褪黑素引發(fā)對Na2SO4脅迫下紫花苜蓿種子發(fā)芽特性的影響

摘要： "試驗以紫花苜蓿（Medicago sativa）種子為材料，采用不同濃度的褪黑素（0.05，0.1和0.2 mmol·L-1）分別引發(fā)種子6 h（記為ML6，MM6和MT6）和12 h（記為ML12，MM12和MT12），以不引發(fā)、蒸餾水引發(fā)6 h和12 h為對照（記為CK1，CK2-6和CK2-12），探究在Na2SO4脅迫下，褪黑素引發(fā)對紫花苜蓿種子發(fā)芽和幼苗生長特性的影響，以期篩選有效緩解Na2SO4脅迫的褪黑素引發(fā)處理。結(jié)果表明，75 mmol·L-1 Na2SO4（pH=8.5）脅迫下種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)顯著下降（Plt;0.05）。該條件下，與CK1相比，褪黑素引發(fā)后苜蓿種子的發(fā)芽和幼苗生長能力均有不同程度提高。MT6處理下種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢及幼苗根長、苗長和活力指數(shù)最高。對MT6幼苗的抗氧化酶活性分析發(fā)現(xiàn)，過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性顯著提高（Plt;0.05），種子可溶性糖含量顯著下降（Plt;0.05）。綜上，0.2 mmol·L-1褪黑素引發(fā)6 h紫花苜蓿種子對鹽堿脅迫的緩解效應(yīng)最佳，促進(jìn)種子發(fā)芽和提高幼苗耐鹽堿能力。

關(guān)鍵詞： 紫花苜蓿；種子引發(fā)；褪黑素；Na2SO4脅迫

中圖分類號：S963.22+3.3 """文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A """"文章編號： 1007-0435（2024）02-0378-08

Effects of Melatonin Priming on Alfalfa Seed Germination Characteristics

Under "Na2SO4 "Stress

LIU Jing-yu， ZHAO Hai-jun， OU Cheng-ming， JIA Zhi-cheng， MAO Pei-sheng*

（College of Grassland Science and Technology， China Agricultural University， Key Laboratory of Pratacultural Science，

Beijing Municipality， Beijing 100193， China）

Abstract： "The experiment was conducted with alfalfa （Medicago sativa） seeds，and different concentrations of melatonin solutions （0.05，0.1 and 0.2 mmol·L-1） were used to prime the seeds for 6 h （named ML6，MM6 and MT6） and 12 h （marked ML12，MM12 and MT12）. Taking non-priming and distilled water priming for 6 h and 12 h as controls （CK1，CK2-6 and CK2-12），the effects of melatonin priming on seed germination and seedling growth characteristics of alfalfa under Na2SO4 stress were explored，so as to screen out melatonin priming treatments that can effectively alleviate Na2SO4 stress. The results showed that the germination percentage，germination potential and germination index decreased significantly （Plt;0.05） under the condition of 75 mmol·L-1 Na2SO4 （pH = 8.5）. Under this condition，compared with CK1，the seed germination and seedling growth ability of alfalfa were improved at different degrees after melatonin priming. The seed germination percentage，germination potential，seedling root length，seedling length and vigor index were the highest under MT6 treatment. Analysis of antioxidant enzyme activities of MT6-treated seedlings showed that the activity of peroxidase （POD） increased significantly （Plt;0.05），and the soluble sugar content of seeds decreased significantly （Plt;0.05）. In conclusion，0.2 mmol·L-1 melatonin priming for 6 h had the best effect on alleviating salt-alkali stress of alfalfa seeds，promoting seed germination and improving seedling salt-alkali tolerance.

Key words： Alfalfa;Seed priming;Melatonin;Na2SO4 stress

土壤鹽堿化不僅導(dǎo)致土壤退化，而且影響作物和飼草的生長，成為改善生態(tài)環(huán)境和促進(jìn)現(xiàn)代草產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要瓶頸問題。鹽堿土?xí)种浦参镎ＩL發(fā)育、影響產(chǎn)量、甚至使植物死亡，主要是由于高鹽分使植物產(chǎn)生生理干旱和離子脅迫、降低酶活性、降低葉綠素含量及干擾細(xì)胞代謝等，從而對植物造成傷害［1-2］。提高植物抵抗鹽堿脅迫的方法主要有育種工程、抗鹽鍛煉、水肥調(diào)控和種子處理技術(shù)等。育種工程培育耐鹽品種，但需要攻克復(fù)雜的技術(shù)難關(guān)，時間長且代價大；抗鹽鍛煉存在局限性，不適合所有植物；種子處理技術(shù)相較而言成本低、見效快且效果好，主要包括種子引發(fā)、曬種、藥劑拌種、丸衣等，是快速高效提高種子耐鹽性的方法，在鹽堿地促進(jìn)種子萌發(fā)、草坪種子出苗整齊方面有很好的作用效果［3］。

種子引發(fā)處理可以打破種子休眠、促進(jìn)種子萌發(fā)［3］，增強(qiáng)種子對低溫、高溫、干旱、鹽漬等逆境脅迫的適應(yīng)能力［4-6］，促進(jìn)幼苗生長發(fā)育［7］，并通過促進(jìn)籽粒飽滿和增加穗粒數(shù)來增加產(chǎn)量［8］。褪黑素（Melatonin，MT）是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的吲哚類物質(zhì)，在植物體內(nèi)參與種子萌發(fā)、根的發(fā)育、葉片衰老、清除活性氧及增強(qiáng)抗氧化活性［9］，還具有增強(qiáng)種子抵御鹽堿、干旱、冷害和重金屬等環(huán)境脅迫等作用。研究表明，外源MT可以通過調(diào)控碳氮平衡和脯氨酸代謝來增強(qiáng)植物幼苗對逆境脅迫的抵抗能力［10］；鹽脅迫下外源MT可以提高紫花苜蓿和燕麥幼苗過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性［11-12］；水分脅迫下MT引發(fā)小麥種子后，小麥（Triticum aestivum）葉片的SOD，POD和CAT活性提高［13］。但MT在牧草種子引發(fā)技術(shù)上應(yīng)用較少。

紫花苜蓿是一種優(yōu)質(zhì)的多年生豆科牧草，除了對家畜有重要的飼喂價值外，還具有改土培肥、防風(fēng)治沙、恢復(fù)退化草地等生態(tài)作用。但在紫花苜蓿生產(chǎn)區(qū)域內(nèi)，常有大面積不同程度的鹽堿土分布，鹽堿脅迫一定程度上抑制紫花苜蓿的生長發(fā)育，找到一種適合的方式提高紫花苜蓿種子的耐鹽堿性具有重要意義。本文針對甘肅酒泉的硫酸鹽土地紫花苜蓿種植的出苗問題，以MT為引發(fā)劑，采用不同引發(fā)濃度和引發(fā)時間處理紫花苜蓿種子，評價種子在鹽堿條件下的發(fā)芽能力和幼苗生理特性變化，旨在提高硫酸鹽堿地紫花苜蓿種子的出苗率和幼苗成活率，降低生產(chǎn)成本，促進(jìn)紫花苜蓿產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料是由酒泉大業(yè)種業(yè)有限責(zé)任公司提供的‘中苜1號’紫花苜蓿種子（2019年收獲）。為了保證種子含水量的一致性，試驗前將種子含水量調(diào)整到10%［14］，再進(jìn)行引發(fā)處理，期間將種子裝入錫箔袋密封貯藏于4℃冰箱。

1.2 鹽堿溶液的配制

根據(jù)酒泉鹽堿類型選擇Na2SO4作為鹽脅迫條件，配制0，25，50，75，100，110，120，130，140和150 mmol·L-1的Na2SO4溶液以篩選出后續(xù)試驗的鹽脅迫濃度，雋偉超等［15］研究表明酒泉市邊灣農(nóng)場地區(qū)土壤pH均值為8.51，呈弱堿性，因此將配制的鹽溶液用NaOH調(diào)pH值至（8.5±0.1）。

1.3 種子引發(fā)處理

根據(jù)相關(guān)研究設(shè)計MT引發(fā)濃度為0.05，0.1和0.2 mmol·L-1［10，16-17］。選取5 g飽滿且均勻一致的紫花苜蓿種子，稱重并記錄，培養(yǎng)皿中放入3層濾紙，分別加入10 mL不同濃度的MT后撒上種子，于20℃、黑暗條件下處理6 h（記為ML6、MM6和MT6）和12 h（記為ML12、MM12和MT12），對照設(shè)置為不引發(fā)（CK1）、蒸餾水引發(fā)6 h（CK2-6）和12 h（CK2-12）。引發(fā)后的種子用蒸餾水沖洗2遍，用濾紙吸干表面水分，并在室溫下晾曬至初始重量，引發(fā)好的種子裝入密封袋于4℃貯藏。

1.4 發(fā)芽試驗及指標(biāo)測定

發(fā)芽試驗依據(jù)草種子檢驗規(guī)程（GB/T 2930.4 —2017），待發(fā)芽結(jié)束后計算發(fā)芽勢、發(fā)芽率、平均發(fā)芽時間和發(fā)芽指數(shù)，并隨機(jī)選取10株正常種苗測量種苗長、根長和幼苗鮮重，計算幼苗活力指數(shù)，具體方法和計算公式參照文獻(xiàn)［18］。

1.5 生理生化指標(biāo)的測定

根據(jù)MT引發(fā)對鹽堿脅迫下紫花苜蓿種子的發(fā)芽特性與幼苗生長能力的影響，篩選出效果最佳的處理，選取該處理的引發(fā)種子進(jìn)行發(fā)芽試驗，重復(fù)4次，在第10 d發(fā)芽結(jié)束后，從培養(yǎng)皿中隨機(jī)取出正常種苗用于酶活性分析。CAT的活性測定參照Cakmak等［19］的方法，POD的活性測定參照Kar等［20］的方法，SOD的活性測定參照Wang等［21］的方法，谷胱甘肽還原酶（GR）的活性測定參照Madamanchi等［22］的方法，單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）的活性測定參照Arrigoni等［23］的方法，抗壞血酸過氧化物酶（APX）的活性測定參照Nakano等［24］的方法，可溶性糖和淀粉含量的測定參照蒽酮法［25］。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)通過SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan’s法（Plt;0.05）進(jìn)行多重比較，采用GraphPad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度Na2SO4溶液處理對紫花苜蓿種子發(fā)芽的影響

隨著Na2SO4溶液濃度的升高，紫花苜蓿種子 "的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)呈下降趨勢，平均發(fā)芽時間呈上升趨勢；其中Na2SO4溶液為0～75 mmol·L-1時發(fā)芽率下降緩慢，鹽堿脅迫對紫花苜蓿種子的發(fā)芽影響較小； 大于75 mmol·L-1發(fā)芽率快速下降，發(fā)芽 勢隨Na2SO4溶液的增加線性下降；0～100 mmol·L-1 "Na2SO4溶液中紫花苜蓿的平均發(fā)芽時間隨濃度增加而上升，100 mmol·L-1以后平均發(fā)芽時間已經(jīng) 延長到5 d左右，不再隨著濃度的變化而顯著變化，且發(fā)芽指數(shù)隨著溶液 濃度的增加呈線性下降趨勢（圖1）。濃度小于75 mmol·L-1時鹽堿脅迫對紫花苜蓿種子的發(fā)芽影響較小，而濃度大于75 mmol·L-1 后對紫花苜蓿種子的發(fā)芽率顯著下降（Plt;0.05）。Na2SO4濃度為75 mmol·L-1時，紫花苜蓿種子的平均發(fā)芽時間被延長到3 d；綜上，選用75 mmol·L-1的Na2SO4（pH=8.5）作為后續(xù)試驗的鹽堿脅迫濃度。

2.2 MT引發(fā)對鹽脅迫紫花苜蓿種子發(fā)芽的影響

由圖2所示，與CK1相比，ML6，MT6和MT12處理后紫花苜蓿種子的發(fā)芽率顯著提高（Plt;0.05），且分別提高11%，5%和12%；發(fā)芽勢分別提高24%，9%和42%，且引發(fā)6 h的發(fā)芽勢均高于引發(fā)12 h；MT引發(fā)后種子的平均發(fā)芽時間無顯著變化，但引發(fā)6 h的發(fā)芽時間均比引發(fā)12 h短；ML6、MM6和MT6處理后顯著提高了種子的發(fā)芽指數(shù)（Plt;0.05），分別提高19%、15%和15%，其余處理無顯著變化。CK2-6和CK2-12相比于CK1種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、平均發(fā)芽時間和發(fā)芽指數(shù)都無顯著差異。綜上所述，Na2SO4脅迫下ML6和MT6處理對紫花苜蓿種子的發(fā)芽有促進(jìn)作用，而蒸餾水引發(fā)對種子發(fā)芽無較大影響。

2.3 MT引發(fā)對鹽脅迫紫花苜蓿幼苗生長的影響

由圖3所示，與CK1相比，MT引發(fā)后根長均顯著提高（Plt;0.05），ML6，MM6和MT6處理后根長分別提高35%，34%和39%；ML6處理后苗長顯著降低（Plt;0.05），MT6處理苗長提高7%；MT引發(fā)后幼苗鮮重均無顯著變化；ML6，MM6，MT6，MM12和MT12處理后幼苗活力指數(shù)均顯著提高（Plt;0.05），分別提高30%，29%，39%，24%和32%。CK2-6和CK2-12相比于CK1，幼苗根長、鮮重和活力指數(shù)均無顯著差異。綜上所述，Na2SO4脅迫下MT引發(fā)能促進(jìn)紫花苜蓿幼苗生長。

2.4 MT引發(fā)對鹽脅迫紫花苜蓿幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖4所示，所有引發(fā)處理與CK1相比，CAT活性均無顯著差異，其中MT6處理的CAT活性最高。與CK1和CK2對比，MT6處理的POD活性有顯著差異（Plt;0.05），且活性最高，較CK1提高55%。SOD活性變化中，MT6處理顯著低于CK1而高于CK2（Plt;0.05）。MT6處理的GR活性顯著高于CK（Plt;0.05），較CK1提高13%。MT6處理的MDHAR活性顯著高于CK2（Plt;0.05），且活性最高，較CK1提高5%。MT6處理的APX活性顯著高于CK（Plt;0.05），較CK1提高9%。綜上所述，Na2SO4脅迫下MT引發(fā)通過提高紫花苜蓿幼苗的抗氧化酶活性，緩解脅迫對幼苗造成的損傷。

2.5 MT引發(fā)對鹽脅迫紫花苜蓿幼苗貯藏物質(zhì)含量的影響

由圖5所示，在可溶性糖含量中，MT6引發(fā)處理均顯著低于CK1，CK2-6和CK2-12（Plt;0.05），較CK1下降了19%。淀粉含量變化中，MT6引發(fā)處理與CK相比無顯著差異。

3 討論

鹽堿土對植物最直接的影響是抑制種子萌發(fā)和幼苗生長，鹽濃度越高或堿性越強(qiáng)，種子出苗率就越低。鹽脅迫下植株矮小、葉片黃而萎縮、根短粗或卷曲、根系吸收面積縮小［1］。研究表明，鹽堿條件下種子不萌發(fā)或延緩萌發(fā)對自身是一種保護(hù)機(jī)制，在一定程度上能阻隔鹽堿對植物的傷害［26］；另一方面，種子在遭受鹽堿脅迫時，會提高CAT，SOD和POD等抗氧化酶的活性來清除體內(nèi)因脅迫而過量積累的活性氧，從而減輕鹽堿脅迫傷害［27］。但是種子對自身的保護(hù)是有限的，種子一旦長時間處于鹽堿條件下或者處于高濃度鹽堿溶液中，便會遭受致命損傷，鹽脅迫下細(xì)胞內(nèi)活性氧急劇增加，超出活性氧清除系統(tǒng)的能力，引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，種皮遭到破壞，植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能也受到影響，細(xì)胞代謝紊亂，從而抑制種子萌發(fā)甚至造成死亡。本結(jié)果研究也表明，隨著Na2SO4（pH=8.5）濃度的增加，紫花苜蓿種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)呈下降趨勢，平均發(fā)芽時間呈上升趨勢；當(dāng)Na2SO4濃度達(dá)到120 mmol·L-1時，紫花苜蓿種子的發(fā)芽率降為50%；當(dāng)Na2SO4濃度為150 mmol·L-1時，紫花苜蓿種子發(fā)芽率僅為9%。

MT是一種吲哚類化合物，在植物體參與種子萌發(fā)、根的發(fā)育、葉片衰老、清除活性氧以及提高植物對環(huán)境脅迫的適應(yīng)能力。Zhao等［28］研究表明，MT處理能有效緩解鹽堿脅迫損傷，顯著提高作物發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)。研究表明，在200 mmol·L-1鹽脅迫下，0.3 mmol·L-1MT引發(fā)紫花苜蓿種子可以提高種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、根長和株高，增強(qiáng)種子和幼苗的耐鹽堿能力［29］；也有研究表明在150 mmol·L-1鹽脅迫下，用0.05，0.07和0.1 mmol·L-1MT引發(fā)的紫花苜蓿種子能很好的緩解萌發(fā)時所受到的鹽脅迫［11］。本研究結(jié)果表明，MT6（0.2 mmol·L-1 MT引發(fā)6 h）處理與未引發(fā)（CK1） 和蒸餾水引發(fā)（CK2-6和CK2-12）相比存在顯著差異，發(fā)芽勢顯著提高。Gao等［30］研究表明，植物通過改變根系形態(tài)適應(yīng)不同逆境，主要包括根長、根表面積和體積等。本研究結(jié)果表明，在75 mmol·L-1 Na2SO4（pH=8.5）脅迫下，MT6處理的幼苗根長、苗長及活力指數(shù)顯著優(yōu)于CK1，CK2-6和CK2-12。說明MT引發(fā)能促進(jìn)紫花苜蓿種子發(fā)芽和緩解鹽脅迫對幼苗生長的抑制。這與前人的研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實MT能有效提高紫花苜蓿種子和幼苗的抗鹽堿能力［28-30］。但不同的鹽堿脅迫下，MT的有效濃度不同，這可能與鹽堿脅迫類型和紫花苜蓿品種耐鹽堿能力有關(guān)。后續(xù)可以針對不同的紫花苜蓿品種對MT耐鹽堿效果進(jìn)行研究。

MT是一種有效的抗氧化劑，可以減輕逆境條件下植物受到的氧化損傷［18，31］。因此研究MT處理種子在鹽脅迫下萌發(fā)的作用，對提高種子耐鹽堿性和促進(jìn)種子萌發(fā)有重要意義。非逆境條件下，植物體內(nèi)的活性氧代謝受酶促系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)調(diào)控而處于動態(tài)平衡［32］，受鹽堿脅迫時，植物體內(nèi)活性氧過量積累，造成氧化脅迫。POD是植物內(nèi)源活性氧消除劑，在逆境狀態(tài)下保持較高水平的POD活性，能夠抑制活性氧對植物的傷害［33-34］。研究表明，MT處理后，鹽脅迫下紫花苜蓿種子的SOD，POD和CAT活性有所提高，MT對POD活性的增強(qiáng)作用高于SOD和CAT，SOD活性變化不明顯［10-11，35］。本研究中MT6處理下幼苗的SOD活性影響不顯著，而CAT，POD，GR，MDHAR和APX活性均顯著高于CK1，CK2-6和CK2-12，其中POD提升效果最明顯。說明MT處理能夠提高紫花苜蓿的抗氧化酶活性，從而提高幼苗的耐鹽性，且MT對提高POD活性的效果最顯著。

種子貯藏的糖類可分為可溶性糖和不溶性糖，不溶性糖主要是淀粉，干種子中的糖主要以淀粉的形式貯藏，當(dāng)種子吸水萌發(fā)后開始消耗能量，可溶性糖含量呈下降趨勢，到種子萌發(fā)后期，種子貯藏的淀粉被動員，分解為可溶性糖，可溶性糖經(jīng)過代謝為種子萌發(fā)提供能量［36-38］。本試驗結(jié)果表明，MT6處理引發(fā)種子后，種子內(nèi)可溶性糖含量下降了，淀粉含量未發(fā)生顯著變化，說明引發(fā)后種子開始萌動，并開始進(jìn)行物質(zhì)合成和呼吸代謝，但還未達(dá)到吸脹后期，還未開始分解淀粉。這一結(jié)果證實了種子引發(fā)處理可以促進(jìn)種子萌發(fā)，加速種子萌發(fā)進(jìn)程，且與對照相比MT6的可溶性糖含量最低，說明0.2 mmol·L-1 MT引發(fā)6 h對紫花苜蓿種子萌發(fā)的促進(jìn)效果最好。

4 結(jié)論

在75 mmol·L-1 Na2SO4（pH=8.5）脅迫條件下紫花苜蓿種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)顯著下降（Plt;0.05）。MT引發(fā)處理通過消耗種子可溶性糖，提高POD，GR，MDHAR和APX活性，促進(jìn)種子發(fā)芽和提高幼苗耐鹽堿能力。試驗篩選出0.2 mmol·L-1 MT引發(fā)6 h處理效果最佳，能有效促進(jìn)Na2SO4脅迫下紫花苜蓿種子的發(fā)芽和幼苗生長。

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（責(zé)任編輯 劉婷婷）

收稿日期：2023-08-25；修回日期：2023-09-27

基金項目：" 耐鹽堿抗旱苜蓿種子擴(kuò)繁關(guān)鍵技術(shù)研究（2022ZD0401105）；國家農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-34）資助

作者簡介：

劉婧禹（1999-），女，漢族，內(nèi)蒙古呼和浩特人，碩士研究生，主要從事牧草種子引發(fā)和包衣技術(shù)的研究，E-mail：13789615104@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：maops@cau.edu.cn