǔ)硒可以顯著減少癌癥和其他多種疾病的發(fā)生率。目前國內(nèi)外關(guān)于蛋白肽與Fe、Zn、Ca等礦物質(zhì)離子制備礦物質(zhì)螯合肽的研究較多，但關(guān)于硒螯合肽的研究較少，因此還有極大的空間可以探求。以鱘魚頭為原料制備肽硒螯合物，研究其體外模擬消化過程中的結(jié)構(gòu)變化和抗氧化活性，在充分利用海洋下腳料資源的同時(shí)，可為開發(fā)食源性硒補(bǔ)充劑及抗氧化肽提供了新的思路。

1材料與方法

1.1原料與試劑

鱘魚頭，衢州鱘龍水產(chǎn)食品科技開發(fā)有限公司。

胃蛋白酶，美國Sigma公司；人工唾液消化液，上海源葉股份有限公司；維生素E類似物（Trolox），北京百奧萊博科技有限公司；亞硒酸鈉、鹽酸、碳酸二氫鈉、碳酸氫二鈉、水楊酸、硫酸亞鐵、H2O2、DPPH、ABTS等試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

SP1702紫外可見光譜儀，美國Perkin Elmer股份有限公司；Spectrum 10傅里葉變換紅外光譜儀，美國Perkin Elmer有限公司；J1500圓二色譜儀，JASCO日本分光公司；ZS90激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司。

1.3鱘魚頭硒螯合肽的制備

根據(jù)宮民等［11］的研究方法提取得到鱘魚頭蛋白，并利用胃蛋白酶在37 ℃、pH 2的條件下酶解120 min，制備得到鱘魚頭蛋白水解產(chǎn)物。隨后將0.5 mol/L亞硒酸鈉溶液和3%（W/V）鱘魚頭蛋白水解液以體積比1∶2充分混勻，以制備鱘魚頭硒螯合肽，調(diào)節(jié)pH至90。隨后在80 ℃水浴中反應(yīng)1 h，冷卻至室溫，離心后取上清液并加入上清液體積5倍的95%乙醇溶液，混合均勻后靜置沉淀12 h，離心后收集沉淀。最后用少量無水乙醇洗滌沉淀，以除去未結(jié)合上的硒，將沉淀凍干后得到鱘魚頭硒螯合肽，備用。

1.4鱘魚頭硒螯合肽的口腔胃腸模擬消化

口腔胃腸模擬消化方法參考金子琪等［12］的研究方法，配制模擬消化液。首先取20 mg樣品溶于20 mL蒸餾水中，放入37 ℃水浴中預(yù)熱，接著與20 mL人工唾液混合，調(diào)節(jié)pH至6.8，在37 ℃ 100 r/min下恒溫振蕩10 min，以模擬口腔消化。將口腔消化后得到的產(chǎn)物用1 mol/L HCl將pH調(diào)節(jié)至2.0，添加3.75 μL模擬胃消化液，消化90 min以模擬胃消化過程。繼續(xù)用1 mol/L? NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7.5，加入13.125 μL模擬腸消化液，消化120 min以模擬腸消化過程。

1.5紫外可見吸收光譜測定

將凍干后的鱘魚頭蛋白肽和鱘魚頭硒螯合肽分別溶解在濃度為0.1 mg/mL去離子水中。用紫外可見分光光度計(jì)記錄鱘魚頭蛋白肽和鱘魚頭硒螯合肽在200～800 nm波長范圍內(nèi)的紫外可見光譜。

1.6圓二色譜測定

將1 mg/mL鱘魚頭蛋白肽和鱘魚頭硒螯合肽分別放置于光程為0.1 cm的石英試管中，使用Jasco J1500圓二色光譜儀在190～260 nm波長下以1 nm/s速度重復(fù)掃描3次。掃描溫度為（25±0.2） ℃。

1.7粒徑測定

將鱘魚頭蛋白肽和鱘魚頭硒螯合肽溶于去離子水中，配制成1 mg/mL溶液，利用激光粒度儀進(jìn)行測量。

1.8體外抗氧化活性研究

1.8.1

ABTS自由基清除活性測定。

根據(jù)Ketnawa等［1314］的方法，將 ABTS水溶液（7 mmol/L）和過硫酸鉀溶液（140 mmol/L）以1∶1的比例混合并搖勻，在室溫下避光反應(yīng)12～16 h形成ABTS自由基溶液，用PBS緩沖液（0.2 mol/L，pH 7.4）稀釋，使其在734 nm處的吸光值為0.70±0.02。將樣液與ABTS自由基溶液混合后于30 ℃下避光反應(yīng)6 min，反應(yīng)結(jié)束后在734 nm處測定吸光值，以As表示，用蒸餾水替代稀釋后的樣品溶液作為空白組，其吸光值以A0表示。按以下公式計(jì)算ABTS自由基清除活性：ABTS自由基清除率=［（A0As）/A0］×100%。配制0、1、2、3、4、5 mmol/L濃度梯度的Trolox代替樣液，重復(fù)上述樣品測定操作繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表示為mol TEAC/100 g DW。

1.8.2DPPH自由基清除活性測定。

根據(jù)章銀良等［15］的方法，取1 mL樣品溶液和3 mL DPPH（0.04 mg/mL）溶液于5 mL的EP管中，混合均勻后室溫下避光反應(yīng)30 min，用酶標(biāo)儀在517 nm處測定吸光度，記為As。以相同的方法取1 mL蒸餾水代替稀釋后的樣品溶液作為空白組，測得的吸光度記為A0。按以下公式計(jì)算DPPH自由基清除率：DPPH自由基清除率=［（A0As）/ A0］×100%。按照上述樣品反應(yīng)步驟，配制0、1、2、3、4、5 mmol/L濃度梯度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。最終結(jié)果以mmol TEAC/100 g DW表示。

1.8.3

OH自由基清除活性測定。

根據(jù)馬勇等［16］的方法，在2 mL EP管中依次加入100 μL FeSO4溶液（9 mmol/L）、100 μL乙醇水楊酸溶液（9 mmol/L），接著加入1 mL樣液，最后加入100 μL H2O2（8.8 mmol/L），混合搖勻后于37 ℃干浴器內(nèi)避光反應(yīng)15 min。反應(yīng)結(jié)束后用酶標(biāo)儀測定其在510 nm處的吸光度，記為As，以相同的方法取1 mL蒸餾水代替稀釋后的樣品溶液作為空白組，在510 nm處測定其吸光度，記為A0。按以下公式計(jì)算OH自由基清除率：OH自由基清除率=［（A0As）/A0］×100%。按照上述樣品反應(yīng)步驟，配制0、1、2、3、4、5 mmol/L濃度梯度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述樣品反應(yīng)步驟制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表示為mmol TEAC/100 g DW。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

所有試驗(yàn)結(jié)果均以3個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示，并用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（SPSS Inc，Chicago，IL）進(jìn)行單因素方差分析（Oneway AVOVA）。不同的標(biāo)記字母表示數(shù)據(jù)間存在顯著差異（P<0.05）。

2結(jié)果與討論

2.1口腔胃腸模擬消化中的紫外可見吸收光譜變化

可通過紫外可見吸收光譜的變化推測蛋白質(zhì)、多肽等物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)變化，其含有的生色團(tuán)的紫外吸收可反映蛋白質(zhì)和多肽等的構(gòu)象變化。從圖1可以看出，鱘魚頭蛋白肽在模擬消化過程中變化浮動較大，在經(jīng)口、胃、腸消化后，紫外吸收峰從255 nm移動到295 nm，表明其在消化過程中樣品發(fā)生了取代作用，導(dǎo)致氨基酸結(jié)構(gòu)被破壞，從而引起特征峰的移動。與鱘魚頭蛋白肽相比，鱘魚頭硒螯合肽在模擬消化過程中的吸收峰幾乎沒有發(fā)生變化，只是隨著消化時(shí)間的增加，吸收強(qiáng)度增大，吸收峰強(qiáng)度變化說明樣品在胃腸道消化過程中由于分子或原子之間的相互作用，發(fā)生了電子躍遷和能量級的變化［17］。這表明在模擬口腔胃腸消化過程中鱘魚頭硒螯合肽的結(jié)構(gòu)比鱘魚頭蛋白肽更加穩(wěn)定。

2.2口腔胃腸模擬消化中的二級結(jié)構(gòu)變化

從圖2A可以發(fā)現(xiàn)，消化前，鱘魚頭蛋白肽在202 nm附近處有一個(gè)負(fù)峰，經(jīng)胃、口、腸消化后分別移動至204、205和203 nm處，與未消化相比，消化結(jié)束后的峰值強(qiáng)度降低。結(jié)合圖2B可知，消化結(jié)束后鱘魚頭蛋白肽α螺旋和β轉(zhuǎn)角的相對含量降低，β折疊相對含量明顯增加。α螺旋和β轉(zhuǎn)角含量的降低表明氨基酸殘基中的氫鍵被破壞。β折疊相對含量的增加主要是由于H與C=O形成了新的氫鍵。從圖2C可以發(fā)現(xiàn)，鱘魚頭硒螯合肽口、胃、腸消化時(shí)，吸收峰強(qiáng)度顯著降低，且在消化過程中的圓二色譜圖波動較大，推測可能是由于鱘魚頭硒螯合肽經(jīng)口、胃、腸消化時(shí)，唾液淀粉酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解作用以及pH環(huán)境的變化影響了鱘魚頭蛋白肽與硒的結(jié)合，破壞了其二級結(jié)構(gòu)［18］，從而對鱘魚頭硒螯合肽的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性產(chǎn)生了影響。具體來說，主要表現(xiàn)在α螺旋和β轉(zhuǎn)角相對含量先降低后升高，無規(guī)卷曲含量先升高后降低（圖2D），這可能是由于在消化過程中蛋白質(zhì)分子部分展開，導(dǎo)致其二級結(jié)構(gòu)含量的變化［19］，這也表明鱘魚頭硒螯合肽在腸消化環(huán)境中具有比胃消化環(huán)境更高的穩(wěn)定性。

從圖3可見，鱘魚頭蛋白肽和鱘魚頭硒螯合肽在模擬口腔胃腸消化過程中的粒徑均呈減小的趨勢。消化前鱘魚頭蛋白肽和鱘魚頭硒螯合肽的粒徑大小分別為565.5和169.8 nm，經(jīng)口腔消化后分別減小至553.2和167.2 nm，減小了12.3和2.6 nm，這主要是模擬口腔消化液中的唾液淀粉酶的降解作用。進(jìn)入胃消化階段，鱘魚頭蛋白肽和鱘魚頭硒螯合肽的粒徑分別減小到548.6和166.5 nm，與模擬口腔消化后的粒徑相比顯著降低（P<0.05）。在腸消化階段，鱘魚頭蛋白肽和鱘魚頭硒螯合肽的粒徑進(jìn)一步減小，分別為489.4和158.8 nm。其可能的原因是在經(jīng)口腔胃腸模擬消化時(shí)，模擬消化液中胃消化液中的胃蛋白酶及腸消化液中的胰蛋白酶和膽汁鹽等消化酶對鱘魚頭蛋白肽和鱘魚頭硒螯合肽的酶切降解，促進(jìn)鱘魚頭蛋白肽和鱘魚頭硒螯合肽在模擬消化過程中的分解，從而減小了其顆粒大?。?0］。同時(shí)，鱘魚頭硒螯合肽在口腔胃腸消化過程中的顆粒大小顯著低于鱘魚頭蛋白肽（P<0.05），推測鱘魚頭硒螯合肽可能更易被消化吸收。

2.4ABTS自由基清除活性

鱘魚頭蛋白肽和鱘魚頭硒螯合肽在模擬口腔胃腸消化過程中，ABTS自由基清除活性變化如圖4所示。從圖4可見，多肽的抗氧化活性與其結(jié)構(gòu)特征有關(guān)，如疏水性、序列和氨基酸組成等［21］。口消化階段對ABTS自由基的消除能力不大，在胃消化過程中，消化產(chǎn)物對ABTS自由基的清除能力增強(qiáng)，這歸因于胃蛋白酶的酶切降解，暴露出更多的抗氧化活性位點(diǎn)，形成小分子量的肽和游離氨基酸［22］，使其與ABTS自由基反應(yīng)的機(jī)會增加，從而使抗氧化活性顯著增強(qiáng)。進(jìn)入腸消化過程，ABTS自由基的清除能力進(jìn)一步增強(qiáng)，其原因可能是經(jīng)胃蛋白酶、胰酶、胰蛋白酶和膽汁酸等消化酶的酶切降解［23］，樣品中具有抗氧化活性的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等）的數(shù)量［24］在腸模擬消化增多所導(dǎo)致［25］。

2.5OH自由基清除活性

鱘魚頭蛋白肽和鱘魚頭硒螯合肽在模擬口腔胃腸消化過程中OH自由基清除活性變化如圖5所示。從圖5可以發(fā)現(xiàn)，口消化階段，OH自由基清除活性不大。進(jìn)入胃消化階段，消化產(chǎn)物與OH自由基能更好地接觸反應(yīng)，促使多肽原有活性顯著增強(qiáng)。腸消化結(jié)束后OH自由基清除活性進(jìn)一步增強(qiáng)，可能是由樣品消化液中具有抗氧化活性的氨基酸數(shù)量在消化過程中增多所導(dǎo)致［26］。作為口腔胃腸消化過程中的產(chǎn)物易受其結(jié)構(gòu)特征和生物活性變化的影響改變，如消化酶和腸道菌群等的改變也會導(dǎo)致蛋白質(zhì)和多肽的降解［27］，進(jìn)一步生成小肽（二肽或三肽）和抗氧化活性較強(qiáng)的游離氨基酸，使其抗氧化活性增強(qiáng)。

2.6DPPH自由基清除活性

在模擬口腔胃腸消化過程中，鱘魚頭蛋白肽和鱘魚頭硒螯合肽的DPPH自由基清除活性變化如圖6所示。從圖6可見，DPPH自由基清除活性在口消化過程中較低，在經(jīng)胃消化階段和腸消化階段后顯著增加。這是由于隨著胃腸模擬消化的進(jìn)行，有更多的疏水性氨基酸側(cè)鏈暴露，使得消化產(chǎn)物與DPPH自由基能夠更好地接觸反應(yīng)［28］，從而使得DPPH自由基清除率顯著增加［27］。當(dāng)進(jìn)入模擬腸道階段，DPPH自由基清除率又有所降低，其可能的原因是pH的改變影響了氨基酸生物活性的變化。

3結(jié)論

該研究通過體外模擬口腔及胃腸道消化處理過程中鱘魚頭蛋白肽和鱘魚頭硒螯合肽的結(jié)構(gòu)變化以及抗氧化活性變化，明確了體外消化處理后硒螯合肽抗氧化活性差異。結(jié)果表明，在模擬口腔胃腸消化過程中鱘魚頭硒螯合肽的結(jié)構(gòu)比鱘魚頭蛋白肽更加穩(wěn)定。體外模擬消化導(dǎo)致鱘魚頭蛋白肽和鱘魚頭硒螯合肽的圓二色譜吸收峰強(qiáng)度顯著降低。鱘魚頭蛋白肽和鱘魚頭硒螯合肽的粒徑經(jīng)口腔胃腸模擬消化后皆呈現(xiàn)減小的趨勢，且鱘魚頭硒螯合肽在口腔胃腸消化過程中的顆粒大小顯著低于鱘魚頭蛋白肽。ABTS、DPPH以及OH自由基清除活性結(jié)果顯示，在體外模擬消化后，鱘魚頭蛋白肽和鱘魚頭硒螯合肽的自由基清除活性進(jìn)一步增強(qiáng)，且鱘魚頭硒螯合肽的自由基清除能力更強(qiáng)。鱘魚頭硒螯合肽除作為有機(jī)硒營養(yǎng)補(bǔ)充劑外，還可以作為一種潛在的高效抗氧化劑，但其體內(nèi)抗氧化活性還需進(jìn)一步研究。

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基金項(xiàng)目遼寧省博士科研啟動基金計(jì)劃項(xiàng)目（2019BS017）。

作者簡介賈嬌（1995—），女，甘肅白銀人，碩士研究生，研究方向：食品加工與功能食品。*通信作者，博士，從事食品加工與功能食品研究。