產(chǎn)苦馬豆素的瘋草內(nèi)生真菌研究進(jìn)展

摘要： 含苦馬豆素（Swainsonine，SW）的棘豆屬（Oxytropis DC.）和黃芪屬（Astragalus L.）植物稱為瘋草，其共生著一種瘋草內(nèi)生真菌（Alternaria Section Undifilum oxytropis）。瘋草中的SW由其內(nèi)生真菌產(chǎn)生，而非由宿主植物產(chǎn)生。SW是一種吲哚里西啶類生物堿，牲畜食用瘋草后引起中毒，嚴(yán)重者死亡，對(duì)我國(guó)畜牧業(yè)危害巨大。本文對(duì)棘豆屬瘋草的分類與分布，瘋草內(nèi)生真菌的分類、分布、傳播方式及形態(tài)學(xué)差異，不同真菌中SW的合成相關(guān)酶及合成途徑的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，討論了SW合成途徑及其關(guān)鍵酶的作用，旨在為瘋草內(nèi)生真菌的研究、利用及SW合成途徑的明晰提供參考。

關(guān)鍵詞： 瘋草內(nèi)生真菌；苦馬豆素；次級(jí)代謝產(chǎn)物；棘豆屬植物；瘋草

中圖分類號(hào)：S812.8 """文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A """"文章編號(hào)： 1007-0435（2024）02-0358-11

Research Progress of Endopfyte Fungi from Locoweed Producing SW

LI Dan1，2， LU Ping1，2*， YUAN Bo1，2， DU Ling1，2， LI Yu-ling1，2，

GAO Feng1，2， JIANG Kai1，2

（1. Inner Mongolia Normal University， College of Life Science and Technology， Hohhot， Inner Mongolia 010020， China;

2. Key Laboratory of Biodiversity conservation and Sustainable utilization in Mongolian Plateau for College and University

of Inner Mongolia Autonomous Region， Hohhot， Inner Mongolia 010020， China）

Abstract： Oxytropis DC. and Astragalus L. plants，also known as locoweed，contain swainsonine （SW），an indolizidine alkaloid. The SW is produced by an endophytic fungi，Alternaria Section Undiflum oxytropis，that coexist with the locoweed，rather than by the host plant itself. Consuming of locoweed can cause poisoning in livestock， leading to death，poseing a significant threat to China′s animal husbandry. This article reviews the research progress on the classification and distribution of the locoweed of Oxytropis genus，the classification and distribution，and transmission of endophytic fungi in locoweed，the related synthesis enzymes，and the synthesis pathways of SW in different fungi. Based on existing experimental results，the synthesis pathways of SW and the roles of its key enzymes are summarized and discussed. The aim is to provide a reference for the research and utilization of locoweed endophytic fungi and to clarify of synthesis pathways of SW.

Key words： Endophytic fungi of locoweed;Swainsonine;Secondary metabolites;Oxytropis spp;Locoweed

瘋草主要指含苦馬豆素（Swainsonine，SW）的棘豆屬（Oxytropis DC.）和黃芪屬（Astragalus L.）有毒植物，在世界范圍內(nèi)對(duì)于草原畜牧業(yè)危害巨大［1-3］。SW是一種吲哚里西啶類生物堿［4］，化學(xué)名為吲哚里西啶三醇或（1S，2S，8R，8aR）-三羥基八氫吲哚里西啶，最初由Colegate等［5］在澳大利亞分布的灰苦馬豆（Swainsona canescens）植物體分離得到，中國(guó)由曹光榮等［6］首次從黃花棘豆（Oxytropis. ochrocephala）中分離出，SW的化學(xué)結(jié)構(gòu)與甘露糖相似，可與動(dòng)物細(xì)胞中的溶酶體α-甘露糖苷酶I和高爾基體甘露糖苷酶II的底物競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，從而抑制酶的活性、阻礙糖蛋白的合成與加工，并導(dǎo)致細(xì)胞空泡變性。牲畜持續(xù)食用一段時(shí)間的瘋草會(huì)中毒，產(chǎn)生一系列癥狀，如肌肉震顫、嘔吐、母畜流產(chǎn)、公畜不育及死亡［7］。后來發(fā)現(xiàn)SW具有抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移作用［8］，是一種有前景的抗腫瘤藥物。SW具有雙雜環(huán)分子結(jié)構(gòu)，有四個(gè)手性構(gòu)型，化學(xué)合成過程中易形成手性異構(gòu)體，難以分離，故化學(xué)合成的SW商品價(jià)格昂貴［8］，從生物體中提取SW值得探索。

瘋草內(nèi)生真菌與豆科棘豆屬、黃芪屬植物共生［9］，屬于鏈格孢屬（Altenaria），最初被劃在該屬，后根據(jù)其ITS序列歸在埃里格孢屬（Embellisia），又有學(xué)者提出將其歸在Undifilum，后經(jīng)分析比對(duì)其GAPDH， RPB2 和TEF1 等多個(gè)基因序列，將其歸在波浪狀芽管孢組（Undifilum）Altenaria 屬［10-11］。

本文對(duì)棘豆屬瘋草的分類與分布、瘋草內(nèi)生真菌形態(tài)學(xué)、分類、分布、傳播方式及不同真菌中SW合成途徑的進(jìn)展進(jìn)行綜述，對(duì)于明晰瘋草內(nèi)生真菌SW合成分子機(jī)制和代謝途徑，以及未來指導(dǎo)瘋草中SW的控制和利用都有重要意義。

1 棘豆屬瘋草的分類與分布

瘋草包括含SW的豆科（Leguminosae）、旋花科（Convolvulaceae）、錦葵科（Malvaceae）等植物，以豆科的棘豆屬、黃芪屬植物為主。國(guó)外多分布于美國(guó)、澳大利亞、加拿大等地，在美國(guó)西部其危害最為嚴(yán)重［12］；分布在中國(guó)的瘋草多為棘豆屬植物，全世界共有300余種棘豆屬植物［13］，美國(guó)主要有5種棘豆屬的瘋草（表1），中國(guó)的棘豆屬植物有80余種，多分布于西北、華北、東北、西南等地，已報(bào)道的中國(guó)棘豆屬瘋草植物為23種［14］，對(duì)草原危害最為嚴(yán)重的有小花棘豆（Oxytropis. glabra）、黃花棘豆（O. ochrocephala）、甘肅棘豆（Oxytropis. kansuensis）、冰川棘豆（Oxytropis. glacialis）、毛瓣棘豆（Oxytropis. sericopetata），主要分布在內(nèi)蒙古、寧夏、甘肅、陜西、青海、新疆、西藏、四川等省區(qū)的干旱和半干旱地區(qū)，具有抗旱耐寒、生命力強(qiáng)和繁殖率高等特點(diǎn)。對(duì)比其他雜草或毒草，瘋草的分布與豐度占優(yōu)勢(shì)，認(rèn)為瘋草與內(nèi)生真菌共生，從而有助于提高其抗逆性［15］；昆蟲病原真菌羅伯茨綠僵菌（Metarhizium robertsii）也產(chǎn)生SW，為宿主植物提供哌啶酸（Pepocolic acid，PA），可提升宿主植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力以及抗脅迫能力［16-20］。

2 瘋草內(nèi)生真菌的分類、分布、傳播方式及形態(tài)學(xué)差異

2.1 瘋草內(nèi)生真菌的分類

Braun等［9］最早在絹毛棘豆（O.sericea）、藍(lán)伯氏棘豆（O. lambertii）及密柔毛黃芪（Astragalus. mollisimus）等瘋草中分離到產(chǎn)SW的Alternaria 內(nèi)生真菌，后又有學(xué)者在絹毛棘豆（O.sericea）［22-25］和藍(lán)伯氏棘豆（O. lambertii）［26-27］中分離到，中國(guó)學(xué)者也從毛瓣棘豆（O. sericopetata）［28］、冰川棘豆（O. glacialis）［28］、甘肅棘豆（O. kansuensis）［29］、小花棘豆（O. glabra）［30］、黃花棘豆（O. ochrocephala）［31-32］中分離到。瘋草內(nèi)生真菌目前定義了4個(gè)種，分別是Alternaria. oxytropis［33］，Alternaria. cinereum［34］和Alternaria. fulvum［34］，以及作為模式種的Alternaria.bornmuellerii［11］。根據(jù)形態(tài)學(xué)、生理學(xué)及遺傳學(xué)證據(jù)，2014年將A. fulvum改名為Alternaria. fulva［35-36］。在中國(guó)境內(nèi)從甘肅棘豆（O. kansuensis）和小花棘豆（O. glabra）中分離出瘋草內(nèi)生真菌A. oxytropis，在國(guó)外從絹毛棘豆（O.sericea）和藍(lán)伯氏棘豆（O. lambertii）中也分離到該內(nèi)生真菌，目前在中國(guó)境內(nèi)分離到的瘋草內(nèi)生真菌都屬于A.oxytropis；在美國(guó)從密柔毛黃芪（A. mollisimus）中分離出A. cinereum；從斑莢黃芪（Astragalus. lentiginosus）中分離出A. fulvum；在澳大利亞的小冠花（Securigera varia）中分離出A. bornmuellerii。

管慧銳等［21］對(duì)24株瘋草內(nèi)生真菌的ITS序列進(jìn)行比較分析，5種從中國(guó)境內(nèi)分布的棘豆屬植物（甘肅棘豆、黃花棘豆、鐮形棘豆、毛瓣棘豆及小花棘豆）中分離的瘋草內(nèi)生真菌聚到一支，相鄰的瘋草內(nèi)生真菌并不一定源于同種宿主植物，可能與其遺傳距離與地理分布也有密切關(guān)系［37］，從相近地理位置分布的棘豆宿主植物分離到的瘋草內(nèi)生真菌相似程度更高，而地理位置較遠(yuǎn)、但從同種棘豆宿主植物分離的瘋草內(nèi)生真菌的相似程度較前種小，更近的地理距離可能遺傳距離更近。

2.2 瘋草內(nèi)生真菌的分布

在棘豆屬宿主植物生長(zhǎng)過程中，其不同部位（如莖、葉、花等）都能分離出瘋草內(nèi)生真菌［32］。Braun在美國(guó)3種瘋草種群中分離到Alternaria 屬內(nèi)生真菌，花中的感染率為100%，種子中的感染率為93.1%，葉和莖的感染率為72.9% 和 97.2%［9］。

內(nèi)生真菌在種子中定殖于種皮內(nèi)部的薄壁組織［38］，故內(nèi)生真菌只通過母體傳遞，而不在物種間傳遞。植株中菌絲體在細(xì)胞間隙間有發(fā)現(xiàn)，并且在分生組織中的菌絲體要比成熟組織中更豐富［39-40］，可能是由于分生組織利用碳源的效率高［41］。同時(shí)，地上組織中的內(nèi)生真菌水平要比地下組織中的高［42］。瘋草內(nèi)生真菌能直接吸收來自植物中氨基酸形式的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，光合作用強(qiáng)的部分，其葉綠體產(chǎn)生的可被瘋草內(nèi)生真菌吸收利用的賴氨酸（Lysine，Lys）水平更高，更適于內(nèi)生真菌的存活［43］。

2.3 瘋草內(nèi)生真菌的傳播方式

Rodriguez等［44］根據(jù)內(nèi)生真菌的傳播方式將內(nèi)生真菌分為四類：第一類是棒狀子實(shí)體內(nèi)生真菌（Clavicipitaceous endophytes），傳播方式為垂直傳播，且產(chǎn)生真菌毒素；第二、三和第四類均屬于非棒狀子實(shí)體內(nèi)生真菌（Nonclavicipitaceous endophytes）。第二類寄主范圍較廣，一般定植于根、莖和葉，能夠在植物內(nèi)形成廣泛的感染，通常情況下通過種皮或根莖進(jìn)行垂直傳播，少數(shù)情況也可水平傳播；第三類內(nèi)生真菌僅出現(xiàn)在地上組織中，通過菌絲碎裂和/或在死亡或衰老組織上產(chǎn)生有性或無性孢子進(jìn)行繁殖，孢子和菌絲碎片可以由食草動(dòng)物或昆蟲的攜帶進(jìn)行傳播，或通過風(fēng)、雨的作用進(jìn)行擴(kuò)散與繁殖。第四類主要是子囊菌，在實(shí)驗(yàn)室條件下，菌絲碎裂和分生孢子是傳播的主要途徑，不僅能侵染植株地上部分，還能侵染根部［45］。瘋草內(nèi)生真菌通過種子攜帶內(nèi)生真菌進(jìn)行垂直傳播［9，45-46］，屬于第一類。

2.4 瘋草內(nèi)生真菌A. oxytropis 的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)

目前，瘋草內(nèi)生真菌定義到的4個(gè)種，A. cinereum和A. fulvum 從黃芪屬瘋草中分離出，A. oxytropis 從棘豆屬分離出，A.bornmuellerii 從Securigera varia中分離出。從棘豆屬和黃芪屬分離出的瘋草內(nèi)生真菌形態(tài)略有不同，但從棘豆屬和Securigera varia 中分離的瘋草內(nèi)生真菌形態(tài)相似［11］。

中國(guó)境內(nèi)棘豆屬瘋草分離到的產(chǎn)SW瘋草內(nèi)生真菌均為A. oxytropis，但不同棘豆屬植物中分離到的瘋草內(nèi)生真菌菌落形態(tài)大體相同。從幾種棘豆屬瘋草中分離到瘋草內(nèi)生真菌［31，47-48］生長(zhǎng)前期都呈圓形、隆起、邊緣整齊的白色菌落，整體分布白色氣生菌絲；生長(zhǎng)中期菌體分泌黑褐色的色素物質(zhì)，菌落背面呈黑色，顏色由白色漸變?yōu)闇\灰，后灰色逐漸加深變成灰黑色；后期色素由黑色逐漸變?yōu)楹诰G色。在整個(gè)生長(zhǎng)過程中，菌落均呈輻射狀生長(zhǎng)，表面絨狀較松散，菌體內(nèi)部堅(jiān)硬。其中，從甘肅棘豆中分離到的菌落與此有所差別，菌落逐漸由白色變?yōu)榈S色、黃褐色，再變?yōu)楹诤稚?、黑色，其他形態(tài)并無顯著差別。而A.bornmuellerii 不僅在菌落形態(tài)與A. oxytropis 相似，在以其ITS1、5.8S和ITS2序列構(gòu)建的鄰接串聯(lián)進(jìn)化樹與A. oxytropis 聚到了一支，且自展值為 98%，形成了一個(gè)強(qiáng)支持的單系群，故A.bornmuellerii與A. oxytropis 從基因型到表型都極為相似，可能為同種瘋草內(nèi)生真菌。

從黃芪屬瘋草中分離到的菌株含有更多的氣生菌絲體，隨著菌落生長(zhǎng)，少部分形成硬化的菌絲體，從密柔毛黃芪中分離到的A. cinereum 通常是灰色到深灰色的，而從斑莢黃芪中分離到的A. fulvum 則是棕褐色到棕色。而在基于ITS和gpd基因序列構(gòu)建的鄰接串聯(lián)進(jìn)化樹中，A. cinereum 和A. fulvum 聚到了一支，自展值為99%。

分生孢子是菌種鑒定的重要依據(jù)。該類型瘋草內(nèi)生真菌的分生孢子大小一般為（14～70）×（5～15） μm，個(gè)別物種可達(dá)（80～90）×（5～15） μm，顏色為黃綠色至深棕色，形狀為廣橢圓形至長(zhǎng)橢圓形，兩端較尖細(xì)，表面較平滑，無顯著突起，孢子壁較厚，兩層，外壁較粗糙，有橫隔與縱隔，大多數(shù)為3～7個(gè)橫隔，0～3個(gè)縱隔，呈串珠狀或分岔排列［9-11，49］。

3 真菌中SW合成相關(guān)酶及合成途徑

3.1 酵母氨酸還原酶

酵母氨酸還原酶（Sacchropine reductase，Sac）（EC 1.5.1.10）［50］，也稱酵母氨酸脫氫酶（Sacchropine dehydrogenase，SDH），可催化α-氨基己二酸半醛生成酵母氨酸（L-saccharopine），反應(yīng)過程為：谷氨酸+α-氨基己二酸半醛+NADPH+H+酵母氨酸+NADP++H2O，反應(yīng)中酵母氨酸還原酶為雙向酶，催化正向反應(yīng)和逆向反應(yīng)所需pH不同［50］，正向反應(yīng)最適pH為7.0，逆向反應(yīng)為9.75。

在豆類絲核菌（Rhizoctonia leguminicola）、金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）及A. oxytropis 中都存在Sac酶，在R. leguminicola里L(fēng)ys合成哌啶-6-羧酸（delta-1-piperideine-6-carboxylate，P6C）時(shí)，由Lys →酵母氨酸→ α-氨基己二酸半醛的兩步反應(yīng)都由Sac酶催化［51］，；在M. anisopliae 中，酵母氨酸氧化酶（saccharopine oxidase，F(xiàn)AP2）可催化Lys合成酵母氨酸，后再由Sac酶催化合成P6C；在A. oxytropis 中這兩步是可逆反應(yīng)，正向反應(yīng)與R. leguminicola相同，見圖1。

Mukherjee等敲除A. sect. Undifilum oxytropis 中的sac基因，敲除突變株中SW水平、PA水平及P6C 水平均上升，而Lys水平和酵母氨酸水平下降，a-氨基己二酸水平未發(fā)生變化［52］；盧萍等敲除A. oxytropis OW 7.8 的sac基因，敲除突變株Δsac中SW水平、酵母氨酸水平均下降，從培養(yǎng)第14天到第45天，Δsac 的SW水平始終低于OW7.8而Lys水平變化不大［53］；此外在OW7.8和Δsac的培養(yǎng)液中添加四種前體（酵母氨酸、α-氨基己二酸、Lys和PA）后，OW7.8和Δsac的SW水平都上升，且OW7.8的SW水平始終高于Δsac［54］。推測(cè)Lys是必需氨基酸，而酵母氨酸是合成Lys過程中的中間產(chǎn)物，在Δsac中其合成受阻，為合成必需的Lys，可能發(fā)生由FAP2催化P6C 合成酵母氨酸，進(jìn)而合成Lys，故Δsac中SW水平降低，Lys水平不變，說明Sac酶促進(jìn)酵母氨酸和SW的合成［53］。該課題組又對(duì)Δsac和OW7.8進(jìn)行無參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，篩選出41個(gè)與SW合成相關(guān)的差異表達(dá)基因，其中有5個(gè)注釋到Sac酶，它們?cè)讦ac中表達(dá)均下調(diào)，也說明Sac酶促進(jìn)SW的合成［55］。

3.2 吡咯啉-5-羧酸還原酶

吡咯啉-5-羧酸還原酶（Pyrroline-5-carboxylate reductase，P5CR）是脯氨酸（Proline，Pro）生物合成通路上的一個(gè)關(guān)鍵酶［56］，在植物和微生物中主要催化吡咯啉-5-羧酸（Pyrroline-5-carboxylate，P5C）合成Pro，也將NAD（P）H氧化為NAD（P）+。在A. oxytropis 中P5CR酶催化P6C 合成SW的重要前體物PA［57-58］。

在A. oxytropis OW7.8中克隆 P5CR 基因，向培養(yǎng)基中添加PA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，添加組 P5CR 基因表達(dá)水平在23～26 d下降，在29～32 d上升并高于對(duì)照組，推測(cè)可能由于添加組前期有冗余PA，發(fā)生負(fù)反饋抑制，經(jīng)一段時(shí)間后冗余的PA被消耗，負(fù)反饋抑制解除，SW水平下降， P5CR 基因表達(dá)水平提高，而對(duì)照組中隨SW合成，發(fā)生負(fù)反饋抑制時(shí)， P5CR 基因表達(dá)水平降低，進(jìn)而SW水平也下降。提出 P5CR 基因表達(dá)促進(jìn)A. oxytropis OW7.8 中SW的合成［59］。

植物在干旱、高鹽和低溫等條件下啟動(dòng)脫落酸（Abscisic acid，ABA）合成，可增強(qiáng)其抵抗逆境的能力，ABA水平與Pro水平正相關(guān)［60］，故P5CR酶發(fā)揮作用可能與ABA調(diào)控也有關(guān)，對(duì)黃花棘豆中分離的瘋草內(nèi)生真菌（A. oxytropis）及其宿主黃花棘豆進(jìn)行全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)真菌基因組中有2個(gè)編碼P5CR酶的基因，推測(cè)其中一個(gè) P5CR 基因是SWN基因簇中的一員，其功能可能與SwnR酶相似，但在其他產(chǎn)SW真菌中并無此推論［61］。

3.3 SWN基因簇成員的編碼產(chǎn)物

Cook等［62］提出產(chǎn)SW真菌有一個(gè)共同的SWN基因簇，該基因簇共包括7個(gè)成員：swnA，swnN，swnT， swnH1，swnH2 ，swnK，swnR，在M. robertsii中負(fù)責(zé)催化由Lys到SW的生物化學(xué)反應(yīng)，在其他產(chǎn)SW真菌中負(fù)責(zé)催化由PA到SW的生物化學(xué)反應(yīng)，見表2。

產(chǎn)SW的不同類型真菌中的SWN基因簇成員的數(shù)量不同，M. robertsii、樹牽牛內(nèi)生真菌（ICE）、太田結(jié)皮菌（Arthroderma otae）和馬毛癬菌（Trichophyton equinum）中含有SWN基因簇全部7個(gè)成員，瘋草內(nèi)生真菌（A. oxytropis）和假裸囊菌屬內(nèi)生真菌（Pseudogymnoascus sp.）中有5個(gè)成員，即swnN， swnH1，swnH2 ，swnK，swnR基因，但無swnA和swnT基因。swnK和 swnH2 基因存在于在各種產(chǎn)SW真菌中［64］。swnK基因編碼一個(gè)多功能非核糖肽-聚酮合酶，有7個(gè)結(jié)構(gòu)域，催化由PA到1-酮基吲哚里西啶的多步反應(yīng)，見表3。

孫璐等［65］敲除了M. anisopliae中的swnR基因，敲除突變株中的SW水平顯著下降。Cook等［62］敲除M. robertsii 的swnK 的T結(jié)構(gòu)域基因序列，并含部分KS結(jié)構(gòu)域，敲除突變株ΔswnK 未測(cè)到SW，在基因功能互補(bǔ)株又檢測(cè)到SW；羅飛飛等［63］敲除M. robertsii的SWN基因簇7個(gè)基因，在ΔswnK、Δ swnH1、ΔswnH2 中均未測(cè)到SW，其他4個(gè)基因敲除突變株ΔswnA，ΔswnN、ΔswnR、ΔswnT 的SW水平比野生型菌株下降，下降的水平依次是ΔswnA＞ΔswnN＞ΔswnR＞ΔswnT。黃恩霞等［66］敲除了M. anisopliae中的swnK基因，敲除突變株中沒有檢測(cè)到SW。王維夫［67］敲除A.oxytropis OW 7.8的swnK 基因ACP結(jié)構(gòu)域，其敲除突變株ΔswnK-ACP中未測(cè)出SW，與M. robertsii 中敲除swnK基因?qū)W合成的影響一致［63］。

3.4 真菌中SW合成途徑

對(duì)真菌SW合成途徑的研究始于豆類絲核菌（R. Leguminicola）［51］，發(fā)現(xiàn)合成了一種吲哚里西啶類生物堿——根霉菌胺（Slaframine），有另一條支路能合成SW，之后又在M. anisopliae、M. robertsii和A. oxytropis中研究合成SW的通路。

若人為將從Lys到SW的合成途徑分為3個(gè)過程［21］，可表示如下：①由Lys到PA；②由PA到1-羥基吲哚里西啶；③由 1-羥基吲哚里西啶到SW。

目前在M. anisopliae 中推測(cè)由 Lys 到 PA 的合成過程與在 R. Leguminicola 中的稍有不同＼[51， 68＼]（圖1-A、1-B）。在 M. anisopliae 中是由 Lys "酵母氨酸氧化酶 "酵母氨酸 酵母氨酸還原酶 "P6C→PA，或由 α-氨基己二酸→ α-氨基己二酸半醛→P6C→PA；而在 M. robertsii 中由 Lys 到 PA 的過程與上述兩種真菌不同（圖1-C），是由 Lys "Lys環(huán)化脫氫酶 "PA或由Lys SwnA酶 "P6C SwnR酶 "PA；而在 A. oxytropis 中，由 Lys 到 PA 的過程較復(fù)雜（圖1-D），有兩個(gè)分支，一是由 Lys 酵母氨酸 α-氨基己二酸半醛→ P6C PA，二是由 Lys "L-Lys-α-氧化酶 ""6-氨基-2-氧己酸酯→ P2C → PA。

在 R. Leguminicola 中，由 PA 合成1-羥基吲哚里西啶的過程可能是 PA 還原環(huán)化 "1-酮基吲哚里西啶 1-酮基吲哚里西啶還原酶 "1-羥基吲哚里西啶；在M. robertsii中由PA合成1-羥基吲哚里西啶的過程與A. oxytropis中的極為相似，但與R. Leguminicola不同（圖2）；而在M. anisopliae中目前無功能實(shí)驗(yàn)證據(jù)驗(yàn)證，但鑒于其與M. robertsii同屬綠僵菌真菌，宿主是2種金龜子物種，且含SWN基因簇，推測(cè)各基因編碼的酶在合成SW的過程中發(fā)揮相同或相似作用，因此推測(cè)其中由PA→SW的過程與M. robertsii和A. oxytropis相似。

M.robertsii及A.oxytropis 中由1-羥基吲哚里西啶合成SW的過程非常相似，均為1-羥基吲哚里西啶 SwnH2酶 1，2-二羥基吲哚里西啶 SwnH1酶 SW，此過程中合成的化合物同分異構(gòu)結(jié)構(gòu)變化目前仍在研究，推測(cè)各化合物的變化情況大致相似（圖3-C、3-D）。在R.Leguminicola中該過程也與上述兩種真菌相似，發(fā)生了兩步氧化反應(yīng)，在M.anisopliae中無相關(guān)基因功能實(shí)驗(yàn)證據(jù)，但因其存在SwnH1和SwnH2兩種酶，因此推測(cè)與M.robertsii及A.oxytropis相似。

因此，在不同產(chǎn)SW真菌中SW的合成途徑不完全相同，目前在上述4種真菌中SW合成途徑研究仍需深入，部分反應(yīng)過程及所需關(guān)鍵酶需進(jìn)一步確定。

4 展望

牲畜過量食用瘋草后引起SW中毒，嚴(yán)重者死亡，對(duì)畜牧業(yè)造成巨大損失［69］，然而脫SW的黃芪屬、棘豆屬植物本身蛋白質(zhì)含量高，具有很好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［70］。苦馬豆素能抑制腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，可篩選高產(chǎn)SW的瘋草內(nèi)生真菌進(jìn)行發(fā)酵研究。瘋草內(nèi)生真菌的SW合成途徑研究還需深入，包括各種關(guān)鍵酶、調(diào)控因子和調(diào)控機(jī)制?？衫^續(xù)深入挖掘瘋草真菌基因組序列，聯(lián)合多組學(xué)分析，尋找其他SW合成相關(guān)的基因及代謝產(chǎn)物，并進(jìn)行功能分析，從而進(jìn)一步細(xì)化和完善其SW合成途徑。瘋草內(nèi)生真菌是大型絲狀真菌，其外源DNA的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化難度大，同源重組率低，故可進(jìn)行技術(shù)優(yōu)化研究，或開發(fā)基因組編輯等新技術(shù)進(jìn)行基因功能研究。

本課題組目前正在進(jìn)行小花棘豆內(nèi)生真菌A. oxytropis OW7.8 中SW合成途徑及其合成相關(guān)基因的研究，克隆了所有的SWN基因簇成員和 P5CR 基因，構(gòu)建和篩選了這6個(gè)基因的敲除突變株，后續(xù)將檢測(cè)敲除突變株和野生株的SW的水平，并結(jié)合基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)等多組學(xué)相關(guān)分析，深入研究相關(guān)基因功能，進(jìn)而明晰在A. oxytropis OW7.8 中SW的生物合成途徑。

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（責(zé)任編輯 彭露茜）

收稿日期：2023-10-23；修回日期：2023-11-28

基金項(xiàng)目： "國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31460235、31960130）；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2022MS03014）；內(nèi)蒙古師范大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助（2022JBTD010）資助

作者簡(jiǎn)介：

李丹（1997-），女，漢族，內(nèi)蒙古呼和浩特人，碩士研究生，主要從事內(nèi)生真菌中次生代謝途徑研究，E-mail： 17695475658@163.com；*通信作者Author for correspondence， E-mail： luping@imnu.edu.cn