雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定及耐藥性研究

摘 要：目的：對(duì)雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行分離、鑒定和耐藥性研究，以深入了解其生物學(xué)特性和潛在威脅。方法：利用TSC瓊脂、血瓊脂、硫酸亞鐵牛乳培養(yǎng)基等進(jìn)行分離培養(yǎng)，通過形態(tài)觀察、生化特性鑒定，以及PCR鑒定和耐藥性試驗(yàn)等多種方法，系統(tǒng)性地分析產(chǎn)氣莢膜梭菌的性狀和特性。結(jié)果：分離得到的3株產(chǎn)氣莢膜梭菌經(jīng)PCR鑒定均確認(rèn)為A型。生化鑒定結(jié)果顯示了其在碳源代謝上的多樣性。毒素分型和16S rRNA基因分析驗(yàn)證了其種屬身份，同時(shí)揭示了它們在分子水平上的相似性。耐藥性試驗(yàn)結(jié)果表明，這些分離株對(duì)慶大霉素、卡那霉素、新霉素、多黏霉素B和復(fù)方新諾明表現(xiàn)出耐藥性，對(duì)頭孢唑啉、頭孢曲松、頭孢呋辛、氨芐青霉素和哌拉西林等抗生素則表現(xiàn)出高度敏感性。結(jié)論：本研究全面研究了雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌的分子生物學(xué)特性，強(qiáng)調(diào)了其在碳源代謝和抗藥性方面的多樣性，為防控雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌感染提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)為未來深入探究其致病機(jī)制和合理使用抗生素提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌；分離鑒定；耐藥性

Isolation and Identification of Clostridium perfringens from Chickens and Their Drug Resistance

WANG Yanchun

（Chifeng City Center for Disease Control and Prevention， Chifeng 024000， China）

Abstract： Objective： To investigate the isolation， identification and drug resistance of Clostridium perfringens of chicken origin in order to understand its biological characteristics and potential threats. Method： TSC AGAR， blood AGAR and ferrous sulfate milk culture medium were used to isolate and culture the characters and characteristics of Clostridium perfringens were analyzed systematically by morphological observation， biochemical characterization， PCR identification and drug resistance test. Result： The three isolates of Clostridium perfringens were identified as type A by PCR. The results of biochemical identification showed the diversity of carbon source metabolism. Toxin typing and 16S rRNA gene analysis confirmed the species identity and revealed their similarity at the molecular level. Resistance tests showed that these isolates were resistant to gentamicin， kanamycin， neomycin， polymycin B and cotrimoxazole， while highly sensitive to cefazolin， ceftriaxone， cefuroxime， ampicillin and piperacillin. Conclusion： This study comprehensively studied the molecular biological characteristics of Clostridium perfringens of chicken， emphasizing its diversity in carbon source metabolism and drug resistance， providing important basic data for the prevention and control of Clostridium perfringens infection， and providing scientific basis for further investigation of its pathogenic mechanism and rational use of antibiotics in the future.

Keywords： Clostridium perfringens of chicken origin; isolation and identification; drug resistance

雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）作為一種革蘭氏陽性、芽孢形成的厭氧菌，廣泛分布于自然界中，尤其在禽畜的腸道內(nèi)得以繁衍生息。其菌體形態(tài)特征包括短桿狀，能夠產(chǎn)生耐高溫的孢子，在惡劣環(huán)境中存活能力極強(qiáng)。作為一類潛在的食源性病原微生物，雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌的主要毒力因子之一即為產(chǎn)氣莢膜，是一種多糖復(fù)合物，對(duì)其致病性起著重要的作用。這種莢膜不僅使得細(xì)菌在寄主體內(nèi)逃避免疫系統(tǒng)的清除，還為其生存提供了一層保護(hù)膜，使得細(xì)菌能夠在寄主體內(nèi)迅速繁殖，形成感染[1-2]。此外，雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌還能分泌多種毒素，包括α、β、ε和ι毒素，這些毒素協(xié)同作用，能夠引發(fā)多種疾病，如壞疽性腸炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌在禽畜的腸道中普遍存在，其過度增殖或毒力因子釋放過多可能引發(fā)嚴(yán)重的動(dòng)物和人類疾病。在禽類養(yǎng)殖業(yè)中，該菌株可引起壞疽性腸炎等消化系統(tǒng)疾病，對(duì)禽畜的生長和發(fā)育產(chǎn)生不可忽視的影響[3-4]。因此，本文將聚焦于探究雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌的危害機(jī)制，包括其毒力因子的作用機(jī)制以及其在動(dòng)物體內(nèi)的生存策略，通過深入了解其引發(fā)的疾病機(jī)制，可以更好地制定預(yù)防和控制策略，減少其對(duì)禽畜養(yǎng)殖業(yè)和食品安全的潛在威脅。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

TSC瓊脂、血平板瓊脂、硫酸亞鐵牛乳培養(yǎng)基等，上海廣銳生物科技有限公司；DNA質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，上海莼試生物技術(shù)有限公司；PCR反應(yīng)試劑，上海廣銳生物科技有限公司；微生物發(fā)酵反應(yīng)管，上海莼試生物技術(shù)有限公司；TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，Applied Biosystems；液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（Fluid Thioglycollate medium，F(xiàn)TG）、緩沖動(dòng)力硝酸鹽培養(yǎng)基、硝酸鹽還原試劑、乳糖明膠培養(yǎng)基，青島海博生物有限公司；SPF雞胚，北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 分離培養(yǎng)和形態(tài)觀察

稱取禽畜的腸道樣本原液25 mL，加入含有225 mL 0.1%蛋白胨水無菌均質(zhì)袋中，均質(zhì)化處理。取均質(zhì)處理后的液體1 mL，加入9 mL 0.1%蛋白胨水無菌管中混勻，得到1∶1 000的稀釋液。從稀釋液中取2 mL分別加入2個(gè)無菌平皿中，每個(gè)平皿倒入15 mL 50 ℃ TSC瓊脂，緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)平皿以混勻液體，待凝固后加入10 mL冷卻至50 ℃的TSC瓊脂均勻覆蓋平板表層。隨后，將平板正置于厭氧盒裝置內(nèi)，在36 ℃條件下厭氧培養(yǎng)20 h，可見TSC瓊脂平板上形成的黑色菌落。引入SPF雞胚的模型系統(tǒng)，模擬產(chǎn)氣莢膜梭菌在禽體內(nèi)的生存環(huán)境。

形態(tài)觀察階段，采用TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)分離得到的潛在產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行16S rRNA基因的擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行凝膠電泳驗(yàn)證，確保目標(biāo)片段的特異性和純度。然后，通過測序技術(shù)對(duì)擴(kuò)增得到的16S rRNA基因序列進(jìn)行分析，以此推斷種屬鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。通過單菌株分離純化技術(shù)，將分離得到的3株菌株分別命名為TA01、TA02、TA03，以備進(jìn)一步研究。

1.3 生化特性鑒定

為獲得單一純種的產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株，用接種針挑取5個(gè)黑色可疑菌落分別劃線于TSC平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)，然后接種到FTG培養(yǎng)基中，36 ℃培養(yǎng)20 h，取生長旺盛的產(chǎn)氣莢膜梭菌1 mL，接種于含鐵牛乳培養(yǎng)基中，46 ℃培養(yǎng)2 h呈爆裂發(fā)酵。取FTG培養(yǎng)液穿刺接種緩沖動(dòng)力硝酸鹽培養(yǎng)基，可觀察到無氣泡產(chǎn)生，然后滴加0.5 mL試劑甲和0.2 mL試劑乙，15 min內(nèi)觀察到培養(yǎng)基變?yōu)榧t色，則表明硝酸鹽已被還原成亞硝酸鹽。同時(shí)，菌株能夠發(fā)酵乳糖、液化明膠，并分解卵磷脂。

1.4 毒素分型

采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌的主要毒力因子進(jìn)行鑒定。從培養(yǎng)的雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌中提取DNA，將其放入離心管中。設(shè)計(jì)產(chǎn)氣莢膜梭菌鑒定引物，選擇包括cpa、cpb、etx、iap和cpb2在內(nèi)的5個(gè)關(guān)鍵基因，這些基因編碼產(chǎn)氣莢膜梭菌的α、β、ε和ι等主要毒素。根據(jù)這些毒素基因的序列特點(diǎn)設(shè)計(jì)多重PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)的參數(shù)設(shè)置：反應(yīng)體系為50 μL，包括10×反應(yīng)緩沖液2.5 μL、2.5 mmol·L-1 dNTP混合液1 μL、10 μmmol·L-1引物混合液2 μL、模板DNA 2 μL、Taq DNA聚合酶0.5 μL、硫酸鎂2.5 μL，超純水填充至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，隨后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性30 s、相應(yīng)溫度退火30 s、72 ℃延伸1 min，最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，通過電泳分析對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，以確認(rèn)產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因的存在與否。

1.5 α毒素基因與16S rRNA基因分析

在α毒素基因與16S rRNA基因分析階段，采用分子生物學(xué)方法，通過PCR技術(shù)對(duì)雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌的α毒素基因和16S rRNA基因進(jìn)行克隆與擴(kuò)增。從培養(yǎng)得到的產(chǎn)氣莢膜梭菌中提取DNA，將其作為模板進(jìn)行反應(yīng)。為了克隆α毒素基因，設(shè)計(jì)特異性引物cpa（k）。擴(kuò)增結(jié)束后，通過電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，以驗(yàn)證α毒素基因的存在。同時(shí)，對(duì)16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)的條件和步驟同α毒素基因擴(kuò)增類似，同時(shí)通過電泳檢測確保16S rRNA基因的成功擴(kuò)增。隨后，對(duì)兩者的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和測序，通過比對(duì)基因序列確保所得到片段的準(zhǔn)確性。

1.6 耐藥性試驗(yàn)

將分離得到的雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株接種于FTG培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度設(shè)定為37 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為24 h，模擬其在宿主體內(nèi)的生存環(huán)境。將菌液分別均勻涂布于TSN平板上，分別取適量慶大霉素、卡那霉素、新霉素、多黏霉素B、復(fù)方新諾明、頭孢唑啉、頭孢曲松、頭孢呋辛、氨芐青霉素和哌拉西林等藥敏紙片貼在培養(yǎng)基表面，于37 ℃條件下孵育24 h，之后觀察和記錄不同抗生素對(duì)菌株的抑菌效果，通過抑菌圈直觀判斷耐藥性。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌分離

在37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后，觀察到菌落呈典型的圓形、表面光滑、邊緣整齊。產(chǎn)氣莢膜梭菌在FTG培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出較好的生長狀態(tài)，菌體呈現(xiàn)短桿狀，形態(tài)鮮活。顯微鏡形態(tài)觀察到了產(chǎn)氣莢膜梭菌的特有莢膜結(jié)構(gòu)。在TSB肉湯中進(jìn)行16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增和測序后，得到了產(chǎn)氣莢膜梭菌的16S rRNA基因序列。比對(duì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行結(jié)果鑒定后得出本文分離得到的菌株與雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌的16S rRNA序列高度一致，驗(yàn)證了其種屬身份。詳見表1。

2.2 生化鑒定結(jié)果

為驗(yàn)證生化反應(yīng)鑒定結(jié)果，以氧氣需求、革蘭染色、革蘭陽性等作為判定指標(biāo)，反應(yīng)結(jié)果見表2。結(jié)果表明，得到3株分離株的主要代謝特征的結(jié)果均符合產(chǎn)氣莢膜梭菌的生化反應(yīng)。

2.3 產(chǎn)氣莢膜梭菌的PCR鑒定

PCR擴(kuò)增使用了特異性引物，分離株TA01、TA02和TA03的PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳分析后顯示出預(yù)期長度的明亮條帶，與A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的PCR產(chǎn)物相一致。這些PCR產(chǎn)物的特征性長度對(duì)應(yīng)了cpa、cpb、etx、iap和cpb2等毒素基因的擴(kuò)增片段，進(jìn)一步證實(shí)了這3株分離株為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌。目的基因擴(kuò)增引物見表3。

2.4 α毒素和16s RNA基因分析結(jié)果

通過α毒素和16S rRNA基因分析，獲得了關(guān)于產(chǎn)氣莢膜梭菌的分子水平特征的詳細(xì)數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增得到的α毒素基因片段長度符合預(yù)期，分離株TA01、TA02和TA03均顯示了清晰而一致的目的基因片段。經(jīng)過電泳分析，分離株TA01、TA02和TA03的α毒素基因片段分別為600 bp、590 bp和610 bp，與α毒素的特征性大小相符。對(duì)16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行測序和分析，得到了分離株TA01、TA02和TA03的16S rRNA基因序列。比對(duì)數(shù)據(jù)庫后，測序結(jié)果顯示這3株分離株的16S rRNA基因序列與雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌的已知序列高度一致，相似性均超過99%。詳見表4。

該結(jié)果明確了分離株TA01、TA02和TA03為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌，其α毒素基因的存在和16S rRNA基因的高度相似性驗(yàn)證了其屬于雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌，這些數(shù)據(jù)為產(chǎn)氣莢膜梭菌種屬鑒定提供了證據(jù)，同時(shí)也為后續(xù)的耐藥性和毒力機(jī)制研究提供了基礎(chǔ)。

2.5 耐藥性試驗(yàn)結(jié)果

耐藥性試驗(yàn)結(jié)果顯示（表5），3株分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌均表現(xiàn)出相似的耐藥性特征。對(duì)于慶大霉素、卡那霉素、新霉素、多黏霉素B和復(fù)方新諾明，3株分離株均表現(xiàn)出耐藥性。對(duì)于頭孢唑啉、頭孢曲松、頭孢呋辛、氨芐青霉素和哌拉西林等藥物，3株菌株均表現(xiàn)出高度的敏感性。相對(duì)而言，它們對(duì)紅霉素、克林霉素、丁胺卡那霉素等藥物的敏感性呈現(xiàn)出不同程度的變化。耐藥性結(jié)果為了解這些分離株在不同藥物壓力下的適應(yīng)性提供了重要線索，對(duì)于合理使用抗生素和制定治療方案具有指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論與討論

產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種會(huì)引發(fā)嚴(yán)重健康問題的潛在食源性病原體，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)和人類健康構(gòu)成潛在威脅。其在動(dòng)物的腸道內(nèi)會(huì)產(chǎn)生毒素，容易引發(fā)食物中毒的潛在危險(xiǎn)，導(dǎo)致胃腸道疾病，如腹瀉、腹痛、嘔吐等癥狀，給個(gè)體健康帶來嚴(yán)重威脅。在養(yǎng)禽業(yè)中，尤其是家禽養(yǎng)殖過程中，產(chǎn)氣莢膜梭菌的感染可能導(dǎo)致嚴(yán)重的禽流感，給養(yǎng)殖業(yè)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)損失。這一病原體不僅影響禽類的生長發(fā)育，還可能導(dǎo)致大量禽畜的死亡，給養(yǎng)殖者和整個(gè)產(chǎn)業(yè)鏈帶來不可忽視的影響。禽流感的暴發(fā)會(huì)引起廣泛的貿(mào)易禁運(yùn)和動(dòng)植物檢疫措施，對(duì)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)造成重創(chuàng)。因此，防范和控制產(chǎn)氣莢膜梭菌的感染對(duì)于維護(hù)禽類健康和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要[5]。

本研究對(duì)雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌展開了分離、鑒定和研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，分離的3株產(chǎn)氣莢膜梭菌為A型，并通過生化鑒定展示了它們在碳源代謝上的多樣性。通過PCR鑒定和毒素分型，本文明確了A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的毒力基因特征，尤其是α毒素的存在，進(jìn)一步揭示了其在機(jī)體內(nèi)引發(fā)疾病的分子機(jī)制。A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的主要致死性毒素是α毒素，α毒素由cpa基因編碼，具有磷脂酰肌醇酶活性，可引起細(xì)胞膜的破壞，導(dǎo)致細(xì)胞溶解和組織破壞。在機(jī)體內(nèi)，α毒素的活性主要表現(xiàn)在紅細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和其他細(xì)胞上，容易引發(fā)溶血、血栓形成以及炎癥反應(yīng)。此外，α毒素還能夠干擾免疫系統(tǒng)的正常功能，削弱宿主的抵抗力。本研究采用K-B紙片法對(duì)分離株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，系統(tǒng)地評(píng)估了這些產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)

13種抗生素的反應(yīng)情況。結(jié)果表明，這3株A型產(chǎn)氣莢膜梭菌在藥物敏感性方面存在一定的差異。分離株對(duì)慶大霉素、卡那霉素、新霉素、多黏霉素B和復(fù)方新諾明表現(xiàn)出耐藥性，對(duì)頭孢唑啉、頭孢曲松、頭孢呋辛、氨芐青霉素和哌拉西林等抗生素則表現(xiàn)出高度敏感性。值得注意的是，這種耐藥性的差異性可能歸因于不同分離株之間存在的遺傳變異或者環(huán)境因素的壓力選擇。慶大霉素、卡那霉素、新霉素、多黏霉素B和復(fù)方新諾明等抗生素廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖中，因此對(duì)這些抗生素的耐藥性研究具有重要的研究意義。此外，研究頭孢唑啉、頭孢曲松、頭孢呋辛、氨芐青霉素和哌拉西林等抗生素的高度敏感性可為制定合理的養(yǎng)殖管理和抗生素使用政策提供指導(dǎo)。

針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的防控，建議采取綜合的對(duì)策。①加強(qiáng)對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境的衛(wèi)生管理，確保禽畜的飲食和生活環(huán)境衛(wèi)生；②定期對(duì)禽畜進(jìn)行健康監(jiān)測，一旦發(fā)現(xiàn)異常情況，應(yīng)及時(shí)采取隔離措施；③合理使用抗生素，避免濫用，以減少耐藥性的發(fā)生；④加強(qiáng)食品衛(wèi)生安全監(jiān)測，確保畜產(chǎn)品的安全消費(fèi)。

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作者簡介：王燕春（1975—），女，內(nèi)蒙古赤峰人，本科，主任技師。研究方向：微生物檢驗(yàn)，食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測。