ADAM8的表達對急性酒精性肝損傷小鼠的影響

摘要：目的 探究CRISPR/Cas9技術(shù)靶向抑制去整合素-金屬蛋白酶8（ADAM8）在小鼠急性酒精性肝損傷中的作用及分子機制。方法 18只6～8周齡健康雌性昆明小鼠根據(jù)隨機數(shù)字表法分為正常組、酒精組和質(zhì)粒組，每組6只。正常組不做處理，質(zhì)粒組采用水流動力學注射法尾靜脈注射利用CRISPR/Cas9技術(shù)抑制ADAM8基因的三合一重組質(zhì)粒ADAM8-sgRNA3（3 g/kg），酒精組尾靜脈注射等量生理鹽水。酒精組和質(zhì)粒組采用50%（V/V）分析純乙醇一次性灌胃（14 mL/kg）誘導急性肝損傷。禁食16 h后進行眼球取血，檢測丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性；蘇木素-伊紅（HE）和過碘酸-雪夫（PAS）染色檢測肝臟損傷和糖原變化情況；蛋白免疫印跡法檢測肝組織中ADAM8、細胞色素CYP450 2E1（CYP2E1）、熱休克蛋白70（HSP70）及絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路相關(guān)因子的表達。結(jié)果 與正常組相比，酒精組ALT和AST升高，肝損傷評分增加，糖原含量減少，ADAM8、CYP2E1、磷酸化的細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（p-ERK1/2）、磷酸化的p38（p-p38）MAPK以及磷酸化的c-Jun氨基未端激酶（p-c-Jun）的表達升高，而HSP70的表達降低（P＜0.05）。與酒精組相比，質(zhì)粒組ALT和AST降低，肝損傷評分降低（P＜0.05），糖原含量增多；ADAM8、CYP2E1、p-ERK1/2、p-p38 MAPK以及p-c-Jun的表達降低，HSP70的表達增加（P＜0.05）。結(jié)論 利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向抑制ADAM8的表達，可以通過MAPK信號通路改善小鼠急性酒精性肝損傷。

關(guān)鍵詞：ADAM蛋白質(zhì)類；急性酒精性肝損傷；絲裂原激活蛋白激酶類；CRISPR/Cas9

中圖分類號：R364.5 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20231741

The effect of ADAM8 expression on acute alcoholic liver injury in mice

YANG Mengli， LI Sanqiang△， ZHANG Kaijie， CUI Qinyi， FENG Jiayang， LI Yilin， LI Haoyuan， QI Jinghan

College of Basic Medicine and Forensic Medicine， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471000， China

Corresponding Author E-mail： sanqiangli2001@163.com

Abstract： Objective To investigate the role and molecular mechanism of CRISPR/Cas9 technology targeting the inhibition of disintegrin and metalloprotease 8 （ADAM8） in acute alcoholic liver injury in mice. Methods Eighteen healthy Kunming female mice aged 6-8 weeks were randomly divided into the normal group， the alcohol group and the plasmid group， with 6 mice in each group. The normal group was given no treatment， and the plasmid group was injected with three-in-one recombinant plasmid ADAM8-sgRNA3 （3 g/kg） by CRISPR/Cas9 technology to inhibit the ADAM8 gene using hydrodynamic injection tail vein method. The alcohol group was injected with an equal amount of physiological saline through tail vein. After 3 days of regular feeding， the alcohol group and the plasmid group were subjected with 50% （V/V） alcohol analytical grade ethanol by a one-time gavage （14 mL/kg） to induce acute liver injury. After fasting for 16 hours， eyeball blood sample was taken to detect activities of alanine aminotransferase （ALT） and aspartate aminotransferase （AST）. Mice were euthanized and liver tissue was separated and extracted. Hematoxylin-Eosin staining （HE staining） and Periodic Acid-Schiff staining （PAS staining） were used to detect liver injury and glycogen changes in each group of mice. The expression levels of ADAM8， cytochrome CYP450 2E1 （CYP2E1）， heat shock protein 70 （HSP70） and mitogen-activated protein kinase （MAPK） pathway related factors were detected by Western blot assay. Results Compared with the normal group， ALT and AST were increased， liver injury score was increased， glycogen content was decreased， ADAM8， CYP2E1， phosphorylated extracellular regulated kinase 1/2 （p-ERK1/2）， phosphorylated p38 （p-p38） MAPK and phosphorylated c-Jun aminoterminal kinase （p-c-Jun） were increased in the alcohol group. The expression of HSP70 was decreased （P＜0.05）. Compared with alcohol group， ALT and AST were decreased， liver injury score was decreased in the plasmid group （P＜0.05）. Glycogen content was increased. ADAM8， CYP2E1， p-ERK1/2， p-P38 MAPK and p-c-Jun expression levels were decreased， while HSP70 expression was increased （P＜0.05）. Conclusion Targeted inhibition of ADAM8 expression by CRISPR/Cas9 technology can improve acute alcoholic liver injury in mice through MAPK signaling pathway.

Key words： ADAM proteins; acute alcoholic liver injury; mitogen-activated protein kinases; CRISPR/Cas9

近年來，隨著飲酒人群比例的增加，全球超過7 500萬人面臨與酒精有關(guān)的肝病風險［1］，每年有約200萬人死于酒精性肝?。?］。而急性酒精性肝損傷是酒精性肝病的前期過程，是指在短期內(nèi)攝入過量酒精，超過肝臟的代謝能力，誘發(fā)肝組織結(jié)構(gòu)紊亂和肝細胞受損等一系列病理變化，從而導致肝功能異常，同時觸發(fā)機體發(fā)生氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)［3］。去整合素-金屬蛋白酶（a disintegrin and metalloprotease，ADAM）8是ADAMs家族中的重要一員，具有金屬內(nèi)切酶活性和去整合素的功能，廣泛參與細胞黏附，信號傳導及炎癥反應(yīng)等調(diào)控過程。研究表明，ADAM8的高表達在胃癌、胰腺癌和結(jié)直腸癌等多種疾病中發(fā)揮著重要作用［4-5］。目前，國內(nèi)外關(guān)于ADAM8與肝臟關(guān)系的研究逐漸增多［6-7］。本課題組前期研究結(jié)果表明，ADAM8可加重四氯化碳誘導的小鼠急性肝損傷［8］。但缺乏ADAM8在急性酒精性肝損傷中的作用和分子機制的研究。筆者利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向抑制ADAM8的表達來研究其在小鼠急性酒精性肝損傷中的作用及調(diào)控機制，以期為臨床防治提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞和質(zhì)粒 健康SPF級雌性昆明小鼠18只，6～8周齡，體質(zhì)量（35±5）g，購自河南斯克貝斯生物科技股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（豫）2020-0005。小鼠飼養(yǎng)于鄭州大學第三附屬醫(yī)院［動物使用許可證號：SYXK（豫）2020-0016］，通風良好，溫度（25±2）℃，相對濕度40%～60%，晝夜節(jié)律（12 h/12 h）相對恒定，提供標準飼料，自由進食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)１周后開始建模。小鼠成肌細胞C2C12購自武漢博士德生物工程有限公司。重組質(zhì)粒和菌株購自南京堯舜禹生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器 無水乙醇購自天津市北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒購自O(shè)mega科技有限公司；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒和ECL超敏化學發(fā)光試劑盒購自白鯊生物科技公司；過碘酸-雪夫（PAS）糖原染色試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；鼠源抗ADAM8單克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔源抗細胞色素CYP450 2E1（cytochrome P4502E1，CYP2E1）單克隆抗體購自華安生物科技有限公司；鼠源抗熱休克蛋白70（heat shock 70，HSP70）、鼠源抗磷酸化的細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（phosphorylated extracellular regulated kinase 1/2，p-ERK1/2）、鼠源抗磷酸化的c-Jun氨基未端激酶（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase，p-c-Jun）以及鼠源抗磷酸化的p38絲裂原活化蛋白激酶（phosphorylated p38 mitogen activated protein kinase，p-p38 MAPK）單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；兔源抗β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗小鼠或抗兔IgG二抗購自北京安必維抗體技術(shù)有限公司。Leica半自動組織切片機（RM2128）購自德國徠卡有限公司；CX31RBSF光學顯微鏡購自奧林巴斯（中國）有限公司；JY300c電泳儀購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；全自動化學發(fā)光圖像分析購自上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 有效質(zhì)粒ADAM8-單鏈向?qū)NA（single-guide RNA，sgRNA）的篩選 根據(jù)ADAM8的基因信息設(shè)計3條sgRNA，利用CRISPR/Cas9最新RNP基因敲除技術(shù)，即Cas9與sgRNA形成復(fù)合物，配合自動移液工作站和高效電轉(zhuǎn)化平臺在小鼠成肌細胞C2C12中構(gòu)建ADAM8基因KO pool，通過對其進行Sanger測序，并將測序結(jié)果與野生型細胞的序列進行比對分析發(fā)現(xiàn)sgRNA3為有效sgRNA。本課題組前期通過蛋白免疫印跡法進一步驗證sgRNA3為有效sgRNA，其序列為5′?ATGGGGCAAAGGAGGTCCAGGGG-3′。采用CRISPR/Cas9技術(shù)設(shè)計構(gòu)建靶向突變小鼠ADAM8基因的三合一重組質(zhì)?！皃YSY-CMV-Cas9-U6-ADAM8-sgRNA3-EFla-puro”。

1.3.2 動物分組及模型制備 18只小鼠采用隨機數(shù)字表法分為正常組、酒精組和質(zhì)粒組，每組6只。正常組小鼠不做處理，質(zhì)粒組小鼠采用水流動力學注射法尾靜脈注射篩選出的有效質(zhì)粒ADAM8-sgRNA3（3 g/kg）［9-10］，酒精組小鼠尾靜脈注射等量的生理鹽水。常規(guī)喂養(yǎng)3 d后，酒精組和質(zhì)粒組小鼠采用50%（V/V）分析純乙醇一次性灌胃（14 mL/kg）誘導小鼠急性肝損傷［11］。灌胃結(jié)束后，各組小鼠禁食禁水16 h，眼球取血后頸椎脫臼處死小鼠并取其新鮮肝臟組織。

1.3.3 HE和PAS染色觀察肝組織病理損傷和糖原含量變化 每只小鼠取肝大葉放入4%多聚甲醛中固定24 h，流水沖洗24 h，然后依次經(jīng)過乙醇梯度脫水、透明、石蠟包埋、切片（4 μm），隨后進行60 ℃烤片1 h，常規(guī)脫蠟至水后按試劑盒說明書進行HE和PAS染色，200倍顯微鏡下觀察肝組織病理損傷和糖原含量變化并拍片保存。肝損傷評分標準：脂肪變性，＜5%（0分）、5%～33%（1分）、34%～67%（2分）、gt;67%（3分）；小葉炎癥，無病灶（0分）、＜2個病灶/視野（1分）、2～4個病灶/視野（2分）、gt;4個病灶/視野（3分）；氣泡樣變，無（0分）、少見（1分）、多見（2分）。糖原含量變化定量采用Image J軟件檢測各組肝臟切片的光密度值，并進行歸一化處理。

1.3.4 血清ALT與AST檢測 各組小鼠眼球取血后，室溫自然靜置凝固20 min，4 000 r/min離心20 min后分離出血清，按試劑盒說明書進行操作，檢測ALT與AST的酶活性變化。

1.3.5 免疫印跡法檢測肝組織中ADAM8、CYP2E1、HSP70、p-ERK1/2、p-p38以及p-c-Jun的表達量 先稱量并標記好肝組織，以1 g肝組織加1 mL裂解液的比例用超聲破碎儀破碎，于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液分裝，進行BCA蛋白濃度測定，使蛋白濃度歸一化。然后蛋白印跡按常規(guī)方法配制聚丙烯酰胺凝膠進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗（β-actin稀釋比例為1∶5 000，ADAM8與CYP2E1為1∶2 000，HSP70、p-ERK1/2、p-p38及p-c-Jun為1∶1 000）和二抗。以β-actin作為內(nèi)參。用Image J軟件檢測目的蛋白與內(nèi)參β?actin蛋白條帶灰度值并計算相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用Prism GraphPad 9.5.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料用[x] ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肝臟組織病理學變化 HE和PAS染色結(jié)果顯示，正常組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞形態(tài)完整，以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列，肝索排列比較均勻，無炎性細胞浸潤，糖原含量十分豐富；與正常組相比，酒精組小鼠灌胃后肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝索排列紊亂，出現(xiàn)肝細胞腫大破裂伴有炎性細胞浸潤，肝損傷評分升高，糖原含量減少（P＜0.05）；質(zhì)粒組小鼠肝細胞破壞較酒精組明顯減輕，肝索排列較整齊，肝損傷評分降低（P＜0.05），糖原含量差異無統(tǒng)計學意義。見表1、圖1。

2.2 血清ALT和AST酶活性變化 與正常組相比，酒精組小鼠血清ALT、AST活性升高（P＜0.01）；與酒精組相比，質(zhì)粒組血清ALT、AST活性降低（P＜0.01），見表2。

2.3 各組小鼠肝組織中ADAM8、CYP2E1、HSP70、p-ERK1/2、p-p38及p-c-Jun的表達變化 與正常組小鼠相比，酒精組小鼠肝組織中ADAM8、CYP2E1、p-ERK1/2、p-p38及p-c-Jun的蛋白表達量升高，而HSP70的表達量降低（P＜0.05）；與酒精組相比，質(zhì)粒組ADAM8、CYP2E1、p-ERK1/2、p-p38及p-c-Jun的蛋白表達量降低，而HSP70的表達量增加（P＜0.05），見表3、圖2。

3 討論

急性酒精性肝損傷是短期內(nèi)大量飲酒導致肝臟損傷的疾病，是世界性的公共衛(wèi)生問題，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。酒精性肝病發(fā)病原因單一，但發(fā)病機制復(fù)雜，其中最關(guān)鍵的原因為氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)。近年來，對酒精性肝病發(fā)病機制和治療方法的研究雖然取得了一定進步，但是迄今為止尚無特效治療方法。ADAM8參與一系列膜結(jié)合受體、細胞因子等蛋白的水解過程，也可參與調(diào)節(jié)細胞形態(tài)和運動，且有多種配體，涉及不同的信號通路及信號分子，共同調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信號的傳導和生理性調(diào)控［4］。

本研究結(jié)果顯示，酒精組小鼠血清ALT和AST明顯升高，肝小葉的結(jié)構(gòu)不清晰，肝索排列出現(xiàn)紊亂，部分細胞出現(xiàn)水腫現(xiàn)象，且糖原含量明顯減少，HSP70表達降低，表明酒精誘導急性肝損傷小鼠模型構(gòu)建成功。酒精破壞肝細胞內(nèi)多種酶系導致肝糖原合成受阻，可能與氧化應(yīng)激有關(guān)。當損傷超出一定限度，肝細胞可變性壞死導致應(yīng)激蛋白HSP70合成障礙，失去對外來刺激的抵抗作用，從而造成細胞損傷程度加重。本研究蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，酒精組小鼠ADAM8高表達，表明ADAM8在小鼠急性肝損傷中表達增加，可能發(fā)揮著促進肝損傷的作用，通過尾靜脈注射有效質(zhì)粒ADAM8-sgRNA3抑制ADAM8的表達后，質(zhì)粒組小鼠血清ALT和AST明顯下降，肝損傷病理情況改善，糖原含量增多，HSP70的表達增加，ADAM8的表達減少，表明有效抑制ADAM8的表達可以減輕小鼠急性酒精性肝臟的損傷程度。

MAPK信號主要參與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，而酒精誘導引起的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是酒精肝發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。肝臟微粒體CYP2E1主要參與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進一步放大酒精的肝臟毒性作用。乙醇可促進CYP2E1的表達，進而產(chǎn)生活性氧（ROS）造成機體損害。肝細胞接受到ROS信號后，MAPK信號通路迅速激活，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38 MAPK是其主要的調(diào)控方式。有研究通過構(gòu)建針對ADAM8的小干擾寡核苷酸RNA（siRNA）和過表達質(zhì)粒，沉默和上調(diào)ADAM8的表達，可以下調(diào)或激活p-ERK信號通路，從而抑制或促進癌細胞的侵襲［12-14］。本研究結(jié)果顯示，酒精刺激誘導肝細胞損傷時，酒精組CYP2E1、p-ERK、p-p38和p-c-Jun表達增加，而利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向抑制ADAM8的表達，質(zhì)粒組CYP2E1、p-ERK、p-p38和p-c-Jun表達減少，表明ADAM8可能通過激活MAPK信號通路促進急性酒精性肝損傷。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向抑制ADAM8的表達可以改善小鼠急性酒精性肝損傷，這可能與MAPK信號通路有關(guān)，為臨床治療急性酒精性肝損傷提供了新的可能。但本研究也存在一定不足，急性酒精性肝損傷致病機制錯綜復(fù)雜，本研究僅從MAPK信號通路的關(guān)鍵因子入手研究，有關(guān)ADAM8對急性酒精性肝損傷促進作用的具體機制有待進一步研究。

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基金項目：國家自然科學基金資助項目（82170606）；河南省高等學校重點科研項目計劃基礎(chǔ)研究專項（23ZX006）

作者單位：河南科技大學基礎(chǔ)醫(yī)學與法醫(yī)學院（郵編471000）

作者簡介：楊孟利（1999），女，碩士在讀，主要從事肝損傷與修復(fù)分子機制研究。E-mail：2186374936@qq.com

通信作者 E-mail：sanqiangli2001@163.com

（本文編輯 李志蕓）