三種馬鮫魚快速檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

摘 要：為了準(zhǔn)確快速鑒定馬鮫魚樣品，本研究分別以線粒體Cytb和D-loop為靶基因，篩選出康氏馬鮫、藍(lán)點(diǎn)馬鮫與斑點(diǎn)馬鮫的特異性PCR擴(kuò)增引物，建立了3種馬鮫魚的快速檢測(cè)方法，并對(duì)檢測(cè)方法的特異性、重復(fù)性和靈敏性進(jìn)行了驗(yàn)證，隨后運(yùn)用該方法對(duì)市售馬鮫魚及其加工制品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，馬鮫魚的快速檢測(cè)方法具有良好的特異性和重復(fù)性，靈敏性檢測(cè)限低于2.000 ng·μL-1 DNA，運(yùn)用該方法能快速檢測(cè)出原料及加工產(chǎn)品中的馬鮫魚成分，整個(gè)過程最短用時(shí)2 h。本研究建立的3種馬鮫魚PCR快速檢測(cè)方法，可實(shí)現(xiàn)馬鮫魚物種鑒定，滿足日常檢測(cè)需求，對(duì)防止水產(chǎn)品摻假、維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益、規(guī)范市場(chǎng)秩序具有重要意義。

關(guān)鍵詞：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）；馬鮫魚；快速檢測(cè)；物種鑒定

The Establishment and Application of Rapid Detection Methods for Three Species of Mackerel

YANG Jianqi1，2， LI Ang2， LIU Shufang2*

（1.College of Fisheries and Life Science， Dalian Ocean University， Dalian 116023， China; 2.Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Yellow Sea Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences， Qingdao 266071， China）

Abstract： To accurately and swiftly identify samples of Scomberomorus species， this study utilized mitochondrial Cytb and D-loop as target genes to screen specific PCR primers for Scomberomorus commerson， Scomberomorus niphonius， Scomberomorus guttatus， the rapid detection methods for three types of Scomberomorus were established， and the specificity， repeatability， and sensitivity of the detection methods were validated， subsequently， this method was used to detect commercially available Scomberomorus and its processed products. The results indicate that the rapid detection method for Scomberomorus exhibits excellent specificity and repeatability， the sensitivity detection limit is below 2.000 ng·μL-1 of DNA， using this method allows for the rapid detection of Scomberomorus components in raw materials and processed products， with the entire process taking a minimum of 2 h. The three rapid PCR detection methods for Scomberomorus established in this study enable the identification of Scomberomorus species， meeting the requirements for routine testing， this is of significant importance in preventing adulteration in aquatic products， safeguarding consumer rights and interests， and regulating market order.

Keywords： polymerase chain reaction（PCR）; mackerel; rapid detection; species identification

馬鮫魚（Scomberomorus）為脊椎動(dòng)物門（Vertebrata）硬骨魚綱（Osteichthyes）鱸形目（Perciformes）鯖科（Scombrida）鲅屬魚類總稱，別名鲅魚，是世界范圍內(nèi)重要的海洋經(jīng)濟(jì)魚類。我國(guó)有康氏馬鮫（Scomberomorus commerson）、藍(lán)點(diǎn)馬鮫（Scomberomorus niphonius）、斑點(diǎn)馬鮫（Scomberomorus guttatus）、中華馬鮫（Scomberomorus sinensis）和朝鮮馬鮫（Scomberomorus koreanus）5個(gè)種，廣泛分布在渤海、黃海、東海和南海地區(qū)。其中，康氏馬鮫、藍(lán)點(diǎn)馬鮫和斑點(diǎn)馬鮫的產(chǎn)量較高，是我國(guó)近海主要經(jīng)濟(jì)物種。馬鮫魚的典型形態(tài)特征是體呈紡錘形或長(zhǎng)紡錘形，體背側(cè)藍(lán)黑色，腹側(cè)銀白色，體側(cè)有多列黑色圓斑[1-2]。因種間形態(tài)學(xué)差異較小，給物種鑒定帶來一定困難。且市場(chǎng)上的馬鮫魚多以鮮食烹制、速凍整魚或切片、煙熏、魚糜制品等形式銷售[3-4]，通過形態(tài)學(xué)方法鑒別物種比較困難。一些不法商販為牟取更大的利潤(rùn)，常用形態(tài)相似、低價(jià)值的鮐、圓鮀鰹等魚類替代高價(jià)值馬鮫魚售賣。因此，迫切需要建立一種快速特異的檢測(cè)手段對(duì)馬鮫魚進(jìn)行有效鑒別。

基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)的分子生物檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、不受組織類別限制等優(yōu)點(diǎn)，更適合魚類及其冷凍切片產(chǎn)品或深加工制品的物種鑒別[5-9]。為有效區(qū)分和鑒定馬鮫魚，本研究擬針對(duì)每個(gè)物種設(shè)計(jì)特異性引物，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳圖的條帶有無(wú)和PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度即可實(shí)現(xiàn)物種的準(zhǔn)確快速分類和鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

康氏馬鮫（S. commerson）、斑點(diǎn)馬鮫（S. guttatus）、藍(lán)點(diǎn)馬鮫（S. niphonius）各3條，取自國(guó)家海洋漁業(yè)生物種質(zhì)資源庫(kù)的漁業(yè)生物DNA條形碼憑證標(biāo)本庫(kù)，用于建立3種魚類的特異性檢測(cè)方法。同時(shí)，從購(gòu)物平臺(tái)采購(gòu)了不同產(chǎn)地馬鮫魚的魚片、魚丸、魚泥、魚干和魚罐頭等制品，如表1所示，用于馬鮫魚快速檢測(cè)方法的驗(yàn)證。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取

本實(shí)驗(yàn)采用天根生物科技有限公司的海洋生物組織基因組DNA提取試劑盒提取DNA。將提取好的DNA置于-20 ℃保存，待后續(xù)PCR擴(kuò)增使用。

1.2.2 PCR引物設(shè)計(jì)

通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)搜索并下載康氏馬鮫、斑點(diǎn)馬鮫、藍(lán)點(diǎn)馬鮫、圓鮀鰹和鮐的線粒體基因序列，如表2所示，使用MEGA7.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)，找出Cytb和D-loop序列的變異區(qū)域。

使用Primer Premier 5.0軟件在種間高度變異而種內(nèi)高度保守的區(qū)域設(shè)計(jì)12對(duì)特異性引物。先在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中使用primer-BLAST工具進(jìn)行引物特異性篩選，獲得3對(duì)特異性高的引物。然后使用康氏馬鮫、藍(lán)點(diǎn)馬鮫和斑點(diǎn)馬鮫憑證標(biāo)本對(duì)引物的特異性進(jìn)行檢驗(yàn)。最終篩選出的特異性引物序列如表3所示。引物由青島華大基因公司合成。

1.2.3 PCR反應(yīng)體系和條件

PCR反應(yīng)體系為25 μL，包含Taq混合液（2×）12.5 μL，DNA模板3 μL，引物（10 μmol·L-1）各1 μL，無(wú)菌雙蒸水7.5 μL。

康氏馬鮫的PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；59 ℃退火30 s；72 ℃延伸20 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。藍(lán)點(diǎn)馬鮫和斑點(diǎn)馬鮫的反應(yīng)條件與康氏馬鮫的PCR反應(yīng)條件相同，僅退火溫度不同。藍(lán)點(diǎn)馬鮫退火溫度設(shè)定為61 ℃，斑點(diǎn)馬鮫退火溫度設(shè)定為58 ℃。

1.2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)

使用質(zhì)量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，電壓為120 V，電泳10～15 min。根據(jù)電泳條帶的有無(wú)和擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小，判斷待樣品是否為目標(biāo)魚類。

1.2.5 特異性檢測(cè)

為驗(yàn)證3種馬鮫魚引物特異性，分別以目標(biāo)魚類為試驗(yàn)組，其他近緣物種為陰性對(duì)照組，以無(wú)菌雙蒸水為模板作空白對(duì)照，進(jìn)行3個(gè)平行的PCR試驗(yàn)。由于生物體往往存在個(gè)體差異性，將目標(biāo)物種進(jìn)行

3個(gè)不同個(gè)體的生物學(xué)重復(fù)檢測(cè)，每組以其中一種馬鮫魚的3個(gè)不同個(gè)體為陽(yáng)性對(duì)照，其余兩種馬鮫魚、圓鮀鰹及鮐的3個(gè)不同個(gè)體為陰性對(duì)照，以無(wú)菌雙蒸水作為空白對(duì)照。

1.2.6 靈敏度檢測(cè)

將提取的康氏馬鮫、斑點(diǎn)馬鮫、藍(lán)點(diǎn)馬鮫DNA進(jìn)行10倍連續(xù)梯度稀釋，稀釋后的濃度分別為20.000 ng·μL-1、2.000 ng·μL-1、0.200 ng·μL-1、0.020 ng·μL-1、0.002 ng·μL-1，依次進(jìn)行各濃度DNA樣品的PCR試驗(yàn)，以考察所建立方法的檢測(cè)靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)方法的特異性和重復(fù)性

藍(lán)點(diǎn)馬鮫特異性引物檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，本研究設(shè)計(jì)的特異性引物僅能夠擴(kuò)增出藍(lán)點(diǎn)馬鮫的基因片段，擴(kuò)增長(zhǎng)度符合目標(biāo)片段長(zhǎng)度，在其他物種中未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。因此，本研究設(shè)計(jì)的特異引物對(duì)藍(lán)點(diǎn)馬鮫具有特異性。

泳道：01為藍(lán)點(diǎn)馬鮫；02為斑點(diǎn)馬鮫；03為康氏馬鮫；04為圓鮀鰹；05為鮐；06～07為空白；08為Marker。

藍(lán)點(diǎn)馬鮫特異性引物重復(fù)檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，01～03為藍(lán)點(diǎn)馬鮫陽(yáng)性結(jié)果，基于藍(lán)點(diǎn)馬鮫D-loop基因設(shè)計(jì)的特異性引物能夠擴(kuò)增出3個(gè)藍(lán)點(diǎn)馬鮫樣品的D-loop基因片段，擴(kuò)增長(zhǎng)度均符合目標(biāo)片段長(zhǎng)度，不出現(xiàn)其他非特異性擴(kuò)增片段。

斑點(diǎn)馬鮫特異性引物檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，02為斑點(diǎn)馬鮫陽(yáng)性結(jié)果，基于斑點(diǎn)馬鮫D-loop基因設(shè)計(jì)的特異性引物能夠擴(kuò)增斑點(diǎn)馬鮫的D-loop基因片段，擴(kuò)增長(zhǎng)度符合目標(biāo)片段長(zhǎng)度，不出現(xiàn)其他非特異性擴(kuò)增片段。因此，本研究設(shè)計(jì)的斑點(diǎn)馬鮫特異引物對(duì)斑點(diǎn)馬鮫具有特異性。

斑點(diǎn)馬鮫特異性引物重復(fù)檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，04～06為斑點(diǎn)馬鮫陽(yáng)性結(jié)果，基于斑點(diǎn)馬鮫D-loop基因設(shè)計(jì)的特異性引物能夠擴(kuò)增出3個(gè)斑點(diǎn)馬鮫樣品的D-loop基因片段，擴(kuò)增長(zhǎng)度均符合目標(biāo)片段長(zhǎng)度，不出現(xiàn)其他非特異性擴(kuò)增片段。

泳道：01～03為藍(lán)點(diǎn)馬鮫；04～06為斑點(diǎn)馬鮫；07～09為康氏馬鮫；10～12為圓鮀鰹；13～15為鮐；16為空白；17為Marker。

康氏馬鮫特異性引物檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，03為康氏馬鮫陽(yáng)性結(jié)果，基于康氏馬鮫Cytb基因設(shè)計(jì)的特異性引物能夠擴(kuò)增康氏馬鮫的Cytb基因片段，擴(kuò)增長(zhǎng)度符合目標(biāo)片段長(zhǎng)度，不出現(xiàn)其他非特異性擴(kuò)增片段。因此，本研究設(shè)計(jì)的康氏馬鮫特異引物對(duì)康氏馬鮫具有特異性。

康氏馬鮫特異性引物重復(fù)檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，01～03為康氏馬鮫陽(yáng)性結(jié)果，基于康氏馬鮫Cytb基因設(shè)計(jì)的特異性引物能夠擴(kuò)增出3個(gè)康氏馬鮫樣品的Cytb基因片段，擴(kuò)增長(zhǎng)度均符合目標(biāo)片段長(zhǎng)度，不出現(xiàn)其他非特異性擴(kuò)增片段。

泳道：01～03為康氏馬鮫；04～06為斑點(diǎn)馬鮫；07～09為藍(lán)點(diǎn)馬鮫；10～12為圓鮀鰹；13為鮐；16為空白；17為Marker。

2.2 檢測(cè)方法的靈敏度

由圖7可知，將康氏馬鮫、藍(lán)點(diǎn)馬鮫、斑點(diǎn)馬鮫的DNA進(jìn)行10倍連續(xù)梯度稀釋，分別進(jìn)行各濃度DNA樣品的PCR試驗(yàn)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)能夠檢測(cè)到目的基因的最小值結(jié)果依次為0.200 ng·μL-1、2.000 ng·μL-1、0.020 ng·μL-1，說明本實(shí)驗(yàn)建立的快速檢測(cè)方法對(duì)康氏馬鮫、藍(lán)點(diǎn)馬鮫和斑點(diǎn)馬鮫的檢測(cè)靈敏度分別為0.200 ng·μL-1、2.000 ng·μL-1、0.020 ng·μL-1。

2.3 檢測(cè)方法在市售馬鮫魚加工制品中的應(yīng)用

從市場(chǎng)購(gòu)買11份馬鮫魚產(chǎn)品，使用本研究建立的PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，市售馬鮫魚加工制品檢測(cè)結(jié)果如表4和圖8所示。編號(hào)2樣品魚丸、編號(hào)10樣品速凍整魚檢測(cè)結(jié)果含有斑點(diǎn)馬鮫成分；編號(hào)3、編號(hào)4、編號(hào)5樣品魚丸、魚泥，編號(hào)7、編號(hào)8樣品咸魚干檢測(cè)結(jié)果含有藍(lán)點(diǎn)馬鮫成分；編號(hào)9樣品切片、編號(hào)11樣品速凍整魚檢測(cè)結(jié)果含有康氏馬鮫成分，編號(hào)1樣品罐頭、編號(hào)6樣品魚泥未檢測(cè)出3種馬鮫魚成分。深加工制品罐頭及1份魚泥未檢測(cè)出馬鮫魚，可能是因?yàn)檫@兩個(gè)產(chǎn)品不是馬鮫魚，也可能是加工過程中DNA降解嚴(yán)重，從而導(dǎo)致未檢出。

3 結(jié)論與討論

水產(chǎn)品的摻雜使假一直是影響其質(zhì)量與安全的主要問題之一，基于特異性引物的PCR方法可以快速準(zhǔn)確地檢測(cè)動(dòng)物源性成分[10-12]，因此，國(guó)內(nèi)外已廣泛使用特異性PCR方法快速開展水產(chǎn)品的物種鑒定及其成分檢測(cè)[13-25]。本文通過設(shè)計(jì)3種馬鮫魚的特異性引物，根據(jù)PCR產(chǎn)物的有無(wú)及其長(zhǎng)度，便可實(shí)現(xiàn)馬鮫魚物種的精準(zhǔn)鑒定。本研究建立的3種馬鮫魚快速檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，檢測(cè)限≤2.000 ng·μL-1，整個(gè)過程最短用時(shí)2 h。該方法克服了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法的不足，解決了缺乏專業(yè)知識(shí)儲(chǔ)備和鑒定人員等問題，有效縮短了鑒定時(shí)間，操作簡(jiǎn)單、快速，對(duì)樣品DNA的純度要求低，鑒定結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠，可滿足水產(chǎn)品市場(chǎng)監(jiān)管和檢驗(yàn)的適用性要求，具有較大的推廣價(jià)值和應(yīng)用前景，對(duì)維持水產(chǎn)品市場(chǎng)健康發(fā)展及維護(hù)廣大消費(fèi)者利益具有積極意義。

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基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2019YFC1604702）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32102768和42076132）；中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（20603022022024）。

作者簡(jiǎn)介：楊健琪（1997—），女，山西忻州人，碩士。研究方向：漁業(yè)資源分子生態(tài)學(xué)。

通信作者：柳淑芳（1967—），女，山東青島人，博士，研究員。研究方向：漁業(yè)資源分子生態(tài)學(xué)。E-mail： liusf@ysfri.ac.cn。