木豆小葉突變體的表型鑒定及遺傳分析

摘要： "葉片是植物體與周圍環(huán)境之間進行物質交流與能量轉化的主要器官，對植株的生長發(fā)育起著關鍵的作用。本研究對前期航空誘變獲得的木豆（Cajanus cajan）小葉突變體進行了表型鑒定。結果表明：其葉寬、葉長、葉面積與野生型相比均顯著變小（Plt;0.01），而葉片長寬比顯著變大（Plt;0.01）。通過對小葉突變體和野生型‘ICPL81-3’雜交構建的F2群體進行表型觀察發(fā)現，不同單株的葉寬、葉長、長寬比和葉面積在F2群體中均有較大變異，且顯著相關，其中葉寬和葉面積呈現明顯雙峰分布，葉寬表型符合3∶1分離（X2lt;X20.05，1=3.84），表明小葉突變性狀受隱性單基因控制。利用SSR標記和InDel標記結合混池分離群體分析法（Bulk segregation analysis，BSA）進行小葉基因初定位，獲得在兩個基因池內具有明顯差異的1個InDel標記PA094，經基因池各單株檢測和F2群體單株檢驗，證實PA094和小葉突變性狀具有穩(wěn)定的連鎖關系。研究結果為后續(xù)開展木豆小葉基因的精細定位及其基因克隆提供了重要基礎。

關鍵詞： 木豆；小葉突變體；表型鑒定；遺傳分析；基因定位

中圖分類號：Q311 """文獻標識碼：A """"文章編號： 1007-0435（2024）02-0436-08

Phenotypic Identification and Genetic Analysis of Smaller-Leaves

Mutant in Pigeonpea（Cajanus cajan）

WANG Shang-zhi1，2， LUO Xiao-yan2， WANG Wen-qiang2， YE Yu-xiu3，

LI Xue-feng1*， DING Xi-peng2*

（1. College of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan Province 570228， China; 2. Tropical

Crops Germplasm Research Institute， CATAS， Haikou， Hainan Province 571101， China; 3. Hainan Yitian biotechnology

limited liability company， Haikou， Hainan Province 570288， China）

Abstract： "Leaves are the main organs for material communication and energy conversion between plant bodies and the surrounding environment，and play a key role in plant growth and development. In this study，the phenotypic identification of pigeonpea smaller-leaves mutants （SLM） obtained by aero mutagenesis showed that their leaf width，leaf length and leaf area were significantly smaller than those of wild type （Plt;0.01），while the leaf length-to-width ratio was significantly larger （Plt;0.01）. Through phenotypic observation of the F2 population constructed by hybridization of SLM and wild type ‘ICPL81-3’，it was found that the leaf width，leaf length，length to width ratio and leaf area of different single plants varied greatly and were significantly correlated in the F2 population，among which leaf width and leaf area showed obvious bimodal distribution，and the leaf width phenotype conformed to 3∶1 separation （X2lt;X20.05，1=3.84），indicating that the smaller leaves trait is controlled by a recessive single gene. SSR marker and InDel marker combined with bulk segregation analysis （BSA） were used for smaller leaves initial gene mapping，and one InDel marker PA094 with obvious differences in the two gene pools was screened，and the detection of each single plants of the gene pools and the F2 population confirmed that PA094 and the smaller-leaves trait had a stable linkage relationship. The results provide a basis for the subsequent fine mapping of and cloning of the smaller-leaves gene.

Key words： Pigeonpea;Smaller leaves mutant;Phenotypic identification;Genetic analysis;Gene mapping

葉片是植物體與周圍環(huán)境之間進行物質交流與能量轉化的主要器官，是進行光合作用的主要場所，且與植株的形態(tài)建成緊密相關，對植株的生長發(fā)育起著關鍵的作用［1］。葉片形態(tài)包括形狀和大小兩方面，是植物形態(tài)建成的一部分，直接決定植物的長勢和農業(yè)產量［2］。葉片發(fā)育過程受到多種內外因素的調控，涉及到細胞增殖、分化和特化等多個階段［3］。激素作為植物生長和發(fā)育的重要調節(jié)因子，對葉片發(fā)育有著重要的影響，如赤霉素能夠促進幼葉生長和葉片大小的調節(jié)［4］，而細胞分裂素則參與葉片的形成和細胞分裂［5］。 隨著對植物葉片發(fā)育研究的深入，許多相關的調控及功能基因被挖掘，如TCP家族轉錄因子可以控制葉片的形態(tài)和大小，同時還可以調控葉片的分界線形成［6］，YABBY家族轉錄因子也參與了葉片邊緣發(fā)育的調控［7］。同時，miRNA在植物葉片發(fā)育中也扮演著重要的角色［8］，如miR156可以通過抑制SPL基因家族的表達，控制葉片的形態(tài)和大?。?］，而miR319則可以調控葉片的邊緣發(fā)育［10］。研究植物葉片發(fā)育調控分子機制，對植物育種和生產具有重要意義。

木豆（Cajanus cajan）為豆科一年或多年生灌木，原產于印度和非洲地區(qū)［11］，是世界第六大食用豆類［12］，同時也是唯一的木本食用豆類［13］，為熱帶和亞熱帶地區(qū)重要的蛋白來源。木豆嫩莖葉粗蛋白含量高（20%左右），適口性好，消化率可達60%～80%，是我國南方及世界熱區(qū)極具發(fā)展?jié)摿Φ膬?yōu)異灌木類豆科牧草［14］。此外，據研究木豆莖葉具有降血脂、降血壓、抗股骨頭壞死等多種藥理作用［15］，可用于治療高血壓、糖尿病、心腦血管疾病等多種疾?。?6］。因此，開展木豆葉片形成機理的研究，對培育高產優(yōu)質的木豆新品種具有重要意義。

混地分離群體分析法（Bulk segregation analysis，BSA），是快速定位目標性狀基因的有效方法［17-18］。目前，基于BSA定位的方法挖掘新基因在植物農藝性狀基因定位研究領域中的應用日益廣泛，如周世奇等［19］利用BSA法定位到一個控制煙草（Nicotiana tabacum L.）突變體葉形的候選基因 nc89m ，并確定了一個與葉形性狀連鎖的SSR標記PT60795。王曉娟等［20］采用BSA方法篩選到與突變位點緊密連鎖的3個SSR標記，并將控制葉夾角的突變位點定位在玉米（Zea mays L.）第1染色體上。然而，在國內外關于木豆葉片形態(tài)和大小相關基因定位的研究尚無報道。故本研究利用前期航空誘變獲得的小葉突變體及通過雜交構建的F2分離群體，對其進行表型鑒定和遺傳分析，并在此基礎上利用SSR標記和InDel標記結合BSA法進行基因初步定位，篩選與木豆小葉突變基因穩(wěn)定連鎖的分子標記，通過基因池各單株和F2群體單株驗證其連鎖關系。本研究結果為后續(xù)進行木豆小葉突變基因的精細定位及其基因克隆奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用材料包括從海南瓊中收集的‘瓊中木豆’、以‘瓊中木豆’為親本經航空誘變獲得的小葉突變體及后代、印度引進的木豆資源‘ICPL81-3’、及以‘ICPL81-3’為母本和小葉突變體雜交構建的F2分離群體。

1.2 性狀考察

試驗地選擇在海南省儋州中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所牧草中心基地進行。設置株間距1 m，行間距1 m環(huán)境條件下，種植試驗材料，進行常規(guī)田間栽培管理。定植后，在營養(yǎng)生長期階段對木豆小葉突變體和野生型，F2代分離群體和親本的葉長、葉寬、長寬比及葉面積等性狀進行調查。參照《木豆種質資源描述規(guī)范和數據標準》，其葉片相關性狀指標及測定方法如下：

葉長：育苗移栽3個月后，針對每個單株，采用直尺測量每株植株中成熟復葉的中間小葉的長度，每株10個重復，取平均值，單位為cm。

葉寬：育苗移栽3個月后，針對每個單株，采用直尺測量每株植株中成熟復葉的中間小葉的寬度，每株10個重復，取平均值，單位為cm。

長寬比：即葉長與葉寬的比值。

葉面積：參考楊建軍等［21］的方法采用長寬系數法計算，選擇每株植株的最大葉長和葉寬，再用公式A=KLW（A：葉面積；K：校正系數，取0.72；L：葉長；W：葉寬）求出木豆中間小葉葉面積。

1.3 遺傳分析

根據F2代分離群體單株中間小葉葉寬數據，確定F2代群體中小葉突變型和野生型的植株數量，然后結合卡方檢驗，分析木豆小葉突變體性狀的遺傳模式。

1.4 DNA提取

取新鮮木豆嫩葉，參照Tian等［22］的方法，使用DNA提取試劑盒（TIANGEN公司）提取基因組DNA，利用核酸蛋白含量測定儀對其濃度及純度測定，并采用1％瓊脂糖凝膠電泳對DNA樣品質量進行檢測，保存于-20℃冰箱備用。

1.5 基因池的構建

根據Michelmore等［23］描述的混池分離群體分析法（BSA），結合葉片性狀考察結果，從F2代群體中，分別選取中間小葉葉片最寬的25株，中間小葉葉片最窄的25株，分別等量混勻，構建寬葉池和窄葉池，將構建好的基因池置于-4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 木豆小葉突變體基因初步定位及驗證

試驗所用相應的標記為陳志祥等［24］在木豆種質資源中篩選出的SSR標記和本課題組前期利用木豆測序數據開發(fā)并驗證的InDel標記。以寬葉池和窄葉池及親本DNA為模板進行引物篩選，以篩選出在兩個基因池間有差異的引物，找出與葉片變小突變體基因可能的連鎖標記。隨后，對兩個基因池中的各單株及F2群體進行基因型檢測，結合葉片性狀數據，確定連鎖標記。

PCR總反應體系為20 μL，包括2 μL10×Buffer、15.3 μL ddH2O、0.1 μL Taq酶、0.8 μL dNTP（2.5 mmol·L-1）、引物各0.4 μL（5 μmol·L-1）、1 μL模板DNA（50 ng·μL-1），進行PCR擴增。PCR反應擴增程序為：94℃預變性4 min；94℃變性30 s；55℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環(huán)38次；最后72℃延伸5 min，16℃保存。PCR擴增產物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色后照相記錄。

1.7 統(tǒng)計分析

利用Microsoft Excel 2016進行數據處理及繪制圖表，并使用SPSS26.0軟件對數據進行獨立樣本T檢驗（Independent-Samples T，Test）及顯著性分析和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 木豆小葉突變體的田間表型調查鑒定

通過對小葉突變體與野生型植株田間表型進行對比觀察和統(tǒng)計分析發(fā)現，與野生型植株相比差異非常明顯，小葉突變體植株表現為葉子小而尖，且植株整體頂端葉片較少，枝條分枝末梢似呈束頂狀（圖1A）。比較小葉突變體和野生型中間小葉各表型平均值發(fā)現，小葉突變體中間小葉的葉長4.91 cm，葉寬1.49 cm，葉面積5.40 cm2，均較野生型（葉長8.62 cm，葉寬3.28 cm，葉面積21.42 cm2）顯著變小，其中突變體的葉面積僅為野生型的25.21%（表1，圖1B），且突變體變異系數明顯高于野生型。突變體中間小葉的長寬比（3.34）顯著大于野生型（2.66），說明突變體除了葉面積顯著變小外，葉形也發(fā)生明顯的改變（表1，圖1C）。

2.2 小葉突變體的遺傳模式分析

為了解木豆小葉突變體的遺傳規(guī)律，本研究挑選與瓊中木豆長勢相近的品種‘ICPL81-3’與小葉突變體進行雜交構建F2代分離群體，通過對F2群體單株中間小葉葉片表型進行考察及統(tǒng)計分析，對其進行遺傳模式分析。統(tǒng)計分析發(fā)現，在包含243株的F2群體中，不同單株間中間小葉葉長、葉寬、長 寬比及葉面積均表現出明顯的差異，且葉長、葉寬、 "葉面積之間相關性表現極顯著正相關，而長寬比與葉長、葉寬、葉面積均呈現顯著負相關（表2）。其中葉長、葉寬和葉面積在F2群體中呈明顯的雙峰分布，長寬比也呈現明顯的偏分離（圖2）。中間小葉葉寬在F2群體中雙峰分布最為明顯，寬葉和窄葉的株數分別為187株和56株，經卡方（X2）檢驗，符合3∶1分離（X2lt;X20.05，1=3.84）（表3），推測該突變體葉片變小的表型受隱性單基因調控。

2.3 木豆小葉突變體基因池連鎖標記篩選

2.3.1 多態(tài)性標記篩選 ""為獲得多態(tài)性標記，本研究挑選了90對SSR引物和10對InDel標記，以小葉突變體和‘ICPL81-3’木豆DNA為模板進行PCR擴增及PAGE電泳，篩選出在兩親本間具有多態(tài)性且清晰、重復性好、擴增穩(wěn)定的引物23對（表4）。

2.3.2 "木豆小葉突變基因池篩選 ""為獲得與小葉突變性狀連鎖的標記，根據葉片性狀考察結果，從F2群體中，分別選取中間小葉極端寬和窄的單株各25株，進行DNA抽提并等量混勻構建寬葉池和窄葉池。利用篩選出來的在葉片變小突變體和‘ICPL81-3’間存在多態(tài)性的23個標記，以寬葉池和窄葉池DNA為模板進行PCR擴增及PAGE電泳，結果發(fā)現InDel標記PA094在兩個基因池間存在明顯的帶型差異。

2.4 連鎖標記的驗證

2.4.1 "利用基因池各單株對引物進行驗證 ""為了驗證PA094與小葉突變性狀是否存在顯著相關。首先利用構建寬葉池和窄葉池各單株DNA進行驗證，以兩基因池各單株DNA及兩親本為模板進行PCR擴增及PAGE電泳，結果表明突變池的25個單株均呈現與父本小葉突變體一致的帶型，而野生池的25個單株則呈現兩種基因型，其中9株與母本‘ICPL81-3’帶型一致，另16株則同時含有父本和母本帶型（圖3）。因此推斷SSR標記PA094可能與葉片變小基因存在連鎖關系，且葉片變小表型受隱性基因調控。

2.4.2 連鎖標記在F2代群體中的驗證 ""為進一步驗證PA094標記與小葉突變基因之間的緊密相關程度，利用F2群體單株進行驗證（圖4）。經對F2群體各單株的基因型及表型進行分析發(fā)現，在F2群體中243個單株含有父本基因型、雜合基因型和母本基因型3種基因型，株數分別為56株、124株和63株，經卡方檢驗符合1∶2∶1分離比（X2lt;X20.05，2=5.99）（表5）。具有父本基因型的56株均呈現為小葉表型，表明PA094確實與小葉基因存在的連鎖關系，且小葉表型由隱性單基因控制。

3 討論

創(chuàng)制突變體是進行種質資源創(chuàng)新和功能基因組學研究的一種有效手段，在植物遺傳育種和基因功能研究中已得到了廣泛應用，通過研究隨機誘變產生的突變體不僅能夠挖掘新的基因，還可以揭示已知基因的新功能［25］。本研究通過航空誘變獲得了一個木豆小葉突變體，與野生型相比，突變體植株葉子小而尖，且植株整體頂端葉片較少，枝條分枝末梢似呈束頂狀。這與肖佳林等［26］用EMS誘變獲得的辣椒（Capsicum annum L.）突變體葉片表型類似，但其突變體除了葉片發(fā)生改變外，其他農藝性狀也發(fā)生了改變，推斷該突變基因可能是一因多效，該基因可能直接或間接控制著植株的葉片大小和其他性狀。有研究表明，引起葉片大小發(fā)生改變的因素一方面可能是突變后葉片的表皮細胞數量減少，影響營養(yǎng)的運輸，從而導致葉片變?。?］，另一方面可能是基因發(fā)生變異或者缺失導致，如Wang等［27］發(fā)現一個編碼蛋白基因 OsHSP40 序列變異會引起水稻（Oryza Sativa L.）葉片變小，葉寬變窄，這與本研究的突變體相似。與其相反的是，Omidbakhsfard等［28］在功能缺失的擬南芥（Arabidopsis thaiana（L.）Heynh） atgrf9 突變體中發(fā)現，敲除 atgrf9 基因會使得細胞增殖被促進，導致葉片變大，而基因過表達使得細胞增殖受到抑制導致細胞數目減少，葉片變小，表明基因也可能會負調控葉片大小的發(fā)育。為了解木豆小葉突變體遺傳規(guī)律，本研究通過對F2群體遺傳模式分析發(fā)現，中間小葉葉寬表型在F2群體中符合3∶1分離（X2lt;X20.05，1=3.84），推測該突變體小葉表型受隱性單基因調控，這與大部分葉形突變體遺傳模式相一致，說明調控葉片形態(tài)的遺傳模式可能是隱性基因控制，但也有一些葉形突變體是受顯性基因控制，如煙草皺葉突變體［19］、水稻卷葉突變體［29］等。

混地分離群體分析法（BSA）適用于質量性狀單基因或數量性狀主效基因的定位，是快速找到與目標性狀緊密連鎖的分子標記的有效方法，克服了沒有創(chuàng)建近等基因系的限制［30］。熊才運等［31］利用BSA法結合SSR分子標記技術將甜玉米雄性不育突變基因精細定位在標記S1和W10之間，物理距離為11.30 kb，并找到了突變體的關鍵候選基因。楊會會等［32］采用BSA-seq和SSR分子標記多態(tài)性分析，精細定位并克隆了控制西瓜（citrullus lanatus）側枝多少的候選基因Cla018392。Wu等［33］用BSA-SSR分子標記法，在高粱（sorgum bicolor （L.） Moench）-蘇丹草（Sorghum sudanence（piper） stapf）雜交種中開發(fā)了7個與低氫氰酸含量相關的SSR標記，并精細定位到兩個標記之間，進一步通過序列比較，預測到了1個與目標性狀相關的候選基因。由此可知，采用BSA法進行目標基因定位尋找與目標性狀相關的連鎖標記，并進行基因克隆，該方法是可行合理的。本研究利用SSR標記和InDel標記結合BSA法，篩選出了1個在兩基因池間存在明顯差異的InDel標記PA094，這是在木豆上首次用BSA方法鑒定出與葉片大小基因相關的分子標記，經基因池各單株檢測和F2群體單株檢驗后，證實PA094與葉片變小突變性狀具有穩(wěn)定的連鎖關系，表明BSA分析法適用于尋找與葉片變小突變性狀相關的分子標記。

4 結論

本研究通過航空誘變獲得1個葉片顯著變小的木豆突變體，經雜交構建F2群體并進行遺傳分析，確定該突變體葉片變小表型受隱性單基因調控。利用SSR標記和InDel標記結合BSA法，及群體單株驗證，在木豆上首次鑒定出與葉片大小基因連鎖的分子標記PA094，研究結果為后續(xù)木豆小葉突變基因的精細定位及克隆奠定了基礎，也為解析植物葉片大小發(fā)育調控分子機制提供了新的種質資源。

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（責任編輯 劉婷婷）

收稿日期：2023-07-17；修回日期：2023-11-09

基金項目： "海南省自然科學基金項目（320RC729）；現代產業(yè)體系牧草崗位科學家經費（CRAS-35）資助

作者簡介：

王上志（1998-），男，漢族，海南澄邁人，碩士研究生，主要從事熱帶牧草遺傳育種研究，E-mail：1327684264@qq.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：xipding@163.com;xfli0922@163.com