金標(biāo)記免疫共振散射光譜法測(cè)定牛初乳中免疫球蛋白G

劉梯樓，孫雙姣

（邵陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，湖南 邵陽 422000）

牛初乳中免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）能夠與病原微生物及毒素等抗原結(jié)合，形成抗體，同時(shí)促進(jìn)哺乳動(dòng)物新生幼仔自身免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟，保護(hù)其免受病原侵襲。因此，IgG的含量是評(píng)價(jià)牛初乳制品品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)[1]，它的測(cè)定在牛初乳產(chǎn)品檢驗(yàn)中具有重要意義。牛初乳IgG含量主要檢測(cè)方法有瓊脂免疫單擴(kuò)散法[2]、瓊脂免疫雙擴(kuò)散法[3]、高效液相色譜法[4]、免疫比濁法[5]，免疫共振散射法[6]等。其中，瓊脂免疫單、雙擴(kuò)散法檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、測(cè)定誤差大、檢測(cè)結(jié)果滯后；高效液相色譜儀器色譜要求較高；免疫比濁法靈敏度較低，檢測(cè)限為70 μg/mL[5]。共振散射光譜分析具有靈敏度高和簡(jiǎn)便快速等特點(diǎn)[7-8]，但由于免疫復(fù)合物具有一定的水溶性，共振散射強(qiáng)度較弱，直接利用免疫復(fù)合物微粒的共振散射來測(cè)定IgG，靈敏度只提高為1.1μg/mL[6]。 膠體金標(biāo)記技術(shù)因具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、無污染等特點(diǎn)，已成為第四大免疫標(biāo)記新技術(shù)[9]。已知金納米微粒粒徑較小時(shí)，共振散射強(qiáng)度較弱，當(dāng)其粒徑增大時(shí)，共振散射強(qiáng)度明顯增大[10]，但共振散射峰的位置不發(fā)生變化[11]。羊抗牛IgG與牛IgG的反應(yīng)具有較高的選擇性，生成的免疫復(fù)合物的共振散射較弱，直接來測(cè)定IgG的靈敏度較低。金溶膠的光散射與金顆粒的大小密切相關(guān)，一旦顆粒大小發(fā)生變化，光散射也隨之發(fā)生變化[12]。在金標(biāo)羊抗牛IgG體系中，羊抗牛IgG分子牢固地結(jié)合在金顆粒的表面，當(dāng)牛IgG與羊抗牛IgG發(fā)生特異性反應(yīng)后，適當(dāng)粒徑的金顆粒裸露出來，聚集形成了較大的金顆粒導(dǎo)致體系的共振散射增強(qiáng)。牛IgG在一定濃度范圍內(nèi)隨著其濃度的增加，釋放的金顆粒越多，金顆粒聚集的程度越強(qiáng)，共振散射強(qiáng)度線性增強(qiáng)，據(jù)此可建立IgG的免疫共振散射光譜分析法。本文將牛IgG抗體用金納米標(biāo)記后，在一定條件下IgG抗體與IgG發(fā)生免疫發(fā)應(yīng)，導(dǎo)致金納米發(fā)生聚集，通過測(cè)其580 nm處共振散射強(qiáng)度變化，可以間接地測(cè)定IgG的濃度，由于IgG的濃度是通過金納米的共振散射間接表達(dá)出來的，所以極大地提高了檢測(cè)的靈敏度。

1 材料與方法

1.1 材料

HAuCl4（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司），牛IgG（上海午立生物技術(shù)公司），羊抗牛IgG（上海午立生物技術(shù)公司），Tris-HCl緩沖溶液，聚已二醇20000（PEG-20000），質(zhì)量濃度分別為1.00%與10.00%的檸檬三鈉和 KCl溶液，0.20 mol/L的K2CO3，0.10 mol/L的HCl，所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

RF-540型熒光分光光度計(jì)（日本島津）；79-1磁力加熱攪拌器（江蘇中大儀器廠）；SK8200LH超聲波反應(yīng)器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；H-600型透射電鏡（日本電子株式會(huì)社）。

1.2 方法

1.2.1 膠體金標(biāo)羊抗牛IgG的制備 （1）金溶膠的制備與鑒定。膠體金由檸檬酸鈉改良法[13]制備，并用透射電鏡進(jìn)行表征。（2）羊抗牛IgG在標(biāo)記前用透析袋放置在含0.005%NaCl的二次蒸餾水中透析30 h，以除去多余的電解質(zhì)。（3）確定納米金標(biāo)記羊抗牛IgG的最佳pH值。利用共振散射方法試驗(yàn)了不同pH對(duì)于膠體金標(biāo)記的影響：將膠體金調(diào)節(jié)至不同的pH值后各取1 mL加入25 μg羊抗牛IgG，混勻，放置5 min，加入0.1 mL 10%KCl，混勻后放置2 h，稀釋至3 mL，測(cè)580 nm處的共振散射強(qiáng)度（儀器參數(shù)：低靈敏檔，縱坐標(biāo)為6）。（4）膠體金與待標(biāo)羊抗牛IgG用量比的確定。分別取羊抗牛 IgG 5，10，15，20，25，30，35，40，45，50 μg 加到1 mL pH為8.5的膠體金溶液中，另取一管不加羊抗牛IgG為對(duì)照管，混勻，5 min后均加入0.1 mL10%KCl溶液，混勻后靜置2 h，稀釋至3 mL，取適量測(cè)定各管580 nm處的共振散射強(qiáng)度（儀器參數(shù)：低靈敏檔，縱坐標(biāo)為6）。（4）膠體金與待標(biāo)羊抗牛IgG用量比的確定。分別取羊抗牛IgG 5，10，15，20，25，30，35，40，45，50 μg 加到 1 mL pH為8.5的膠體金溶液中，另取一管不加羊抗牛IgG為對(duì)照管，混勻，5 min后均加入0.1 mL 10%KCl溶液，混勻后靜置2 h，稀釋至3 mL，取適量測(cè)定各管580 nm處的共振散射強(qiáng)度（儀器參數(shù)：低靈敏檔，縱坐標(biāo)為6）。（5）金標(biāo)記羊抗牛IgG的制備。用0.2 mol/L的K2CO3，0.1 mol/L的HCl和精密pH試紙將3.0 mg羊抗牛IgG溶液的pH值調(diào)至8.5；100 mL的膠體金溶液的pH值也調(diào)至8.5。在磁力攪拌下，將調(diào)好pH值的羊抗牛IgG溶液加入到100 mL的膠體金中，控制滴加時(shí)間為5 min，然后再加入1.75 mL 3%的PEG-20000作為穩(wěn)定劑[12]，攪拌15 min，放置4℃保存。

1.2.2 金標(biāo)羊抗牛IgG免疫共振散射光譜法測(cè)定依次移取0.50 mL pH值為7.0的Tris-HCl緩沖溶液，0.3 mL的金標(biāo)羊抗牛IgG溶液，一定量牛IgG溶液，0.50 mL 300 mg/mL PEG-20000于10 mL刻度試管中，用蒸餾水定容至3 mL，混勻，室溫下在59KHZ超聲波反應(yīng)器中溫浴25 min。取適量移入石英池中，置熒光分光光度計(jì)上，用低靈敏檔，縱坐標(biāo)為6，同步掃描激發(fā)波長(zhǎng)λex和發(fā)射波長(zhǎng)λem（λex＝λem），得到體系的共振散射光譜，測(cè)定580 nm波長(zhǎng)處的共振散射光強(qiáng)度IRS。不加牛IgG作空白，測(cè)其共振散射光強(qiáng)度（IRS）b，計(jì)算△I＝IRS－（IRS）b。

1.2.3 樣品及回收率的測(cè)定 設(shè)4個(gè)處理，處理1和處理2為牛初乳粉，處理3為牛初乳咀嚼片，處理4為牛初乳復(fù)合膠囊。準(zhǔn)確稱取各種牛初乳制品0.0100 g，用pH 7.0的 Tris-HCl緩沖液配制成0.100 mg/mL的樣品溶液，搖勻。12000 r/min離心30 min，取上層清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，取50 μL，按1.2.2方法進(jìn)行樣品測(cè)定。對(duì)4種含不同濃度的樣品，分別加入IgG標(biāo)準(zhǔn)液后測(cè)定IgG的含量，并計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體金標(biāo)羊抗牛IgG的制備

2.1.1 金溶膠的制備與鑒定 如圖1所示，金納米粒徑均勻，平均大約為9 nm，且分散性好。

2.1.2 納米金標(biāo)記羊抗牛IgG的最佳pH值的確定 由表1可以看出，當(dāng)pH值小于8.5時(shí)，所加的羊抗牛IgG不能穩(wěn)定膠體金，加入KCl溶液后（因用檸檬酸納改良法制備的膠體金加NaCl后不會(huì)發(fā)生聚集），金溶膠發(fā)生了聚集，共振散射強(qiáng)度較大；當(dāng)pH值為8.5時(shí)，由于蛋白質(zhì)包裹了膠體金。KCl溶液不能使被包裹的膠體金聚集，體系具有最小的共振散射強(qiáng)度。因此，實(shí)驗(yàn)選擇將膠體金用0.2 mol/L的K2CO3，0.1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)至pH值為8.5。

表1 不同pH值對(duì)于膠體金標(biāo)記的影響

2.1.3 膠體金與待標(biāo)羊抗牛IgG用量比的確定由表2可以看出，對(duì)照管和加入羊抗牛IgG的量為5～25 μg的各管共振散射強(qiáng)度較大，而加入羊抗牛IgG為30～50 μg的各管共振散射強(qiáng)度較小且維持穩(wěn)定，因此，30 μg為穩(wěn)定1 mL膠體金溶液的最低羊抗牛IgG用量，也就是金標(biāo)記羊抗牛IgG的最低用量。選取30 μg為實(shí)際的羊抗牛IgG的用量，標(biāo)記100 mL的金溶膠加入量為3.0 mg。

表2 不同羊抗牛IgG對(duì)于膠體金標(biāo)記的影響

2.2 共振散射光譜

金標(biāo)記羊抗牛IgG在340，470，580 nm處有3個(gè)共振散射峰（圖2），但共振散射強(qiáng)度較弱，隨著牛IgG的加入，共振散射強(qiáng)度逐漸加強(qiáng)，體系在580 nm處的共振散射峰增強(qiáng)尤為明顯。實(shí)驗(yàn)選取波長(zhǎng)為580 nm進(jìn)行測(cè)定。

2.3 共振散射光譜法實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.3.1 pH值、緩沖溶液種類及用量的選擇 實(shí)驗(yàn)考察了體系pH（6～8.5）對(duì)△IRS的影響。研究表明，隨著體系pH的增加，IRS、（IRS）b都增強(qiáng)。當(dāng)pH值為7.0時(shí)，△IRS相對(duì)較大。實(shí)驗(yàn)選取pH值為7.0。用3種不同pH值為7.0的緩沖溶液（Tris-HCl，Na2HPO4-NaH2PO4，巴比妥鈉-HCl）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，Tris-HCl緩沖溶液的靈敏度最高，Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液的效果最差。本實(shí)驗(yàn)選取的緩沖溶液為Tris-HCl緩沖溶液。研究表明，當(dāng)Tris-HCl緩沖溶液的用量為0.5 mL時(shí)，△IRS有最大值。本實(shí)驗(yàn)選取緩沖溶液的用量為0.5 mL。

2.3.2 不同分子量聚乙二醇濃度的影響 聚乙二醇（PEG）用于免疫復(fù)合物的測(cè)定[14]。當(dāng)膠體金的濃度較低時(shí)，較高濃度的PEG可以促使膠體金聚集，使膠體金的共振散射特征峰強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。研究了PEG-4000、PEG-6000、PEG-10000、PEG-20000 用量對(duì)于△IRS的影響，如圖3所示（0.3 mL金標(biāo)羊抗牛IgG-0.5 mLpH 7.0 Tris-HCl緩沖液-0.266 μg/mL牛IgG-PEG），幾種PEG在一定程度上對(duì)△IRS具有增敏作用，其中PEG-20000的為50 mg/mL時(shí)，其△IRS具有最大值，故實(shí)驗(yàn)選取50 mg/mL的PEG-20000。

2.3.3 金標(biāo)羊抗牛IgG用量的影響 考察了金標(biāo)羊抗牛IgG用量對(duì)△IRS的影響，結(jié)果（圖4）表明，當(dāng)金標(biāo)羊抗牛IgG用量為0.3 mL時(shí)，體系的△IRS最大，本文選取的金標(biāo)羊抗牛IgG用量為0.3 mL。

圖4 金標(biāo)羊抗牛IgG體積用量的影響

2.3.4 溫度與時(shí)間的影響 在37℃水浴條件下，反應(yīng)能較快地進(jìn)行，明顯地縮短反應(yīng)時(shí)間，結(jié)果比較穩(wěn)定。在室溫（25℃）條件下，反應(yīng)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，且溫度易受氣候的影響，結(jié)果不太穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)選擇了在37℃水浴條件下進(jìn)行，考察了反應(yīng)時(shí)間（0～60 min）對(duì)△IRS的影響。結(jié)果表明，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為25 min時(shí)，反應(yīng)已進(jìn)行完全，△IRS值趨于穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)選擇反應(yīng)時(shí)間為25 min.。

2.4 線性關(guān)系

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，分別取不同濃度牛IgG標(biāo)準(zhǔn)液，按1.2.2方法進(jìn)行測(cè)定，并以其共振散射強(qiáng)度△IRS與牛IgG濃度ρ作圖。牛IgG濃度在0.0133～1.33 μg/mL范圍內(nèi)與△IRS之間存在良好的線性關(guān)系。回歸方程為△IRS=117.54 ρ+1.2293，相關(guān)系數(shù)為 0.9968，檢出限為 0.00795 μg/mL。

2.5 共存物質(zhì)的影響

免疫反應(yīng)具有特異性，干擾其測(cè)定的物質(zhì)較少。按1.2.2方法考察了一些蛋白質(zhì)對(duì)測(cè)定0.266μg/mL牛IgG的影響。結(jié)果表明，當(dāng)相對(duì)誤差在5%的范圍之內(nèi)，200 μg/mL的人免疫球蛋白，500 μg/mL 的人血清白蛋白，200 μg/mL 的鼠 IgG，1200 μg/mL的牛血清白蛋白不干擾測(cè)定，由此可見，本法具有較高的選擇性。

2.6 樣品及回收率的測(cè)定

如表4所示，分別測(cè)定了4個(gè)樣品中牛IgG的濃度，連續(xù)做5個(gè)平行樣，樣品溶液濃度的RSD的范圍為：1.37%～2.30%，測(cè)定的重復(fù)性良好。

表4 樣品分析

由表5可知，該方法測(cè)定IgG的回收率為98.03%～103.28%。

表5 回收率的測(cè)定

3 討論與結(jié)論

液相金納米微粒具有一系列特殊的物理化學(xué)性質(zhì)，在生物探針、光譜分析和電化學(xué)分析中得到了應(yīng)用。本研究將液相金納米微粒的共振散射效應(yīng)與免疫反應(yīng)有機(jī)地結(jié)合起來，建立了一個(gè)測(cè)定牛初乳IgG的免疫共振散射光譜分析新方法。通過對(duì)4個(gè)樣品的測(cè)定，方法的重現(xiàn)性好，回收率收率為98.03%～103.28%，由此可見，該法具有較高的靈敏度和選擇性，可應(yīng)用于試樣分析。

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