潤肺益腎飲對肺癌荷瘤大鼠的抑瘤作用和腫瘤免疫微環(huán)境的影響

摘要：目的 探討潤肺益腎飲對肺癌荷瘤大鼠的抑瘤作用和腫瘤免疫微環(huán)境的影響。方法 將Lewis肺癌細(xì)胞接種于大鼠右季肋部皮下建立肺癌大鼠模型，隨機分為模型組、潤肺益腎飲低劑量（潤肺益腎飲-L）組（3.5 g/kg）、潤肺益腎飲中劑量（潤肺益腎飲-M）組（7.0 g/kg）、潤肺益腎飲高劑量（潤肺益腎飲-H）組（14.0 g/kg）以及陽性藥組（6 mg/kg順鉑），并以正常大鼠為對照組；干預(yù)結(jié)束后，計算各組大鼠肺指數(shù)、脾臟指數(shù)及抑瘤率；收集血液，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清中轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β、白細(xì)胞介素（IL）-2、γ干擾素（IFN-γ）水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血T淋巴細(xì)胞亞群；分離肺腫瘤組織，HE染色檢測其病理學(xué)變化，Western blot檢測腫瘤組織程序性死亡受體1（PD-L1）和B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）表達(dá)。結(jié)果 與對照組相比，模型組病理損傷嚴(yán)重，肺指數(shù)、TGF-β、CD8+、PD-L1、Bcl-2表達(dá)水平升高，脾指數(shù)、IL-2、IFN-γ、CD3+、CD4+及CD4+/CD8+降低（P＜0.05）；與模型組相比，潤肺益腎飲-L組、潤肺益腎飲-M組、潤肺益腎飲-H組病理損傷逐漸得到改善，肺指數(shù)、瘤質(zhì)量、CD8+、TGF-β、PD-L1、Bcl-2表達(dá)水平降低，脾指數(shù)、IL-2、IFN-γ、CD3+、CD4+及CD4+/CD8+升高（P＜0.05）；潤肺益腎飲-H組各指標(biāo)與陽性藥組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 潤肺益腎飲可顯著抑制肺癌荷瘤大鼠的腫瘤生長，改善腫瘤免疫微環(huán)境。

關(guān)鍵詞：癌，Lewis肺；腫瘤微環(huán)境；潤肺益腎飲；抑瘤

中圖分類號：R734.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20230694

The anti-tumor effect of Runfei Yishen drink on lung cancer bearing rats and its impact on tumor immune microenvironment

ZHANG Caidie， JIN Yan， ZHANG Dede

Emergency Department， Wuhan Hospital of Traditional Chinese Medicine， Wuhan 430014， China

Abstract： Objective To explore the anti-tumor effect of Runfei Yishen drink on lung cancer bearing rats and its impact on tumor immune microenvironment. Methods A lung cancer rat model was established by injecting Lewis lung cancer cells subcutaneously into right quarter rib of rats， and model rats were randomly divided into the model group， the low dose Runfei Yishen drink （Runfei Yishen drink-L） group （3.5 g/kg）， the medium dose Runfei Yishen drink （Runfei Yishen drink-M） group （7.0 g/kg）， the high dose Runfei Yishen drink （Runfei Yishen drink-H） group （14.0 g/kg） and the positive drug group （6 mg/kg cisplatin）. Normal rats were used as the control group. After the intervention， lung index， spleen index and tumor inhibition rate of rats were calculated in each group. Blood samples were collected， and serum levels of transforming growth factor-β （TGF-β）， interleukin （IL）-2 and interferon g （IFN-g） were detected by ELISA. T lymphocyte subsets in peripheral blood were detected by flow cytometry. Lung tumor tissue was isolated and its pathological changes were detected by HE staining. The expression levels of programmed death receptor 1 （PD-L1） and B-lymphoblastoma-2 （Bcl-2） were detected by Western blot assay. Results Compared with the control group， the pathological injury of the model group was serious， the lung index， TGF-β， CD8+， and the expression levels of PD-L1 and Bcl-2 were increased， and the spleen index， IL-2， IFN-γ， CD3+， CD4+ and CD4+/CD8+ were decreased （P＜0.05）. Compared with the model group， the pathological damage of the Runfei Yishen drink-L group， the Runfei Yishen drink-M group and the Runfei Yishen drink-H group gradually improved， the lung index， tumor weight， CD8+， TGF-β and the expression levels of PD-L1 and Bcl-2 were decreased， and spleen index， IL-2， IFN-γ， CD3+， CD4+ and CD4+/CD8+ were increased （P＜0.05）. There were no significant differences in above indexes between the Runfei Yishen drink-H group and the positive drug group （P＞0.05）. Conclusion Runfei Yishen drink can obviously inhibit tumor growth and improve the tumor immune microenvironment in lung cancer bearing rats.

Key words： carcinoma， Lewis lung; tumor microenvironment; Runfei Yishen drink; tumor suppression

肺癌分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其中后者占所有肺癌的80%～85%［1］。目前肺癌的常規(guī)治療方法包括手術(shù)、化療、放療和靶向治療等。肺癌患者確診時多處于中晚期，已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和局部侵襲。而晚期肺癌患者對常規(guī)治療反應(yīng)較差，5年生存率不足15%［2-3］。因此尋找有效的治療藥物對于抑制腫瘤生長，改善患者預(yù)后意義重大。研究顯示，中草藥在腫瘤治療領(lǐng)域具有多靶點、不良反應(yīng)少的優(yōu)勢，應(yīng)用前景較好［4］。潤肺益腎飲是由西洋參、茯苓、冬蟲夏草、枸杞、紅參等構(gòu)成，具有補腎益精、固肺防感等藥理作用，無明顯不良反應(yīng)，對治療慢性阻塞性肺疾病療效顯著［5］，但其在治療肺癌方面尚鮮見報道。鑒于中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境方面起關(guān)鍵作用，而腫瘤免疫微環(huán)境又在腫瘤形成過程中發(fā)揮重要作用［6-7］，因此關(guān)注中醫(yī)藥對腫瘤免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)，可為藥物應(yīng)用于腫瘤的臨床治療提供依據(jù)。本研究旨在探討潤肺益腎飲對肺癌荷瘤大鼠的抑瘤作用和腫瘤免疫微環(huán)境的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細(xì)胞及動物 Lewis肺癌細(xì)胞系由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供，將細(xì)胞維持在含有10% FBS和1%青霉素/鏈霉素RPMI-1640培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。60只雄性Wistar大鼠，7周齡，體質(zhì)量200～230 g，購自導(dǎo)科醫(yī)藥技術(shù)（廣東）有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2022-0060。大鼠飼養(yǎng)于動物飼養(yǎng)房，室內(nèi)溫度保持在（22±2）℃，大鼠自由獲取食物、水。本研究已獲得動物護(hù)理和使用委員會的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：H20220604）。

1.1.2 實驗試劑 潤肺益腎飲為武漢市中醫(yī)醫(yī)院制劑；順鉑注射液購自南京制藥廠有限公司；轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β、白細(xì)胞介素（IL）-2、γ干擾素（IFN-γ）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELSIA）試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；兔抗鼠程序性死亡受體1（PD-L1）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）一抗及羊抗兔二抗購自Abcam公司；CD4+、CD8+抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；CD3+抗體購自江蘇親科生物研究中心有限公司。電子精密天平購自Sartorius公司；ELX800酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司。

1.2 方法

1.2.1 肺癌荷瘤大鼠模型的制備及干預(yù) 按隨機數(shù)字表法抽取大鼠制備肺癌荷瘤大鼠模型［8］：取對數(shù)生長期的Lewis肺癌細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，取0.2 mL（2×106個）細(xì)胞懸液接種于大鼠右季肋部皮下，4 d后觀察大鼠腫瘤生長狀況，有明顯的腫瘤包塊標(biāo)志造模成功。將造模成功的50只大鼠依據(jù)隨機數(shù)字表法分為模型組、潤肺益腎飲低劑量（潤肺益腎飲-L）組、潤肺益腎飲中劑量（潤肺益腎飲-M）組、潤肺益腎飲高劑量（潤肺益腎飲-H）組和陽性藥組，并以正常大鼠作為對照組，每組10只。其中潤肺益腎飲-L組、潤肺益腎飲-M組、潤肺益腎飲-H組參考換算給藥劑量［9］分別給予大鼠3.5、7.0、14.0 g/kg潤肺益腎飲灌胃（相當(dāng)于體質(zhì)量60 kg成人每日用量的3、6、12倍），同時腹腔注射等量生理鹽水；陽性藥組給予6 mg/kg順鉑腹腔注射干預(yù)［10］，同時灌胃等量生理鹽水；模型組及對照組灌胃和腹腔注射等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥7 d。

1.2.2 樣本收集及肺指數(shù)、脾臟指數(shù)檢測 末次干預(yù)后24 h，各組稱取體質(zhì)量，腹主動脈采血2 mL，頜下靜脈采血1 mL，于4 ℃冰箱冷藏備用。然后腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠，立即脫頸處死、解剖大鼠，暴露胸腔和腹部，取出肺、脾，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。肺指?shù)和脾臟指數(shù)以組織質(zhì)量/體質(zhì)量表示。

1.2.3 ELISA檢測各組大鼠血清中TGF-β、IL-2、IFN-γ水平 將1.2.2收集的1 mL大鼠頜下靜脈血靜置30 min，3 000×g離心10 min后取上清液，按照試劑盒說明書檢測血清TGF-β、IL-2、IFN-γ水平。

1.2.4 外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測 取1.2.2收集的2 mL腹主動脈血，用PBS稀釋，使用密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞，PBS洗滌后重懸，加入含10 μL CD3+、CD4+、CD8+單抗的離心管中，之后以紅細(xì)胞裂解液混勻，孵育10 min，3 000×g離心10 min后取沉淀，固定并重懸后，分析T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+占比，并計算CD4+/CD8+。

1.2.5 大鼠瘤質(zhì)量及抑瘤率 取出肺臟中的瘤塊，稱質(zhì)量，計算抑瘤率。抑瘤率=（模型組平均瘤質(zhì)量-用藥組平均瘤質(zhì)量）/模型組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.2.6 HE染色觀察肺腫瘤組織病理學(xué)變化 取部分肺腫瘤組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，梯度乙醇脫水、固定后，進(jìn)行常規(guī)連續(xù)切片（厚度5 μm），經(jīng)HE染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病變情況。

1.2.7 Western blot檢測肺組織中PD-L1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平 將剩余肺腫瘤組織用裂解液勻漿、離心，取上清液采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取60 μg蛋白上樣，經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（恒壓120 V）分離，以0.65 mA/cm2的電流將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加PD-L1、Bcl-2抗體（1∶1 000稀釋），4 ℃過夜，第2日用羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗室溫孵育2 h，然后用ECL化學(xué)發(fā)光劑分析蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 27.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以[x] ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺指數(shù)、脾臟指數(shù)比較 與對照組相比，模型組肺指數(shù)增加，脾臟指數(shù)降低（P＜0.05）；與模型組相比，潤肺益腎飲-L組、潤肺益腎飲-M組、潤肺益腎飲-H組肺指數(shù)降低，脾臟指數(shù)增加，呈劑量依賴性（P＜0.05）；潤肺益腎飲-H組與陽性藥組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 各組大鼠血清中TGF-β、IL-2水平比較 與對照組相比，模型組TGF-β水平升高，IL-2、IFN-γ水平降低（P＜0.05）；與模型組相比，潤肺益腎飲-L組、潤肺益腎飲-M組、潤肺益腎飲-H組TGF-β水平降低，IL-2、IFN-γ水平升高，呈劑量依賴性（P＜0.05）；潤肺益腎飲-H組與陽性藥組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

2.3 各組外周血T淋巴細(xì)胞亞群變化比較 與對照組相比，模型組CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平降低，CD8+水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，潤肺益腎飲-L組、潤肺益腎飲-M組、潤肺益腎飲-H組CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平升高，CD8+水平降低，呈劑量依賴性（P＜0.05）；潤肺益腎飲-H組與陽性藥組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

2.4 各組大鼠瘤質(zhì)量及抑瘤率變化比較 與模型組相比，潤肺益腎飲-L組、潤肺益腎飲-M組、潤肺益腎飲-H組瘤質(zhì)量降低，呈劑量依賴性（P＜0.05）；潤肺益腎飲-L組、潤肺益腎飲-M組、潤肺益腎飲-H組抑瘤率逐步升高（P＜0.05）；潤肺益腎飲-H組與陽性藥組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

2.5 各組大鼠肺腫瘤組織病理學(xué)變化比較 對照組無顯著病理學(xué)變化；模型組炎性細(xì)胞浸潤嚴(yán)重；潤肺益腎飲-L組、潤肺益腎飲-M組、潤肺益腎飲-H組病變程度依次減輕；其中潤肺益腎飲-H組與陽性藥組病變程度相似，見圖1。

2.6 各組大鼠肺組織中PD-L1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較 與對照組相比，模型組PD-L1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，潤肺益腎飲-L組、潤肺益腎飲-M組、潤肺益腎飲-H組PD-L1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，呈劑量依賴性（P＜0.05）；潤肺益腎飲-H組與陽性藥組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2、表3。

3 討論

肺癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，是全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一［11］。目前雖然肺癌治療方法提高了部分患者的生存率，但肺癌患者的總體生存率仍很低［12］。因此，篩選治療肺癌的新型藥物非常重要。

中醫(yī)藥在改善預(yù)后方面具有潛在的治療價值［13］。中醫(yī)認(rèn)為肺癌以氣陰兩虛證、肺脾氣虛為主，臨床癥狀主要是胸悶、咳嗽、氣短為主，其藥物的選用要以化痰止咳藥、清熱藥、活血化瘀、補虛藥為首［14］。潤肺益腎飲由西洋參、茯苓、冬蟲夏草、枸杞子、紅參等構(gòu)成；其中，紅參具有補脾益肺、大補元氣之功效；冬蟲夏草則可補肺止咳平喘、補精益髓；枸杞補腎陰、茯苓健脾祛濕，兩者結(jié)合可補腎陰、益精氣；西洋參清熱生津，益精養(yǎng)血，諸藥結(jié)合，通過調(diào)節(jié)免疫功能，抑制肺部疾病發(fā)展［15-16］。本研究采用右季肋部皮下接種Lewis肺癌細(xì)胞的方法制備肺癌模型，結(jié)果顯示，模型組大鼠炎性細(xì)胞浸潤，肺指數(shù)顯著增加，脾臟指數(shù)顯著降低，與既往研究報道［17］類似，提示肺癌大鼠模型構(gòu)建成功。經(jīng)不同劑量潤肺益腎飲干預(yù)后，其病理損傷得到改善，肺指數(shù)顯著降低，脾臟指數(shù)顯著增加，抑瘤率增加，且呈劑量依賴性，表示潤肺益腎飲具有抑制腫瘤生長的作用，且高劑量潤肺益腎飲的抑制效果更好，且與陽性藥順鉑的作用相近。

腫瘤微環(huán)境由免疫細(xì)胞、非免疫基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白組成，是腫瘤生長、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移以及抗腫瘤免疫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，被視為腫瘤的“第七大標(biāo)記性特征”［18］。研究表明，免疫檢查點分子（PD-L1）和免疫細(xì)胞（CD3+、CD4+、CD8+）可作為腫瘤微環(huán)境的標(biāo)志物，其中CD4+/CD8+值變化可以作為監(jiān)測免疫狀態(tài)的指標(biāo)；而PD-L1可結(jié)合T細(xì)胞表面受體，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)生免疫逃逸［19］。T細(xì)胞Treg細(xì)胞因子可產(chǎn)生TGF-β等細(xì)胞因子，有助于腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲［10］。IL-2是T細(xì)胞在體外長期生長所必需的因子，在抗腫瘤免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用［20］。IFN-γ是反映T細(xì)胞功能的指標(biāo)，對細(xì)胞免疫應(yīng)答具有促進(jìn)作用［21］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠TGF-β、PD-L1、Bcl-2表達(dá)水平增加，IL-2、IFN-γ、CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平顯著降低，CD8+水平顯著增加，與王宏君等［22］的研究一致，提示肺癌大鼠免疫功能紊亂；而經(jīng)不同劑量潤肺益腎飲干預(yù)后，可逆轉(zhuǎn)上述指標(biāo)變化，提示潤肺益腎飲能夠改善肺癌大鼠免疫系統(tǒng)功能，減輕肺癌病理損傷，且劑量越高改善效果越好；高劑量潤肺益腎飲對上述指標(biāo)的作用與陽性藥順鉑相近，均能改善肺癌大鼠的免疫功能，抑制相近腫瘤組織生長。既往研究顯示，順鉑通過激活ERK通路調(diào)控PD-L1表達(dá)［23］。故本研究推測潤肺益腎飲可能亦可通過ERK通路抑制PD-L1表達(dá)，但這需要進(jìn)一步研究證實。

綜上所述，潤肺益腎飲可通過改善肺癌荷瘤大鼠腫瘤免疫微環(huán)境，抑制腫瘤生長，可能與下調(diào)PD-L1表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)，但其機制有待進(jìn)一步研究。

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基金項目：武漢市科學(xué)技術(shù)局2022年度知識創(chuàng)新專項項目（2022020801020587）

作者單位：武漢市中醫(yī)醫(yī)院急診科（郵編430014）

作者簡介：張彩蝶（1989），女，主治醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療腫瘤方面研究。E-mail：fwn0iaf@163.com

（本文編輯 陳麗潔）