重構(gòu)枯草芽孢桿菌的木糖代謝通路生產(chǎn)乙醇酸

摘 要：本研究旨在獲得一株可利用麩皮生產(chǎn)乙醇酸的食品安全菌。通過(guò)同時(shí)過(guò)表達(dá)xdh和yjhG，構(gòu)建了基因工程菌XDH-YjhG，該菌株能夠利用麩皮生產(chǎn)乙醇酸，產(chǎn)量為3.15 g·L-1。本研究首次證明了可利用麩皮作為碳源生產(chǎn)乙醇酸，為乙醇酸的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌；麩皮；乙醇酸

Reconstructing the Xylose Metabolic Pathway of Bacillus subtilis to Produce Glycolic Acid

JI Minghua

（Kinry Food Ingredients Co.， Ltd.， Shanghai 200000， China）

Abstract： This study aims to obtain a food-safe bacterium capable of utilizing wheat bran to produce acetic acid. By co-overexpressing xdh and yjhG， a genetically engineered strain XDH-YjhG was constructed， which could use wheat bran to produce acetic acid with a yield of 3.15 g·L-1. This study is the first to demonstrate the use of wheat bran as a carbon source for the production of acetic acid， laying the foundation for the cost-effective industrial production of acetic acid.

Keywords： Bacillus subtilis; wheat bran; acetic acid

乙醇酸（HOCH2COOH）是最簡(jiǎn)單的α-羥基酸，別名羥基乙酸或甘醇酸，可廣泛用于食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域。近年來(lái)，全生物法合成乙醇酸因其安全無(wú)毒、條件溫和等特點(diǎn)而廣受關(guān)注，具有較好的前景。利用代謝工程手段，改造菌株的D-木酮糖-1-磷酸途徑、Dahms途徑或乙醛酸旁路途徑等，可以實(shí)現(xiàn)乙醇酸的全生物合成[1]。

枯草芽孢桿菌已獲得“GRAS”和“QPS”雙料認(rèn)證，菌株安全。本研究以枯草芽孢桿菌為出發(fā)菌，通過(guò)木糖脫氫酶編碼基因xdh和木糖酸脫水酶編碼基因yjhG的異源表達(dá)，構(gòu)建了一株食品安全菌。實(shí)驗(yàn)證明該菌株可利用麩皮生產(chǎn)乙醇酸，該研究對(duì)于以廉價(jià)生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇酸具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌株質(zhì)粒

實(shí)驗(yàn)所用菌株164T7P為實(shí)驗(yàn)室保存，T7P-YjhG、XDH、XDH-YjhG為本文構(gòu)建；質(zhì)粒pMK4-PxylA-yjhG、pMK4-T7、pUC57-xdh和pMD19T-aea為實(shí)驗(yàn)室保存，pMK4-T7-yjhG為本文構(gòu)建。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

細(xì)胞培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基。添加1%木糖為誘導(dǎo)培養(yǎng)基；添加1%木糖和1%木糖酸為木糖酸發(fā)酵培養(yǎng)基；添加2%木聚糖為木聚糖發(fā)酵培養(yǎng)基；添加6%麩皮為麩皮發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建

采用Simple Cloning的方式在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行質(zhì)粒pMK4-T7-yjhG的構(gòu)建[2]，使用引物見(jiàn)表1。在添加氯霉素的LB抗性固體板上篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 基因表達(dá)盒的構(gòu)建

用于敲入xdh基因的基因表達(dá)盒xdh cassette通過(guò)融合PCR方法構(gòu)建得到，PCR擴(kuò)增過(guò)程參考文獻(xiàn)[3]。所用的引物序列（5’→3’）見(jiàn)表2。

1.2.4 枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化及菌種構(gòu)建

菌株構(gòu)建方法參考文獻(xiàn)[3]。質(zhì)粒pMK4-T7-yjhG轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌164T7P，涂布于氯霉素抗性平板篩選，得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子命名為T7P-YjhG；基因表達(dá)盒xdh cassette轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌164T7P，涂布于紅霉素抗性平板篩選，得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子命名為XDH；進(jìn)一步地，質(zhì)粒pMK4-T7-yjhG轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌XDH，涂布于氯霉素抗性平板篩選，所得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子命名為XDH-YjhG。

1.2.5 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

研究采用搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。在LB中接種，37 ℃、200 r·min-1隔夜培養(yǎng)；然后將過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至搖

瓶，培養(yǎng)基分別為木糖酸發(fā)酵培養(yǎng)基、木糖發(fā)酵培養(yǎng)基、木聚糖發(fā)酵培養(yǎng)基或麩皮發(fā)酵培養(yǎng)基，于搖床中37 ℃、200 r·min-1進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.6 發(fā)酵產(chǎn)物的檢測(cè)與分析

發(fā)酵液樣品處理：取1 mL發(fā)酵液于12 000 r·min-1離心5 min，取上清液進(jìn)行檢測(cè)。液相條件：色譜柱型號(hào)為Aminex HPX-87H column，使用硫酸溶液（0.005 mmol·L-1）作為流動(dòng)相，設(shè)置流速為0.6 mL·min-1，柱溫為65 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 在枯草芽孢桿菌中過(guò)表達(dá)yjhG

枯草芽孢桿菌中缺乏乙醇酸生產(chǎn)的關(guān)鍵酶，不能經(jīng)由木糖酸生成乙醇酸。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證明，只需過(guò)表達(dá)yjhG，后續(xù)借助枯草芽孢桿菌內(nèi)源性酶，即可使枯草芽孢桿菌將木糖酸最終轉(zhuǎn)化為乙醇酸[4]。為了進(jìn)一步優(yōu)化乙醇酸轉(zhuǎn)化率，本研究從實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的164T7P出發(fā)，采用更高效的T7啟動(dòng)子作為表達(dá)元件，過(guò)表達(dá)yjhG基因，構(gòu)建了菌株T7P-YjhG[圖1（a）]。圖1（b）的曲線為發(fā)酵72 h上清液液相結(jié)果，深色為164T7P發(fā)酵液上清樣品，淺色為T7P-YjhG發(fā)酵液上清樣品，表明乙醇酸合成通路構(gòu)建成功。發(fā)酵生產(chǎn)乙醇酸的檢測(cè)結(jié)果如圖1（c）所示，T7P-Yjh共積累乙醇酸0.93 g·L-1，消耗木糖酸3.85 g·L-1，摩爾轉(zhuǎn)化率為52.74%。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在使用PxylA為啟動(dòng)子時(shí)，消耗木糖酸生產(chǎn)乙醇酸的摩爾轉(zhuǎn)化率為42.54%，這表明采用T7作為表達(dá)元件，針對(duì)木糖酸的轉(zhuǎn)化率更為高效。

2.2 利用麩皮生產(chǎn)乙醇酸

枯草芽孢桿菌僅能將木糖磷酸化，使其流向磷酸戊糖途徑，但不能將其轉(zhuǎn)化為木糖酸。為使木糖代謝流向乙醇酸，而不是進(jìn)入磷酸途徑，本研究首先敲除了xylA-xylB片段[5]，同時(shí)將木糖脫氫酶編碼基因xdh通過(guò)同源重組的方式，整合到菌株基因組DNA，構(gòu)建了枯草芽孢桿菌XDH。在木糖培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵評(píng)價(jià)，研究Xdh蛋白的表達(dá)效果。發(fā)現(xiàn)菌株XDH能夠?qū)⒛咎寝D(zhuǎn)化為木糖酸，120 h木糖完全消耗，積累木糖酸17.51 g·L-1，摩爾轉(zhuǎn)化率為79.12%（數(shù)據(jù)未展示）。

將質(zhì)粒pMK4-T7-yjhG轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌XDH，構(gòu)建了XDH-YjhG，評(píng)價(jià)其對(duì)木糖、木聚糖和麩皮的轉(zhuǎn)化能力，見(jiàn)圖2。

在含20 g·L-1木糖的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵評(píng)價(jià)，研究菌株是否能夠生產(chǎn)乙醇酸，發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)圖2（a）。由結(jié)果可知，XDH-YjhG可以生成乙醇酸，最終積累產(chǎn)量為0.99 g·L-1。為探究所構(gòu)建的XDH-YjhG能夠利用木聚糖生產(chǎn)乙醇酸，本研究在含

20 g·L-1的木聚糖培養(yǎng)基中開展了發(fā)酵研究。由結(jié)果可知，XDH-YjhG可以利用木聚糖生成乙醇酸，最終積累產(chǎn)量為1.20 g·L-1，與木糖相比，其產(chǎn)量增加了21.21%。本研究進(jìn)一步在麩皮發(fā)酵培養(yǎng)基中開展研究，由圖2（a）可以看到乙醇酸產(chǎn)量最終最高達(dá)到3.15 g·L-1。推測(cè)枯草芽孢桿菌可通過(guò)內(nèi)源性木聚糖酶，水解出麩皮中的木糖單體，而木糖進(jìn)一步在Xdh的催化下生成木糖酸，然后經(jīng)由Dahms途徑生成乙醇酸，見(jiàn)圖2（b）。

3 結(jié)論

本研究證明，在枯草芽孢桿菌中僅需表達(dá)yjhG基因就可實(shí)現(xiàn)木糖酸到乙醇酸的轉(zhuǎn)化；共表達(dá)xdh和yjhG，并敲除xylA-xylB片段，可重構(gòu)枯草芽孢桿菌的木糖代謝途徑，使其可利用麩皮產(chǎn)乙醇酸。綜合上述研究結(jié)果，本研究首次證明了使用麩皮發(fā)酵生產(chǎn)乙醇酸的可行性，為食品級(jí)生物基的乙醇酸的廉價(jià)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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作者簡(jiǎn)介：紀(jì)明華（1989—），男，河北臨西人，博士，工程師。研究方向：生物化工、食品微生物。