狗牙根誘變后代生長(zhǎng)速度評(píng)價(jià)及DNA指紋圖譜構(gòu)建

摘要： 狗牙根（Cynodon dactylon）是一種常見(jiàn)的暖季型草，利用誘變技術(shù)處理現(xiàn)有品種進(jìn)行改良，是快速選育優(yōu)良新品種的一種途徑。本研究以國(guó)審品種‘陽(yáng)江’狗牙根通過(guò)60Co-γ輻射處理獲得的12個(gè)誘變后代為材料，進(jìn)行生長(zhǎng)速度評(píng)價(jià)和基于序列相關(guān)的擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）分子標(biāo)記技術(shù)的DNA指紋圖譜構(gòu)建。結(jié)果表明，誘變后代間匍匐莖總長(zhǎng)度、地上部分干重、匍匐莖數(shù)量、地下部分干重等4個(gè)指標(biāo)均存在顯著的變異。對(duì)這4個(gè)指標(biāo)進(jìn)行隸屬函數(shù)分析，對(duì)誘變后代的生長(zhǎng)速度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，認(rèn)為其生長(zhǎng)速度由快到慢依次為M37＞M16＞M1＞M25＞M10＞M18＞M28＞M29＞M26＞‘陽(yáng)江’＞M22＞M31＞M4。利用12對(duì)SRAP引物對(duì)12個(gè)誘變后代和6個(gè)狗牙根主栽品種進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建，其中7對(duì)引物組合可以直接對(duì)18份參試材料進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。本研究為進(jìn)一步國(guó)產(chǎn)狗牙根新品種的選育和保護(hù)提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 狗牙根；60Co-γ輻射誘變；生長(zhǎng)速度；SRAP；指紋圖譜

中圖分類(lèi)號(hào)：S330.2 """文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A """"文章編號(hào)： 1007-0435（2024）02-0419-07

Evaluation of Growth Rate and DNA Fingerprint Construction of Mutated

Progenies from Bermudagrass

CHEN Jing-bo1，2， ZHANG Xiao-xiao1，2， LI Dan-dan1，2， LI Jian-jian1，2，

WANG Hao-ran1，2， LIU Jian-xiu1，2， GUO Hai-lin1，2*

（1. Institute of Botany， Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences （Nanjing Botanical Garden Mem. Sun Yat-Sen），

Nanjing， Jiangsu Province 210014， China; 2. Jiangsu Key Laboratory for the Research and Utilization of Plant Resources，

Nanjing， Jiangsu Province 210014， China）

Abstract： "Bermudagrass （Cynodon dactylon） is a prevalent warm-season grass. Mutation technology offers a rapid method for selecting new superior varieties. This study used 12 mutated progenies from the nationally approved ‘Yangjiang’ bermudagrass variety，obtained through 60Co-γ radiation mutagenesis treatment. The growth rate was evaluated，and a DNA fingerprint was constructed using sequence-related amplified polymorphism （SRAP） molecular marker technology. The results showed that there were significant variations in the total stolon length，aboveground dry weight，stolon number，and underground dry weight among the mutated progenies. Membership function analysis was performed on these four indicators to comprehensively evaluate the growth rate of the mutated progenies. The growth rate，from fastest to slowest，is M37gt;M16gt;M1gt;M25gt;M10gt;M18gt;M28gt;M29gt;M26gt;‘Yangjiang’gt;M22gt;M31gt;M4. Twelve pairs of SRAP primers were used to construct fingerprint maps of 12 mutated progenies and 6 main bermudagrass varieties. It was found that 7 pairs of primer combinations could directly and accurately identify 18 test materials. This study provides a reliable experimental basis for the breeding and protection of new domestic bermudagrass varieties.

Key words： Bermudagrass;60Co-γ radiation-induced mutation;Growth rate;SRAP;Fingerprint

狗牙根（Cynodon Rich）為禾本科多年生草本植物，在全世界溫暖地區(qū)都有分布，是一種典型的暖季型草坪草、生態(tài)草和牧草。狗牙根具有發(fā)達(dá)的匍匐莖和地下莖，繁殖能力和再生能力強(qiáng)，且具有耐踐踏、抗旱、耐鹽堿、成坪快等優(yōu)良特性，被廣泛應(yīng)用于運(yùn)動(dòng)草坪、游憩草坪及生態(tài)建設(shè)中［1-2］。然而目前市場(chǎng)上的常用狗牙根品種多來(lái)源于美國(guó)，而我國(guó)狗牙根育種工作起步晚，育種水平落后，僅少數(shù)品種獲得審定，且在市場(chǎng)上應(yīng)用較少。國(guó)家多次在不同文件政策中強(qiáng)調(diào)種業(yè)振興問(wèn)題，促進(jìn)植物品種國(guó)產(chǎn)化，因此加快具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)且符合產(chǎn)業(yè)需求的國(guó)產(chǎn)優(yōu)良新品種選育迫在眉睫［3］。誘變育種是一種非常有效的植物育種技術(shù)，如60Co-γ輻射誘變等［4-5］。60Co-γ輻射誘變?cè)诓萜翰萦N上有較多應(yīng)用，在多個(gè)草種上發(fā)現(xiàn)誘變后代在形態(tài)學(xué)和抗逆性上發(fā)生顯著的變異［6-10］。一些育種者通過(guò)誘變的方法選育出優(yōu)良草坪草新品種，如2018年的國(guó)審品種‘廣綠’結(jié)縷草就是由‘蘭引III號(hào)’結(jié)縷草經(jīng)60Co-γ輻射誘變后選育而成［11］。目前草類(lèi)植物新品種選育時(shí)，育種者多關(guān)注形態(tài)特征變化和草坪質(zhì)量，往往對(duì)生長(zhǎng)速度這個(gè)重要指標(biāo)關(guān)注較少。

狗牙根多通過(guò)營(yíng)養(yǎng)體來(lái)建坪［12］，加快營(yíng)養(yǎng)體種植后的生長(zhǎng)速度，對(duì)草坪建植和生態(tài)修復(fù)非常重要。匍匐莖是狗牙根最主要的營(yíng)養(yǎng)體，容易在節(jié)處著生不定根和芽，能夠平臥橫走地面快速生長(zhǎng)，擴(kuò)大營(yíng)養(yǎng)面積，是狗牙根形成高密度草坪的基礎(chǔ)［13］，也是狗牙根草坪在受損傷后快速恢復(fù)生長(zhǎng)和提高抗逆性的關(guān)鍵器官［14-15］，其生長(zhǎng)速度對(duì)狗牙根的生產(chǎn)和應(yīng)用有很重要的意義。狗牙根生長(zhǎng)速度評(píng)價(jià)一般以地上部分生長(zhǎng)指標(biāo)為主，如李?lèi)偟龋?6］通過(guò)匍匐莖數(shù)、分蘗數(shù)、匍匐莖生長(zhǎng)速度、匍匐莖總長(zhǎng)度等指標(biāo)進(jìn)行觀測(cè)，對(duì)23份狗牙根材料進(jìn)行擴(kuò)繁性能的評(píng)價(jià)，將其分成慢繁型和快繁型兩類(lèi)。 但是草坪的地上部分生長(zhǎng)離不開(kāi)根系的發(fā)育，根系生物量越大，能吸收和貯藏的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)就越多，有利于地上部分（包括匍匐莖）的生長(zhǎng)，也能增加狗牙根的抗逆性。因此狗牙根的生長(zhǎng)速度評(píng)價(jià)需要綜合考慮地上地下部分的協(xié)同生長(zhǎng)。總之，生長(zhǎng)速度是評(píng)價(jià)狗牙 根擴(kuò)張和繁殖能力的重要指標(biāo)，是生產(chǎn)上影響狗牙根草坪建坪速度和生態(tài)修復(fù)效果的關(guān)鍵因素，是狗牙根新品種選育時(shí)一個(gè)重要的育種目標(biāo)，在育種過(guò)程中需要多加關(guān)注。

準(zhǔn)確鑒定新選育的優(yōu)良品種，對(duì)其知識(shí)產(chǎn)權(quán)的保護(hù)非常重要。由于狗牙根容易通過(guò)匍匐莖等營(yíng)養(yǎng)體進(jìn)行快速擴(kuò)繁，且器官形態(tài)容易受環(huán)境影響而表現(xiàn)出不同的形態(tài)特征［14，17］，導(dǎo)致品種保護(hù)和鑒定困難，因此需要找到一種穩(wěn)定的品種特異的標(biāo)記物。DNA作為植物的基本遺傳物質(zhì)，穩(wěn)定性強(qiáng)，且不同物種不同品種間均存在顯著的DNA序列差異［18-19］。與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和生化標(biāo)記相比較，利用DNA開(kāi)發(fā)的品種特異的分子標(biāo)記，具有穩(wěn)定性強(qiáng)，不受生長(zhǎng)環(huán)境條件、發(fā)育階段、不同器官等影響，且只要少量的植物組織提取DNA就能進(jìn)行鑒定，是目前品種鑒定的常用方法［20-21］。因此，利用品種間的遺傳差異，對(duì)新選育的優(yōu)良品種需要進(jìn)行單獨(dú)開(kāi)發(fā)特異的分子標(biāo)記，形成該品種的指紋圖譜，用于專(zhuān)門(mén)的品種鑒定。

‘陽(yáng)江’狗牙根為江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所通過(guò)系統(tǒng)選育方法培育出的國(guó)產(chǎn)優(yōu)質(zhì)抗逆狗牙根品種，并于2007年通過(guò)農(nóng)業(yè)部草品種審定，具有草坪密度高、匍匐性強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、耐鹽性和耐踐踏性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，在我國(guó)運(yùn)動(dòng)草坪建設(shè)、鹽堿地綠化、水土保持草坪、休憩草坪建設(shè)以及島礁綠化等方面發(fā)揮了重要的作用。然而該品種花序密度高，且花期長(zhǎng)，這不僅降低了其坪用質(zhì)量，且增加了養(yǎng)護(hù)成本。從2016年開(kāi)始，以‘陽(yáng)江’狗牙根匍匐莖為外植體，進(jìn)行60Co-γ輻射誘變，結(jié)果獲得了12個(gè)花序密度低于親本材料且花期延遲的誘變后代［22］。但狗牙根在通過(guò)輻射誘變獲得突變體的同時(shí)，常常會(huì)發(fā)生形態(tài)變異，影響其生長(zhǎng)速度［6］，進(jìn)而影響建坪速度。本研究以地上部分和根系干重、匍匐莖數(shù)量、匍匐莖總長(zhǎng)度等為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)初步選出的12個(gè)誘變后代進(jìn)一步進(jìn)行生長(zhǎng)速度綜合評(píng)價(jià)，以明確它們營(yíng)養(yǎng)擴(kuò)繁能力的差異，同時(shí)通過(guò)SRAP分子標(biāo)記構(gòu)建其DNA指紋圖譜，為‘陽(yáng)江’二代新品種的選育和推廣應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

12份參試材料來(lái)源于國(guó)審品種‘陽(yáng)江’狗牙根通過(guò)60Co-γ輻射誘變并初步評(píng)價(jià)獲得的花序密度低和花期短的誘變后代，分別是M1，M4，M10，M16，M18，M22，M25，M26，M28，M29，M31，M37［22］，同時(shí)以6個(gè)生產(chǎn)常用品種和親本為對(duì)照品種，包括‘陽(yáng)江’‘關(guān)中’‘Tifway’‘Tifgreen’‘Tifsport’‘蘇植2號(hào)’狗牙根。其中，生長(zhǎng)速度的測(cè)定僅以親本‘陽(yáng)江’為對(duì)照。

1.2 材料培養(yǎng)

生長(zhǎng)速度測(cè)定試驗(yàn)于2019年5月24日—6月23日進(jìn)行。從試驗(yàn)地選取‘陽(yáng)江’狗牙根及其誘變后代生長(zhǎng)一致的匍匐莖，種植于口徑為19 cm的花盆中。培養(yǎng)基質(zhì)為田園土和河沙按照1∶1混合而成，混合土的基本理化性質(zhì)為pH 7.7，有機(jī)質(zhì)0.19%，全氮0.05%，速效磷12.46 ppm，速效鉀24.78 ppm。由于土壤氮磷等養(yǎng)分含量低，每盆加5 g復(fù)合肥（15-15-15）作為基肥，拌勻。每份材料4個(gè)重復(fù)（1盆為1個(gè)重復(fù)），每個(gè)重復(fù)種植3條含有3個(gè)節(jié)（第2～4節(jié)）的匍匐莖，栽植前去根。材料放大棚內(nèi)培養(yǎng)，根據(jù)土壤濕度狀況及時(shí)澆水，保持土壤濕潤(rùn)，防止植物萎蔫，并栽植兩周后每盆追施尿素2 g。試驗(yàn)期間平均最低溫度20.2℃，最高溫度28.8℃。

1.3 生長(zhǎng)速度測(cè)定方法

6月23日結(jié)束實(shí)驗(yàn)，把整個(gè)植株從花盆內(nèi)倒出，洗凈，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)量。測(cè)定指標(biāo)包括：匍匐莖總長(zhǎng)度、匍匐莖數(shù)量、地上部分干重和根系干重，其中匍匐莖總長(zhǎng)度指新生長(zhǎng)的所有匍匐莖長(zhǎng)度的總和；匍匐莖數(shù)量指新生長(zhǎng)的匍匐莖的數(shù)量（包括一級(jí)匍匐莖和二級(jí)匍匐莖）；地上部分和根系干重指收集每盆供試材料的地上部分和根系，置于80℃烘箱中烘干后分別稱(chēng)重所得的重量。

1.4 DNA指紋圖譜構(gòu)建方法

根據(jù)Zhang等［22］引物篩選結(jié)果，選擇12對(duì)擴(kuò)增條帶清晰穩(wěn)定、多態(tài)性強(qiáng)的引物組合對(duì)選育的12個(gè)優(yōu)良后代進(jìn)行基于序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）分子標(biāo)記技術(shù)的DNA指紋圖譜的構(gòu)建，12對(duì)引物組合如表1所示。具體試驗(yàn)方法參考Zhang等［22］，簡(jiǎn)要步驟為提取12份優(yōu)良后代及6份對(duì)照品種的DNA，用SRAP引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后擴(kuò)增產(chǎn)物在10%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分離，銀染檢測(cè)，拍照，并進(jìn)行條帶讀取，分析特異性條帶，構(gòu)建參試材料的DNA指紋圖譜。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和圖表制作，用SPSS 16.0軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。生長(zhǎng)速度綜合評(píng)價(jià)是利用隸屬函數(shù)的方法對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行處理和換算，公式如下：X（u）=（X－Xmin）/（Xmax－Xmin）。其中X為各個(gè)供試材料某一指標(biāo)相對(duì)值，Xmax為某一指標(biāo)測(cè)定值內(nèi)的最大值，Xmin為該指標(biāo)中的最小值，求得的各指標(biāo)的隸屬值累加求平均值，然后根據(jù)平均數(shù)大小對(duì)供試材料生長(zhǎng)速度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)［23］。

2 結(jié)果與分析

2.1 "狗牙根誘變后代不同生長(zhǎng)速度指標(biāo)的變異分析

對(duì)親本‘陽(yáng)江’和12個(gè)誘變后代培養(yǎng)一個(gè)月后的匍匐莖數(shù)量、匍匐莖總長(zhǎng)度、地上部分干重和根系干重等4個(gè)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，發(fā)現(xiàn)參試材料的匍匐莖數(shù)量、匍匐莖總長(zhǎng)度、地上部分干重和根系干重均存在顯著變異（表2）。這四個(gè)指標(biāo)變異幅度的大小依次為：匍匐莖總長(zhǎng)度＞地上部分干重＞匍匐莖數(shù)量＞地下部分干重，其變異范圍分別為123.0～711.4 cm、0.71～3.44 g、12～56條、0.11～0.51 g，變異系數(shù)分別達(dá)到40.71％，35.09%，34.45%，33.75%。

誘變后代M1，M16和M37的再生匍匐莖數(shù)量最多，均為56條，但均與親本‘陽(yáng)江’（44條）沒(méi)有顯著的差異，而誘變后代M4和M31的匍匐莖數(shù)量均少于15條，顯著少于‘陽(yáng)江’和其他誘變后代，說(shuō)明誘變后代M4和M31的分枝能力較弱。匍匐莖總長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，有9份誘變后代的匍匐莖總長(zhǎng)度顯著高于‘陽(yáng)江’（366.7 cm），分別為M25，M37，M16，M1，M10，M18，M29，M28和M26（400 cm以上），其中誘變后代M25的匍匐莖總長(zhǎng)度顯著最長(zhǎng)，達(dá)到711.4 cm，說(shuō)明M25的匍匐莖生長(zhǎng)速度最快，而M4和M31的匍匐莖總長(zhǎng)度都在140 cm以下，顯著低于親本，生長(zhǎng)速度最慢。

地上部分干重超過(guò)‘陽(yáng)江’的誘變后代有M37，M25，M16，M1，M18，M29和M10等7份材料，其中地上部分干重最高的材料是M37（3.44 g），顯著高于‘陽(yáng)江’（2.32 g）。地上部分干重顯著最小的誘變后代為M4和M31，都在1 g以下。誘變后代M16，M1，M37，M10，M18，M25，M26和M28的根系干重均顯著高于親本‘陽(yáng)江’（0.31 g），可見(jiàn)這幾個(gè)誘變后代較親本有更發(fā)達(dá)的根系，其中M16的根系干重顯著最高，達(dá)0.51 g，而誘變后代M4和M31地下部分干重顯著最低，都在0.2 g以下，可見(jiàn)這兩個(gè)誘變后代的根系發(fā)育較弱。

綜合四個(gè)指標(biāo)的分析可以看出，誘變后代M1，M10，M16，M18，M25，M26，M28和M37的匍匐莖總長(zhǎng)度和地下部分干重兩個(gè)指標(biāo)的數(shù)據(jù)都顯著超過(guò)親本‘陽(yáng)江’，既有較強(qiáng)的匍匐莖生長(zhǎng)速度，也有較為發(fā)達(dá)的根系。誘變后代M4和M31的匍匐莖數(shù)量、匍匐莖總長(zhǎng)度、地上部分干重和地下部分干重四個(gè)指標(biāo)均顯著低于‘陽(yáng)江’及其他誘變后代，生長(zhǎng)速度最慢。

2.2 狗牙根誘變后代生長(zhǎng)速度綜合評(píng)價(jià)

以匍匐莖數(shù)量、匍匐莖總長(zhǎng)度、地上部分干重、根系干重為指標(biāo)，利用隸屬函數(shù)法對(duì)‘陽(yáng)江’及其誘變后代進(jìn)行生長(zhǎng)速度綜合評(píng)價(jià)，其均值越大，代表材料的生長(zhǎng)速度越快。從表3可以看出，有9份誘變后代的均值大于‘陽(yáng)江’，分別為M37，M16，M1，M25，M10，M18，M28，M29和M26。其中，誘變后代M37均值最高，為0.948，比‘陽(yáng)江’高了0.388，其次是M16，為0.910。M4，M22和M31的均值小于‘陽(yáng)江’，其中M4和M31均在0.10以下。綜合來(lái)看，‘陽(yáng)江’與其誘變后代的生長(zhǎng)速度由快到慢依次為M37＞M16＞M1＞M25＞M10＞M18＞M28＞M29＞M26＞‘陽(yáng)江’＞M22＞M31＞M4。

2.3 SRAP標(biāo)記分析

通過(guò)SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)12個(gè)‘陽(yáng)江’狗牙根誘變后代以及6個(gè)狗牙根主栽品種進(jìn)行指紋圖譜分析（圖1），12對(duì)引物均可以擴(kuò)增出清晰的多態(tài)性條帶，共擴(kuò)增出142條帶，其中多態(tài)性條帶為83條，多態(tài)性比率為58.45％。通過(guò)比較分析，發(fā)現(xiàn)8，13，23，25，31，39和48號(hào)，這7對(duì)引物組合可以直接用于12個(gè)誘變后代和6個(gè)主栽品種的指紋圖譜的構(gòu)建，將所有參試材料區(qū)分開(kāi)來(lái)，并且一些引物在部分材料擴(kuò)增出了特異性條帶。以31號(hào)和48號(hào)引物為例，根據(jù)擴(kuò)增條帶的有無(wú)，在18個(gè)參試材料中的擴(kuò)增圖譜轉(zhuǎn)換成由0和1組成的字符串，構(gòu)成DNA數(shù)字指紋，構(gòu)建了參試材料的DNA指紋圖譜（表4）。

3 討論

輻射誘變是草類(lèi)植物上一種常用的育種技術(shù)，能夠提高其誘發(fā)突變頻率，創(chuàng)造出新的性狀、類(lèi)型，獲得常規(guī)育種方法難以創(chuàng)制的新基因類(lèi)型，為新品種的選育提供豐富的新種質(zhì)［5］。其中60Co-γ輻射誘變技術(shù)已經(jīng)在狗牙根、結(jié)縷草、海雀稗、草地早熟禾（Poa pratensis）、多年生黑麥草（Lolium perenne）、紫花苜蓿（Medicago sativa）等諸多草類(lèi)植物上進(jìn)行了應(yīng)用，取得了良好的育種效果，并獲得了一些優(yōu)良品種［4］。

60Co-γ輻射誘變時(shí)產(chǎn)生的γ射線(xiàn)穿透能力強(qiáng)，導(dǎo)致多點(diǎn)性的DNA突變，因此常常伴隨著形態(tài)學(xué)、抗逆性等多種表型的變異［5］。劉天增等［8］對(duì)4個(gè)海雀稗品種進(jìn)行輻射誘變，獲得9個(gè)突變材料，其植株葉寬、葉長(zhǎng)、株高、匍匐莖節(jié)間長(zhǎng)度和直徑以及密度等指標(biāo)均不同程度地優(yōu)于各自對(duì)照親本。王文恩等［24］對(duì)狗牙根品種Princess77的輻射誘變后代進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)葉片寬度和長(zhǎng)度、節(jié)間直徑和長(zhǎng)度、植株自然高度等指標(biāo)上，均有超過(guò)或小于對(duì)照親本的。宣繼萍等［6］也發(fā)現(xiàn)不同狗牙根誘變后代在葉片長(zhǎng)寬、匍匐莖節(jié)間直徑和長(zhǎng)度、密度和草層高度等6個(gè)坪用質(zhì)量指標(biāo)上發(fā)生了顯著的變異。宋華偉等［9］對(duì)3個(gè)結(jié)縷草品種進(jìn)行誘變，對(duì)獲得的6個(gè)新品系通過(guò)測(cè)定葉片相對(duì)含水量、相對(duì)電導(dǎo)率、脯氨酸含量、可溶性總糖含量、顏色、蓋度等指標(biāo)進(jìn)行抗旱性綜合評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)新品系ZSS-5、ZSS-6、ZS-3的抗旱性?xún)?yōu)于其親本，而有些品系卻弱于親本。前期在本研究所用誘變后代中也發(fā)現(xiàn)了葉片變短變窄、莖節(jié)長(zhǎng)度和生殖枝變短、花序密度顯著降低等變異［22］。本研究進(jìn)一步從生長(zhǎng)速度角度評(píng)價(jià)了誘變后代的變異情況，以更全面的了解新種質(zhì)的特性。

草坪生長(zhǎng)速度是一個(gè)反映坪用質(zhì)量和生態(tài)修復(fù)能力的重要指標(biāo)。Okeyo等［25］研究發(fā)現(xiàn)，不同的結(jié)縷草雜交后代在建植初期匍匐莖生長(zhǎng)存在 顯著的差異，每周新長(zhǎng)匍匐莖數(shù)量、匍匐莖伸長(zhǎng)率、匍匐莖分枝數(shù)量的范圍分別為2.2～8.6個(gè)、18.8～65.1 mm、1.8～7.7個(gè)，并且匍匐莖生長(zhǎng)指標(biāo)與草坪蓋度呈顯著的正相關(guān)。這說(shuō)明生長(zhǎng)速度快的草坪品種，能夠在建植初期快速實(shí)現(xiàn)滿(mǎn)覆蓋，這有利于草坪建植和生態(tài)修復(fù)的開(kāi)展，以及植被受損后的快速恢復(fù)。然而，如此重要的一個(gè)指標(biāo)，卻在育種工作中很少對(duì)新種質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。生長(zhǎng)速度是一個(gè)綜合性狀，受匍匐莖和直立莖生長(zhǎng)快慢（長(zhǎng)度）、分枝數(shù)、植株粗細(xì)、植株重量等多方面因素的影響，因此很難用單一的指標(biāo)來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)。李?lèi)偟龋?6］以匍匐莖數(shù)、分蘗數(shù)、匍匐莖生長(zhǎng)速度、匍匐莖總長(zhǎng)度等為指標(biāo)，對(duì)23份狗牙根材料進(jìn)行擴(kuò)繁性能的評(píng)價(jià)。而郭海林等［26］以匍匐莖總長(zhǎng)度、地上部生物量和地下生物量為指標(biāo)，對(duì)幾個(gè)優(yōu)良的雜交狗牙根輻射誘變后代進(jìn)行了生長(zhǎng)速度的評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)不同后代間存在顯著的變異，其中C75502M1各項(xiàng)指標(biāo)值均較高。本研究以影響生長(zhǎng)速度的四個(gè)主要指標(biāo)為依據(jù)，綜合評(píng)價(jià)了12份‘陽(yáng)江’誘變后代，發(fā)現(xiàn)不同評(píng)價(jià)指標(biāo)間有顯著變異，四個(gè)指標(biāo)變異幅度大小依次為匍匐莖總長(zhǎng)度＞地上部分干重＞匍匐莖數(shù)量＞地下部分干重；不同誘變后代的生長(zhǎng)速度發(fā)生了顯著的變異，既有生長(zhǎng)受到顯著促進(jìn)的，如M37，M16，M1等，也有生長(zhǎng)受到顯著抑制的，如M31，M4等，或與親本差異不顯著的，如M29，M26等?！?yáng)江’狗牙根的誘變后代不僅在繁殖性狀指標(biāo)花序密度上發(fā)生了顯著變異［22］，在營(yíng)養(yǎng)性狀指標(biāo)生長(zhǎng)速度等方面也發(fā)生了顯著變異，也就是說(shuō)發(fā)生了多種表型的變異，這符合60Co-γ輻射誘變多位點(diǎn)性特征［6］。同時(shí)本研究也說(shuō)明輻射誘變能改良狗牙根的生長(zhǎng)速度，有望獲得生長(zhǎng)速度更快的新品種。

輻射處理能產(chǎn)生變異豐富的誘變后代，有些誘變后代在形態(tài)上會(huì)產(chǎn)生顯著差異，然而形態(tài)上的變異也可能是由物理?yè)p傷引起的創(chuàng)傷性變異，這種變異不能遺傳；同時(shí)有些誘變后代形態(tài)上的變異幅度小，與親本相似，難以區(qū)分，或容易受環(huán)境影響。因此，對(duì)誘變后代從分子水平上進(jìn)行快速準(zhǔn)確的鑒定，并對(duì)品種和優(yōu)良后代進(jìn)行區(qū)分的穩(wěn)定的技術(shù)有待研究。目前，以PCR為基礎(chǔ)的DNA指紋圖譜技術(shù)已被廣泛的用于遺傳多樣性、親緣關(guān)系、品種鑒定等方面的研究中［27-32］。Wang等［18］用90個(gè)SRAP引物組合對(duì)24個(gè)國(guó)內(nèi)外的狗牙根品種進(jìn)行分子鑒定，發(fā)現(xiàn)有30個(gè)引物組合產(chǎn)生了274條清晰的條帶，其中249條（91%）具有多態(tài)性，并且每個(gè)品種都可以構(gòu)建獨(dú)特的二進(jìn)制代碼指紋圖譜，可以與其他品種區(qū)分開(kāi)來(lái)。SRAP分子標(biāo)記具有重復(fù)性好、穩(wěn)定性高且信息位點(diǎn)多、且操作簡(jiǎn)單、成本低廉等特點(diǎn)。利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)物種進(jìn)行DNA水平上的鑒定以及構(gòu)建品種指紋圖譜，也被作為新品種保護(hù)及知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)的手段［30-32］。本研究通過(guò)SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)12個(gè)‘陽(yáng)江’狗牙根誘變后代以及狗牙根6個(gè)主栽品種進(jìn)行指紋圖譜的構(gòu)建，實(shí)驗(yàn)所用的12對(duì)引物均擴(kuò)增出條帶清晰的多態(tài)性條帶，共擴(kuò)增出142條帶，多態(tài)性條帶為83條，其中有7對(duì)引物組合可以直接對(duì)12份誘變后代和6個(gè)主栽品種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。這一方面說(shuō)明利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)可以對(duì)狗牙根輻射誘變后代進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建，另一方面也為這些新種質(zhì)進(jìn)一步申報(bào)新品種保護(hù)和審定品種提供了一種穩(wěn)定的鑒定方法，為以后新品種的保護(hù)提供了技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

本研究以匍匐莖總長(zhǎng)度、地上部分干重、匍匐莖數(shù)量和地下部分干重為指標(biāo)對(duì)‘陽(yáng)江’及其誘變后代的生長(zhǎng)速度進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)，認(rèn)為其生長(zhǎng)速度由快到慢依次為M37＞M16＞M1＞M25＞M10＞M18＞M28＞M29＞M26＞‘陽(yáng)江’＞M22＞M31＞M4，選擇出了M37、M16等生長(zhǎng)速度顯著高于親本的誘變后代。進(jìn)一步利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，成功構(gòu)建了12個(gè)誘變后代和6個(gè)主栽品種的指紋圖譜，為狗牙根新品種的審定、保護(hù)和推廣提供了可靠的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］ "王贊，吳彥奇，毛凱. 狗牙根研究進(jìn)展［J］. 草業(yè)科學(xué)，2001，18（5）：37-41

［2］ 馬克群，劉建秀. 坪用狗牙根種質(zhì)資源評(píng)價(jià)與改良研究進(jìn)展［J］. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2005，6（3）：348-353

［3］ 南志標(biāo)，王彥榮，賀金生，等. 我國(guó)草種業(yè)的成就、挑戰(zhàn)與展望［J］. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2022，31（6）：1-10

［4］ 孫小富，王雷挺，趙麗麗，等. 牧草輻射誘變育種的研究進(jìn)展［J］. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（11）：18-26

［5］ 楊震，彭選明，彭偉正. 作物誘變育種研究進(jìn)展［J］. 激光生物學(xué)報(bào)，2016，25（4）：302-308

［6］ 宣繼萍，郭愛(ài)桂，劉建秀，等. 狗牙根輻射誘變后代外部性狀變異分析［J］. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2005，14（6）：107-111

［7］ PANG D，LI J，ZHANG Y，et al. Mutagenic Effect of 60Co-γ-rays Irradiation on Turf Characteristics of Buchloe dactyloides（Nutt.） Engelm［J］.Agricultural Science＆Technology，2012，13（6）：1247-1250，1269

［8］ 劉天增，謝新春，張巨明. 海濱雀稗60Co-γ輻射誘變突變體篩選［J］. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2017，26（7）：62-70

［9］ 宋華偉，劉穎，曹榮祥，等.3種結(jié)縷草及其60Co-γ輻射誘變新品系抗旱性比較［J］. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，36（6）：55-61

［10］ 張笑笑，王凱，郭海林，等. 狗牙根誘變后代抗寒性評(píng)價(jià)［J］. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2019，40（5）：869-874

［11］ 全國(guó)畜牧總站編. 草業(yè)良種良法配套手冊(cè)2018［M］. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2019：249-252

［12］ 張旭，王佺珍，崔健，等. 狗牙根草莖建植成坪質(zhì)量的施肥和播種研究［J］. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20（5）：237-244

［13］ 張巨明，任繼周. 暖季型草坪草營(yíng)養(yǎng)體建坪方法的研究［J］. 草業(yè)學(xué)報(bào)，1997， 6（1）： 38-43

［14］ DONG M，DE KROON H. Plasticity in morphology and biomass allocation in Cynodon dactylon，a grass species forming stolons and rhizomes［J］. Oikos，1994， 70：99-106

［15］ 趙玉，賈娜爾，李海燕，等. 新疆伊犁河谷平原狗牙根無(wú)性系構(gòu)件的生長(zhǎng)［J］. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2009，20（4）：779-784

［16］ 李?lèi)偅钆嘤?，孫宗玖. 23份狗牙根材料擴(kuò)繁性能評(píng)價(jià)［J］. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，38（5）： 9-15

［17］ 馬艷娜，臧國(guó)長(zhǎng)，趙荊，等. 不同生境狗牙根種群克隆構(gòu)型和生物量的特征研究［J］. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2019，40（8）：1495-1500

［18］ WANG Z，YUAN X，ZHENG Y，et al. Molecular identification and genetic analysis for 24 turf-type Cynodon cultivars by Sequence-Related Amplified Polymorphism markers［J］. Scientia Horticulturae，2009，122：461-467

［19］ 伊然，王子玥，劉凌云，等. 基于EST-SSR標(biāo)記的60份葦狀羊茅遺傳多樣性分析［J］. 草地學(xué)報(bào)，2023，31（7）：2041-2048

［20］ 高雅迪，張振豪，王一帆，等. DNA分子標(biāo)記技術(shù)在菊花種質(zhì)資源中的應(yīng)用研究［J］. 杭州師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2022，21（2）：152-157

［21］ 趙琴，劉君，楊志民. AFLP分子標(biāo)記對(duì)9份狗牙根材料的鑒定分析［J］. 草地學(xué)報(bào)，2012，20（6）：1156-1162

［22］ ZHANG X，LI J，KAI W，et al. Morphological characteristics and SRAP analysis of bermudagrass mutants generated by 60Co-γ radiation［J］. Journal of Radiation Research and Applied Sciences，2020，13（1）：657-664

［23］ 宗俊勤，高艷芝，陳靜波，等. 荻不同資源種子萌發(fā)期抗鹽性評(píng)價(jià)［J］. 草地學(xué)報(bào)，2013，21（6）：120-128

［24］ 王文恩，包滿(mǎn)珠，張俊衛(wèi)，等. 狗牙根輻射誘變后代變異植株的形態(tài)特征比較和ISSR分析［J］. 草業(yè)科學(xué)，2009，26（12）：139-145

［25］ OKEYO D O，F(xiàn)RY J D，BREMER D J，et al. Stolon Growth Characteristics and Establishment Rates of Zoysiagrass Progeny［J］. Hort Science，2011，46（1）：113-117

［26］ 郭海林，劉建秀，郭愛(ài)桂，等. 雜交狗牙根誘變后代綜合評(píng)價(jià)［J］. 草地學(xué)報(bào)，2008，16（2）：145-149，163

［27］ YERRAMSETTY P N，ANDERSON M P，TALIAFERRO C M，et al. DNA fingerprinting of seeded bermudagrass cultivars［J］. Crop Science，2005，45（2）： 772-777

［28］ 周欣瑩，耿宇航，賈艷艷，等. 河北省野生苔草屬植物ISSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)及親緣關(guān)系分析［J］. 草地學(xué)報(bào)，2023，31（10）：2949-2959

［29］ "張夢(mèng)，史鵬飛，劉春增，等. 基于ISSR分子標(biāo)記的紫云英種質(zhì)資源遺傳多樣性及結(jié)構(gòu)分析［J］. 草地學(xué)報(bào)，2023，31（1）：50-60

［30］ 葉剛，張笑笑，陳靜波，等. 結(jié)縷草屬植物雜交后代形態(tài)特征和SRAP分子標(biāo)記鑒定［J］. 草地學(xué)報(bào)，2021，29（7）：1406-1415

［31］ 郭海林，郭愛(ài)桂，宗俊勤，等. SRAP標(biāo)記對(duì)8份假儉草材料的鑒定分析［J］. 草地學(xué)報(bào)，2014，22（1）：203-207

［32］ 何法慧，左倩倩，于景金，等. 35份狗牙根種質(zhì)材料指紋圖譜構(gòu)建及染色體倍性鑒定［J］. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2023，46（1）：42-54

（責(zé)任編輯 彭露茜）

收稿日期：2023-08-28；修回日期：2023-11-10

基金項(xiàng)目： "江蘇省林業(yè)科技創(chuàng)新與推廣項(xiàng)目（LYKJ［2021］19）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32271758）資助

作者簡(jiǎn)介：

陳靜波（1977-），男，漢族，浙江余姚人，博士，副研究員，主要從事草坪草遺傳育種和抗逆機(jī)制研究，E-mail：chenjb19@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：ghlnmg@sina.com