紫花苜蓿CNGC基因家族成員鑒定及分析

摘要： 環(huán)核苷酸門控通道（CNGC）基因家族作為非選擇性陽離子通道基因家族之一，在植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境脅迫等生理過程中發(fā)揮著重要作用。本研究利用生物信息學(xué)手段和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)紫花苜蓿CNGC家族成員的進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、保守基序、順式作用元件、染色體定位、共線性關(guān)系以及基因表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，紫花苜蓿MsCNGC基因家族成員有16個(gè)，在染色體上不均勻分布，存在片段重復(fù)，大多數(shù)蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)膜。系統(tǒng)發(fā)育樹將MsCNGCs為4個(gè)亞家族?；蚪Y(jié)構(gòu)和保守基序分析表明，都含有cNMP/CNBD和ITP功能域。順式作用元件分析表明，MsCNGCs基因含有許多與非生物或生物脅迫和激素響應(yīng)元件。MsCNGC4和MsCNGC7.2蛋白之間存在互作。MsCNGC基因具有組織表達(dá)特異性。MsCNGC基因?qū)Ω珊?、鹽和激素等非生物脅迫均有顯著的響應(yīng)，為進(jìn)一步研究MsCNGC基因在調(diào)控非生物脅迫過程中的潛在功能提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 紫花苜蓿；CNGC基因家族；全基因組；系統(tǒng)進(jìn)化；基因結(jié)構(gòu)；非生物脅迫

中圖分類號(hào)：S512.6 """文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A """"文章編號(hào)： 1007-0435（2024）02-0588-11

Identification and Analysis of CNGC Gene Family Members in Alfalfa

LI Xiao-hong1， WANG Xiao-tong1， MA Xu-xia1， CAI Wen-qi1， FENG Xue-li1，

MA Meng-fan1， LI Shu-xia1，2，3*

（1.College of Forestry and Prataculture， Ningxia University， Yinchuan， Ningxia 750021， China; 2.Ningxia Grassland and Animal

Husbandry Engineering Technology Research Center， Yinchuan， Ningxia 750021， China; 3.Key Laboratory for Model Innovation

in Forage Production Efficiency， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Yinchuan， Ningxia 750021， China）

Abstract： The cyclic nucleotide-gated channels （CNGCs） gene family functions as one of the non-selective cation channel gene families and plays important roles in physiological processes such as plant signal transduction，growth and development，and environmental stress. In this study，we analyzed the evolutionary relationship，gene structure，conserved motifs，cis-acting elements，chromosome localization，collinearity，and gene expression patterns of the CNGC family members in alfalfa using bioinformatic tools and transcriptomic data. The results showed that there were 16 members of MsCNGC genes family in alfalfa，which were unevenly distributed on chromosomes，with segmental repeation，and most of proteins were located in the plasma membrane. The phylogenetic tree divided MsCNGCs into four subfamilies. Gene structure and conserved motif analysis showed that cNMP/CNBD and ITP functional domains were present. Cis-acting element analysis showed that MsCNGC genes contained many elements that responded to abiotic or biological stresses and hormones. There was interaction between MsCNGC4 and MsCNGC7.2 proteins. MsCNGC genes had tissue specificity. MsCNGC genes had significant response to drought，salt and hormone stress，which provided a theoretical basis for further research on the potential function of MsCNGC genes in the regulation of abiotic stress.

Key words： Alfalfa;CNGC genes family;Genome-wide;Systematic evolution;Gene structure;Abiotic stress

Ca2+作為植物中重要的次級(jí)信使，在調(diào)控植物的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長(zhǎng)發(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，如植物的光合作用、激素合成、生物脅迫和非生物脅迫等［1-4］。環(huán)核苷酸門控離子通道（CNGCs）蛋白是鈣離子傳導(dǎo)途徑之一，廣泛存在于動(dòng)植物中［5］。在植物中，大多數(shù)CNGC蛋白位于質(zhì)膜，部分位于核膜和液泡膜［6-8］。CNGC是由六個(gè)跨膜（TM）結(jié)構(gòu)域和第五、第六TM結(jié)構(gòu)域之間的一個(gè)孔隙區(qū)域（P）組成，包含CaMB結(jié)構(gòu)域和環(huán)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CNBD）［9-11］。CNBD是一個(gè)高度保守的區(qū)域，包含一個(gè)能與鈣調(diào)蛋白（Calmodulin，CaM）結(jié)合的磷酸鹽結(jié)合盒（PBC）和1個(gè)鉸鏈區(qū)［12-13］。環(huán)核苷酸單磷酸（3′，5′-cAMP和3′，5′-cGMP）和CaM可調(diào)節(jié)CNGC通道的關(guān)閉和打開［14］。這些結(jié)構(gòu)對(duì)研究CNGC提供了重要的信息。

研究表明，CNGC家族成員可參與植物的各種生理反應(yīng)，包括種子萌發(fā)、生殖發(fā)育［15］和非生物脅迫（鹽脅迫、熱脅迫）響應(yīng)等［16，17］。目前，已經(jīng)在大多數(shù)植物種鑒定出了CNGC基因，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）中鑒定出20個(gè)AtCNGCs、蒺藜苜蓿（Medicago truncatu）中19個(gè)MtCNGCs基因、赤豆（Vigna angularis）中18個(gè)VaCNGCs基因［35］。在擬南芥中，AtCNGC1作為植物發(fā)育和抗逆性的調(diào)節(jié)因子，參與Ca2+的吸收［19］。AtCNGC18在花粉中表達(dá)，AtCNGC18功能的喪失導(dǎo)致花粉管生長(zhǎng)缺陷，并導(dǎo)致雄性不育［18］。AtCNGC19和AtCNGC20在鹽脅迫下表達(dá)量顯著降低［19］。沉默IVb亞族SlCNGC基因顯著增強(qiáng)番茄（Solanum lycopersicum）對(duì)真菌病原體Pythium aphanidermatum和Solanum lycopersicum的抗性［20］。在芒果（Mangifera indica）CNGC家族成員中，MiCNGC13和MiCNGC6可通過調(diào)節(jié)MDA含量來維持細(xì)胞膜完整性，進(jìn)而積極響應(yīng)冷脅迫［21］。沉默棉花（Gossypium hirsutum）GhCNGC32和GhCNGC35基因后，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性降低［22］。CNGC基因在植物的各種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。因此，鑒定紫花苜蓿（Medicago sativa）CNGC家族成員對(duì)紫花苜蓿的抗逆性研究具有重要意義。

紫花苜蓿是一種優(yōu)質(zhì)的多年生豆科牧草，在世界范圍內(nèi)廣泛種植，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性相對(duì)較強(qiáng)，因其營(yíng)養(yǎng)含量高和適口性好而享有“牧草之王”的美譽(yù)［23，24］。然而，一些不利的生物和非生物因素嚴(yán)重制約了苜蓿生產(chǎn)，對(duì)苜蓿產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生了嚴(yán)重的負(fù)面影響，進(jìn)而影響畜牧業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。本研究利用紫花苜蓿全基因組序列信息、擬南芥CNGC家族基因研究信息及生物信息學(xué)分析技術(shù)對(duì)紫花苜蓿中的CNGC基因家族成員進(jìn)行鑒定和分析，并利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析MsCNGC基因在不同組織和非生物脅迫（冷、干旱、鹽和ABA）下的表達(dá)模式，以期為進(jìn)一步探究MsCNGC基因的功能提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 紫花苜蓿CNGC基因家族鑒定

從擬南芥數(shù)據(jù)庫（TAIR，http：//www.arabidopsis.org/）中下載擬南芥CNGC家族蛋白的氨基酸序列。紫花苜蓿（中苜一號(hào)）基因組文件下載自https：//figshare.com/articles/dataset/Medicago_sativa_genome_and_annotation_files/12623960。以擬南芥CNGC蛋白為參考序列，利用TBtools中的BLASTp比對(duì)出紫花苜蓿中CNGCs的蛋白，然后，利用cNMP/CNBD（pfam：PF00027）和ITP（pfam：PF00520）的隱馬爾可夫模型（HMM）配置文件作為查詢，對(duì)紫花苜蓿蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，利用CD-HIT（http：//weizhong-lab.ucsd.edu/cd-hit/）軟件去除冗余序列。再利用InterPro（https：//www.ebi.ac.uk/interpro）網(wǎng)站分析預(yù)測(cè)蛋白的結(jié)構(gòu)域，同時(shí)包含一個(gè)環(huán)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（cNMP/CNBD，PF00027）和一個(gè)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域（ITP，PF00520）的蛋白屬于紫花苜蓿CNGC基因家族成員，并根據(jù)基因在染色體上的位置信息重新命名MsCNGC基因。

1.2 紫花苜蓿CNGC蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

利用在線工具Prot Param（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)MsCNGC蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)、分子量、等電點(diǎn)、穩(wěn)定指數(shù)等理化性質(zhì)。利用WoLF PSORT II網(wǎng)站（https：//www.genscript.com）和SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr）預(yù)測(cè)MsCNGC蛋白成員的亞細(xì)胞定位及二級(jí)結(jié)構(gòu)。使用在線網(wǎng)站SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）分析MsCNGC蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.3 紫花苜蓿CNGC基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用軟件MEGA 11對(duì)紫花苜蓿16個(gè)MsCNGC，擬南芥20個(gè)AtCNGC，蒺藜苜蓿19個(gè)MtCNGC蛋白和赤豆18個(gè)VaCNGC蛋白共73個(gè)CNGC蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。進(jìn)化樹構(gòu)建采用最大似然法（Maximum likelihood estimate，ML），步長(zhǎng)值（bootstrap values）為1 000次，其他參數(shù)設(shè)置默認(rèn)。

1.4 紫花苜蓿CNGC基因結(jié)構(gòu)、保守基序和順式作用元件分析

通過TBtools工具對(duì)MsCNGC基因家族成員進(jìn)行內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)分析。MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）用于預(yù)測(cè)蛋白的保守基序，保守基序數(shù)為10，其他參數(shù)默認(rèn)。利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）工具分析啟動(dòng)子序列（基因上游2.0 kb）中的順式作用元件，并利用TBtools工具進(jìn)行可視化。

1.5 "紫花苜蓿CNGC基因染色體定位和共線性分析

基于紫花苜蓿全基因文件信息，使用TBtools軟件分析和定位MsCNGC基因的染色體分布。從EnsemblPlants （http：//plants.ensembl.org/index.html）網(wǎng)站分別下載擬南芥和蒺藜苜蓿全基因組序列和gff文件，利用多重共線掃描工具（MCScanX）分析紫花苜蓿與擬南芥和蒺藜苜蓿CNGC基因共線性，并通過TBtools進(jìn)行可視化。用Simple Ka/Ks Calculator（NG）計(jì)算非同義替換率（Ka），同義替換率（Ks）以及Ka/Ks比率。

1.6 MsCNGC蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)對(duì)功能未知的蛋白有著非常重要的作用。我們以模式作物擬南芥已注明功能的蛋白質(zhì)和16個(gè)MsCNGC蛋白為研究對(duì)象，通過STRING（https：//cn.string-db.org/）在線軟件對(duì)MsCNGC蛋白進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，置信度參數(shù)設(shè)為0.400，其他參數(shù)默認(rèn)。

1.7 紫花苜蓿MsCNGC基因的組織表達(dá)模式和非生物脅迫表達(dá)分析

從NCBI網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/？term）下載紫花苜蓿在不同組織、干旱、低溫、ABA以及鹽脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（SRP055547、SRR7091780～7091794，SRR7160313～7160357），獲得MsCNGC基因在不同組織和非生物脅迫下的表達(dá)模式，對(duì)每個(gè)MsCNGCs的FPKM值進(jìn)行對(duì)數(shù)歸一化，并使用TBtools工具繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花苜蓿MsCNGC基因家族成員鑒定及基本理化性質(zhì)分析

為鑒定紫花苜蓿中所有的CNGC家族成員，從TAIR網(wǎng)站上下載了擬南芥CNGC基因家族20個(gè)成員的蛋白序列作為參考序列，對(duì)紫花苜蓿全基因組進(jìn)行BLAST檢索，E小于1×10-5。同時(shí)，將cNMP/CNBD和ITP （pfam：PF00027、PF00520）的隱馬爾可夫模型（HMM）配置文件作為查詢，對(duì)紫花苜蓿蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索。去冗余后，共鑒定出16個(gè)包含CNGC功能域的基因，根據(jù)它們?cè)谌旧w上的位置被命名為 MsCNGC1-MsCNGC8.5 （表1）［36］。MsCNGC蛋白長(zhǎng)度為460 aa（MsCNGC4.2）～2 638 aa（MsCNGC3.2），對(duì)應(yīng)的蛋白分子量為52.85～295.52 kDa，理論等電點(diǎn)在5.87～9.5之間，疏水指數(shù)（GRAVY）為-0.433～0.096。MsCNGCs蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，MsCNGC蛋白的α-螺旋、β-鏈折疊、延伸鏈和無規(guī)則卷曲分別為37.66%（MsCNGC8.2）～62.17%（MsCNGC4.2），2.60%（MsCNGC8.3）～11.02%（MsCNGC8.2），延伸鏈9.17%（MsCNGC3.2）～22.70%（MsCNGC8.2），25.00%（MsCNGC4.2）～33.65%（MsCNGC8.5）。不穩(wěn)定系數(shù)預(yù)測(cè)表明，MsCNGC2.1/7.1/7.2/8.2蛋白的穩(wěn)定系數(shù)小于40，屬于穩(wěn)定蛋白，其他MsCNGCs的穩(wěn)定系數(shù)大于40，屬于不穩(wěn)定蛋白。MsCNGC3.2和MsCNGC8.1蛋白的等電點(diǎn)小于7，屬于酸性蛋白，其他14個(gè)MsCNGC蛋白等電點(diǎn)大于7，屬于堿性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明，MsCNGC4.2和MsCNGC8.1蛋白分別位于液泡和葉綠體上，其他14個(gè)MsCNGC蛋白定位于質(zhì)膜上。

2.2 紫花苜蓿MsCNGC蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)紫花苜蓿16個(gè)MsCNGC蛋白、擬南芥20個(gè)AtCNGC蛋白、蒺藜苜蓿19個(gè)MtCNGC蛋白和赤豆18個(gè)VaCNGC蛋白，共73個(gè)CNGC蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明：73個(gè)CNGCs蛋白被劃分為5個(gè)亞家族（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，ⅣA，ⅣB）（圖1）。除Ⅲ亞家族不包含MsCNGC蛋白，其他4個(gè)亞家族均包含MsCNGC成員，其中Ⅲ、ⅣA、ⅣB亞家族均包含上述4個(gè)物種的CNGC成員，表明CNGC在不同物種間的進(jìn)化關(guān)系是高度保守。第Ⅰ亞家族只包含MsCNGC2.1，MsCNGC3.2和MsCNGC5。第Ⅱ亞家族包含有MsCNGC8.4和MsCNGC8.5；第ⅣA 亞家族包含MsCNGC1，MsCNGC2.2，MsCNGC3.1， MsCNGC4.2，MsCNGC7.1和MsCNGC7.2；第ⅣB亞家族包含MsCNGC4.1，MsCNGC7.3，MsCNGC8.1，MsCNGC8.2和MsCNGC8.3。

2.3 紫花苜蓿MsCNGC基因家族保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

為進(jìn)一步探究MsCNGC基因的進(jìn)化過程，我們首先對(duì)MsCNGCs蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，MsCNGCs蛋白被劃分成3個(gè)亞家族（圖2A）。對(duì)MsCNGC基因家族成員的保守基序和基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，MsCNGC蛋白中共預(yù)測(cè)到了10個(gè)基序（Motif1～Motif10）（圖2B），其中大多數(shù)MsCNGC蛋白含有10個(gè)motif。根據(jù)紫花苜蓿與擬南芥的進(jìn)化關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)在第Ⅰ亞家族中MsCNGC3.1/7.1/7.2含有相同的motif；第Ⅱ亞家族中的MsCNGC2.2具有與第Ⅰ亞家族基因相同的motif結(jié)構(gòu)；而第Ⅲ亞家族包含的MsCNGC1和MsCNGC4.2 motif數(shù)量和種類并不相同，其中MsCNGC1比MsCNGC4.2多3個(gè)motif；第Ⅳ亞家族中的MsCNGC蛋白（MsCNGC2.1，MsCNGC3.2，MsCNGC4.1，MsCNGC5和MsCNGC8.1）包含4～7個(gè)motif，其中MsCNGC2.1、MsCNGC3.2和MsCNGC5含有4個(gè)motif，MsCNGC4.1和MsCNGC8.1含有7個(gè)motif；第Ⅴ亞家族中3個(gè)MsCNGC蛋白（MsCNGC7.3，MsCNGC8.2和MsCNGC8.3）含有8～10個(gè)motif，MsCNGC8.2不包含motif7。此外，motif2在所有成員中都存在，MsCNGC2.1，MsCNGC3.2和MsCNGC5不包含motif3和motif5。

基因結(jié)構(gòu)分析表明，MsCNGC基因內(nèi)含子/外顯子的數(shù)量分別為4～45個(gè)、5～46個(gè)不等（圖2C）。6個(gè)基因（ MsCNGC2.2，MsCNGC3.1，MsCNGC4.2，MsCNGC7.1，MsCNGC7.2和MsCNGC8.1 ）含4～5個(gè)內(nèi)含子；4個(gè)基因（ MsCNGC7.3，MsCNGC8.3，MsCNGC8.4和MsCNGC8.5 ）包含6～7內(nèi)含子；2個(gè)基因（ MsCNGC1，MsCNGC8.2 ）含有9～10個(gè)內(nèi)含子；3個(gè)基因（ MsCNGC5，MsCNGC2.1和MsCNGC3.2 ）含11～45個(gè)內(nèi)含子。特別地， MsCNGC3.2 基因含有的內(nèi)含子和外顯子數(shù)是該家族中最多的，分別是45和46個(gè)。另外，MsCNGC家族成員UTR的分布也是不均勻的，其數(shù)量在0～4個(gè)，其中6個(gè)基因（ MsCNGC3.1，MsCNGC3.2，MsCNGC4.2，MsCNGC7.3，MsCNGC8.1和MsCNGC8.3 ）的序列沒有預(yù)測(cè)到UTR區(qū)。

2.4 紫花苜蓿CNGC基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

為了進(jìn)一步了解MsCNGC家族成員順式作用元件的分布，利用PlantCARE在線工具分析順式作用元件。結(jié)果表明，16個(gè)MsCNGC基因啟動(dòng)子區(qū)共檢測(cè)到170個(gè)響應(yīng)元件，但不同基因含有的響應(yīng)元件數(shù)量和種類不盡相同。MsCNGC基因啟動(dòng)子中與植物激素相關(guān)的順式作用元件有5類，包括與脫落酸（ABA）、生長(zhǎng)激素（IAA）、茉莉酸（JA）、赤霉素（GA）和水楊酸（SA）相關(guān)的元件；參與環(huán)境刺激的順式作用元件包括3類，分別為低溫響應(yīng)、干旱和防御/應(yīng)激響應(yīng)元件；此外，還有與晝夜節(jié)律和光響應(yīng)相關(guān)的元件（圖3）。MsCNGC家族基因均含有與激素響應(yīng)元件，例如， MsCNGC2.2/7.2/8.3/8.4/8.5 包含生長(zhǎng)素響應(yīng)（TGA-element）元件； MsCNGC2.1/3.1/4.1/5/7.2/7.3/8.1 基因包含參與水楊酸響應(yīng)（TCA-element）元件； MsCNGC2.1/4.1/4.2/5/7.1/7.2/7.3/8.1/8.2 基因包含參與脫落酸（ABRE）作用元件；MsCNGC7.2/8.3/8.4/8.5基因包含參與赤霉素響應(yīng)（Pbox、TATC-box）的順式作用元件； "MsCNGC1/2.2/3.1/3.2/5/7.2/8.1/8.2/8.3/8.4/8.5 包含參與茉莉酸響應(yīng)（TGACG-motif）元件。脅迫響應(yīng)元件也廣泛存在于MsCNGC基因家族中，例如， MsCNGC2.2、MsCNGC4.1、MsCNGC4.2和MsCNGC7.3 基因含有干旱響應(yīng)（MBS）元件； MsCNGC1/2.2/3.2/8.5 基因包含參與防御和應(yīng)激反應(yīng)（TC-rich repeats）元件； MsCNGC1/3.2/4.1/5/7.3/8.1/8.4 包含光響應(yīng)（G-box、I-box）元件， MsCNGC2.1/7.2/8.3 包含低溫響應(yīng)（LTR）元件。此外， MsCNGC1/3.1/4.2/7.2/8.1 還包含參與晝夜節(jié)律調(diào)控相關(guān)（Circadian）作用元件（圖3）。

2.5 紫花苜蓿MsCNGC基因染色體定位、基因重復(fù)及共線性分析

對(duì)紫花苜蓿CNGC家族基因進(jìn)行染色體定位分析發(fā)現(xiàn)，16個(gè)MsCNGCs基因不均勻的分布在chr1、chr2、chr3、chr4、chr5、chr7和chr8上（圖4A）。其中，chr1和chr5上各包含1個(gè)MsCNGC基因，chr2、chr3和chr4上各包含2個(gè)MsCNGCs基因，chr7上各包含3個(gè)MsCNGCs基因，chr8上各包含5個(gè)MsCNGCs基因。共線性分析表明：紫花苜蓿CNGC家族內(nèi)的 MsCNGC1/MsCNGC4.2，MsCNGC7.3/MsCNGC8.2 之間存在共線性關(guān)系（圖4A），屬于節(jié)段重復(fù)，Ka/Ks小于1，說明他們之間在進(jìn)化過程中經(jīng)歷了純化選擇（表2）。進(jìn)一步分析紫花苜蓿與擬南芥和蒺藜苜蓿之間CNGC基因的共線性發(fā)現(xiàn)，不同物種間也存在共線性關(guān)系，但紫花苜蓿與蒺藜苜蓿之間在相同染色體上的共線性較多，說明紫花苜蓿與蒺藜苜蓿都是豆科植物，所以其親緣性更高（圖5B）。

2.6 MsCNGC蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)分析

為了提供更多關(guān)于MsCNGC功能的線索，我們利用STRING在線軟件基于擬南芥CNGC蛋白的相互作用預(yù)測(cè)了該家族成員的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖5）。MsCNGC蛋白中有6個(gè)CNGC蛋白存在互作現(xiàn)象。其中MsCNGC7.2與MsCNGC4之間存在蛋白互作，其他MsCNGC蛋白之間不存在互作現(xiàn)象。MsCNGC2.1和MsCNGC5共有的互作蛋白有鈣調(diào)蛋白（Calcineurin B-like 1，CBL1、Calcineurin B-like 4，CBL4）、與CBL蛋白相互作用的植物激酶（CBL-Interacting Protein Kinase 24，CIPK24）、鈉/氫交換蛋白（Na+/H+ Exchanger 7，NHX7）和參與真核生物前轉(zhuǎn)錄RNA剪接和RNA延伸的蛋白質(zhì)（Pre-tRNA Splicing Factor and RNA Elongation Factor，POT5）。MsCNGC2.1還與CBL蛋白相互作用的植物激酶（CBL-Interacting Protein Kinase 6，CIPK6）和氫離子ATP酶（Arabidopsis thaliana H±ATPase 1，AHA1）這2個(gè)蛋白之間存在互作。MsCNGC2.2與植物受體樣激酶（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 stress kinase receptor 1，PSKR1）和氫離子ATP酶（Arabidopsis thaliana H±ATPase 1，AHA1）之間存在互作。MsCNGC8.3只和參與真核生物前轉(zhuǎn)錄RNA剪接和RNA延伸的蛋白質(zhì)（Pre-tRNA Splicing Factor and RNA Elongation Factor，POT5）互作。MsCNGC5還與CBL蛋白相互作用的植物激酶（CBL-Interacting Protein Kinase 10，CIPK10）之間存在互作。此外，MsCNGC7.2與鈣依賴性蛋白激酶（Calcium-dependent protein kinase 32，CPK32）存在互作。

2.7 紫花苜蓿MsCNGC基因在不同組織中的表達(dá)模式分析

分析了MsCNGC基因在紫花苜蓿不同組織中的表達(dá)模式，MsCNGC基因具有組織表達(dá)特異性（圖6）。 MsCNGC4.1和MsCNGC8.1在各個(gè)組織中都具有相同的表達(dá)水平。MsCNGC1在根瘤組織中不表達(dá)；MsCNGC7.2在花組織中不表達(dá)；MsCNGC8.4在根組織中不表達(dá)；MsCNGC4.2和MsCNGC5的表達(dá)模式相似，只在花中表達(dá)；MsCNGC3.1僅在葉中表達(dá)；MsCNGC8.5主要在伸長(zhǎng)莖中表達(dá)；MsCNGC8.2基因在伸長(zhǎng)莖和短莖組織中均有較高的表達(dá)水平，尤其在伸長(zhǎng)莖中表達(dá)量最高；MsCNGC7.1在根瘤和根中高表達(dá)；MsCNGC2.1和MsCNGC8.4 在地上組織中的表達(dá)量 要顯著的高于地下組織，表明MsCNGCs基因在調(diào)節(jié)紫花苜蓿生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮不同的作用。

2.8 紫花苜蓿MsCNGC基因在非生物脅迫下的表達(dá)模式分析

為進(jìn)一步研究MsCNGC基因家族對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)，利用紫花苜蓿轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析了MsCNGCs基因在低溫、鹽、干旱和ABA處理下的表達(dá)模式（圖7）。在低溫處理下， MsCNGC2.2、MsCNGC5、MsCNGC8.4、MsCNGC8.5 的表達(dá)量在2 h后與0 h相比明顯上調(diào)（圖7A）； MsCNGC7.1和MsCNGC7.2 的表達(dá)趨勢(shì)一致。在鹽處理下，MsCNGCs基因的表達(dá)量隨著鹽處理時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)出不同程度的下調(diào)現(xiàn)象，如 MsCNGC2.2和MsCNGC5 的表達(dá)量顯著降低（圖7B）。在干旱處理下，隨著處理時(shí)間的增加， MsCNGC3.2、MsCNGC5和MsCNGC8.5 基因的表達(dá)量不斷升高（圖7C）。在ABA處理下， MsCNGC2.2 的表達(dá)量隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而降低； MsCNGC5 在3 h表達(dá)量明顯下調(diào)，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)又逐漸升高； MsCNGC4.2、MsCNGC8.4和MsCNGC8.5 在ABA處理下表達(dá)趨勢(shì)相似，在處理1 h后表達(dá)量顯著下調(diào)。 MsCNGC1和MsCNGC3.1 在ABA處理下的表達(dá)量不變（圖7D）。

3 討論

紫花苜蓿作為最重要的豆科牧草之一，是畜牧業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，因此，研究紫花苜蓿對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)是至關(guān)重要的。CNGC作為一種非選擇性的陽離子通道，對(duì)Ca2+和K+具有滲透性，并已被證實(shí)參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)各種環(huán)境脅迫的響應(yīng)［24］。本研究利用生物信息學(xué)方法從在紫花苜蓿全基因組中初步鑒定到了16個(gè)CNGC基因，而擬南芥和玉米中分別有20，12個(gè)CNGC基因，與MsCNGC基因的數(shù)量不同，說明在不同物種間CNGC基因的數(shù)量存在差異。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析表明，大多數(shù)MsCNGC蛋白定位于細(xì)胞膜，與擬南芥CNGC基因的亞細(xì)胞定位相似［10］，推測(cè)CNGC蛋白主要在細(xì)胞膜上發(fā)揮功能。物種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系是生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。紫花苜蓿和擬南芥中CNGC蛋白的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿和擬南芥的CNGC蛋白被劃分為4個(gè)亞家族（圖1），并且在第Ⅱ和第Ⅳ亞家族中紫花苜蓿與蒺藜苜蓿的CNGC蛋白被劃分到同一分支，表明紫花苜蓿和蒺藜苜蓿有較高的親緣性。

基因的功能域是調(diào)控順式作用元件活性和基因表達(dá)的重要因素。擬南芥［10］、玉米［27］、小麥［29］的CNGC蛋白都含有典型的cNMP/CNBD和ITP功能域，能促進(jìn)陽離子運(yùn)輸［25］。而MsCNGC蛋白成員也含有典型的cNMP/CNBD和ITP功能域，表明MsCNGC蛋白可能也具有運(yùn)輸陽離子功能。外顯子和內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)影響基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)的功能，意味著外顯子和內(nèi)含子使基因在生物體中發(fā)揮重要作用，從而維持生命［26］。內(nèi)含子和外顯子分析發(fā)現(xiàn)，MsCNGC基因家族成員的內(nèi)含子數(shù)目分別是4～45不等。雖然部分基因外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)相似，但序列長(zhǎng)度不同（圖2），這與其他植物的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)相似，如玉米［27］、水稻［28］、小麥［29］等，說明CNGC家族基因的結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜。基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的順式作用元件在基因表達(dá)調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用，基因啟動(dòng)子中不同類型的順式作用元件預(yù)示著該基因在應(yīng)對(duì)不同脅迫時(shí)可能具有不同的功能［30］。對(duì)啟動(dòng)子順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，MsCNGCs的啟動(dòng)子中包含大量的植物激素（ABA，IAA，JA，GA）響應(yīng)元件、光響應(yīng)元件和脅迫（光照，低溫，干旱）響應(yīng)元件（圖3），表明MsCNGC基因可能參與調(diào)控脅迫響應(yīng)及植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如， MsCNGC2.2，MsCNGC4.1，MsCNGC4.2和MsCNGC7.3 基因含有干旱響應(yīng)（MBS）元件，表明它們可能在干旱脅迫下具有活性。 MsCNGC7.2和MsCNGC8.3 基因具有多個(gè)激素應(yīng)答元件，它們可能在植物的激素應(yīng)答和各種生理代謝過程的調(diào)控中發(fā)揮作用。

MsCNGC基因分布在紫花苜蓿的7條染色體上，第6號(hào)染色體上沒有MsCNGC基因，因此，MsCNGC的分布是不均勻，與玉米、水稻CNGC基因在染色體上的分布相似［26，28］?；驈?fù)制是基因組進(jìn)化和物種遺傳最重要的驅(qū)動(dòng)力之一［31］。植物中基因家族擴(kuò)增的兩個(gè)主要原因是節(jié)段重復(fù)和串聯(lián)重復(fù)?；驈?fù)制不僅可以為基因家族增加新成員，還可以豐富基因家族的功能，極大地促進(jìn)了各種生物的遺傳進(jìn)化［32］。在本研究中，MsCNGC基因家族中存在2對(duì)節(jié)段重復(fù)事件（ MsCNGC1/MsCNGC4.2，MsCNGC7.3/MsCNGC8.2 ）（圖4A），表明他們可能在功能上具有相似性。MsCNGCs基因與蒺藜苜蓿之間存在共線性關(guān)系，可能由于其是同科植物和親緣關(guān)系較近，也表明它們可能具有相似的功能，這需要進(jìn)一步的研究。MsCNGC與擬南芥存在共線性，為預(yù)測(cè)MsCNGC基因的表達(dá)和蛋白的功能提供了依據(jù)。進(jìn)一步蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，MsCNGC4與MsCNGC7.2之間存在蛋白互作，同時(shí)MsCNGC蛋白還與CBL，CIPK，NHX7，POT5和CPK32蛋白之間存在互作關(guān)系。這些結(jié)果為深入研究MsCNGC蛋白的潛在功能提拱了依據(jù)。組織表達(dá)分析表明，第ⅣB亞家族中 MsCNGC4.1和MsCNGC8.1 的組織表達(dá)一致，可能與它們的親緣性較高有關(guān)（圖1）。MsCNGC基因具有組織表達(dá)特異性，例如， MsCNGC4.2和MsCNGC5基因只在花中表達(dá)，MsCNGC3.1 基因只在葉中表達(dá)，說明MsCNGCs在各個(gè)組織中發(fā)揮著不同的作用。類似的，ZmCNGC5在玉米花粉中的特異性表達(dá)高于其他組織， ZmCNGC10、ZmCNGC11和ZmCNGC12 在玉米胚中的表達(dá)量都相對(duì)較高［27］，說明這些基因在玉米的花粉和胚的生長(zhǎng)發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用。

CNGC家族基因參與了非生物脅迫響應(yīng)過程［13，16，21］。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明，大多數(shù)MsCNGC基因在冷、鹽、干旱和ABA脅迫下表達(dá)量下降，有少數(shù)MsCNGC基因的表達(dá)量上升。如 MsCNGC2.2、MsCNGC5、MsCNGC8.4、MsCNGC8.5 受冷脅迫誘導(dǎo)下在2 h顯著上調(diào)表達(dá)，該結(jié)果與 RcCNGC14 和部分油菜籽CNGCs在冷誘導(dǎo)下的表達(dá)模式相同［13］；第Ⅲ亞家族中 MsCNGC7.1和MsCNGC7.2 在冷脅迫誘導(dǎo)下的表達(dá)水平一致，這與它們可能在進(jìn)化關(guān)系上的親緣性較高有關(guān)（圖2A）。在鹽處理下 MsCNGC2.2與擬南芥中的AtCNGC19和AtCNGC20 的表達(dá)水平類似［19］，它們可能參與了植物對(duì)鹽脅迫時(shí)的生理調(diào)控。 MsCNGC5、MsCNGC8.5與PtrCNGC15.2、PtrCNGC15.3 在干旱脅迫下的表達(dá)相似［12］。研究發(fā)現(xiàn)沉默 SlCNGC15 基因的表達(dá)可提高番茄耐旱性，為進(jìn)一步研究MsCNGC基因在非生物脅迫下的功能提供依據(jù)［33-35］。

4 結(jié)論

本研究對(duì)紫花苜蓿的CNGC家族成員進(jìn)行了鑒定分析，從紫花苜蓿參考基因組中共鑒定出16個(gè)MsCNGC基因，并對(duì)其蛋白分子特征、進(jìn)化關(guān)系、保守基序、基因結(jié)構(gòu)、重復(fù)事件、共線性關(guān)系、順式作用元件和表達(dá)模式進(jìn)行了研究。MsCNGC基因被劃分為4個(gè)亞家族，所有成員均含有cNMP/CNBD和ITP功能域。MsCNGC基因家族內(nèi)存節(jié)段重復(fù)事件，紫花苜蓿與蒺藜苜蓿和擬南芥之間存在物種間共線性關(guān)系。MsCNGC基因的啟動(dòng)子區(qū)含有大量與非生物應(yīng)激和激素響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件。MsCNGC基因具有組織表達(dá)特異性。MsCNGC基因參與調(diào)控紫花苜蓿的冷、干旱、鹽和ABA等非生物脅迫響應(yīng)過程，其中， MsCNGC3.2，MsCNGC5和MsCNGC8.5 能是調(diào)控紫花苜蓿耐干旱的關(guān)鍵差異基因。

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（責(zé)任編輯 彭露茜）

收稿日期：2023-09-26；修回日期：2023-11-16

基金項(xiàng)目： "國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32101426）；寧夏自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2023AAC05019）資助

作者簡(jiǎn)介：

李小紅（1996-），男，回族，寧夏固原人，碩士研究生，主要從事牧草抗逆育種研究，E-mail：lxh0895@163.com；*通信作者Corresponding author，E-mail：lishuxia620@163.com