土壤含水率對豫中植煙土壤微生物群落多樣性及氮循環(huán)功能基因豐度的影響

劉威 趙園園 陳小龍 史宏志

摘要：為揭示豫中典型濃香型烤煙產(chǎn)區(qū)植煙土壤氮素礦化動態(tài)變化、土壤微生物多樣性以及氮素循環(huán)功能基因?qū)λ謼l件的響應(yīng)特征，通過室內(nèi)培養(yǎng)法研究50%（H-50%）、65%（H-65%）和80%（H-80%））持水量條件下，河南許昌植煙土壤細(xì)菌和真菌群落功能多樣性的差異。結(jié)果表明，H-65%處理土壤的無機(jī)氮礦化量及礦化速率均高于其他處理。在土壤細(xì)菌中，變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）為優(yōu)勢菌門（相對豐度>3%），其中，H-80%處理中變形菌門的相對豐度顯著高于其他處理，而厚壁菌門的相對豐度顯著低于其他處理；H-50%處理中放線菌門、綠彎菌門的相對豐度顯著高于其他處理。在土壤真菌中，子囊菌門（Ascomycota）占土壤真菌總OTU（operational taxonmic units）數(shù)的90%以上，其相對豐度隨土壤含水率增加呈倒“V”的變化趨勢。LEfSe（LDA effect size）分析結(jié)果表明，各處理在細(xì)菌屬水平共檢測出6種活性生物標(biāo)志物（LDA值>3.5）。細(xì)菌群落具有豐富的功能多樣性，一級功能層表現(xiàn)為代謝方面較活躍，二級功能層的功能基因豐度在不同含水率條件下發(fā)生明顯變化；與固氮過程相關(guān)的固氮酶基因nifK、nifD、nifH 的相對豐度在不同處理中表現(xiàn)為H-50%>H-65%>H-80%，反硝化過程相關(guān)基因norB、nirK、nosZ的相對豐度均在H-65%處理最高。綜合來看，合理調(diào)控土壤含水率可以有效調(diào)節(jié)豫中煙區(qū)土壤氮素礦化動態(tài)、土壤微生物群落功能多樣性以及氮循環(huán)相關(guān)功能基因的豐度。

關(guān)鍵詞：氮素礦化；土壤含水率；氮素循環(huán)；功能基因；土壤微生物群落結(jié)構(gòu)

doi：10.13304/j.nykjdb.2022.0810

中圖分類號： S153； S154 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：10080864（2024）01021412

土壤微生物作為構(gòu)成土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在維持土壤生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)、有機(jī)質(zhì)分解、養(yǎng)分供應(yīng)、能量流動等方面發(fā)揮著重要作用[1]。土壤微生物不僅是土壤營養(yǎng)元素微生物礦化、固定的執(zhí)行者，其自身也是土壤養(yǎng)分庫，通過微生物作用與周圍環(huán)境發(fā)生交換，獲得營養(yǎng)物質(zhì)來滿足自身需要，對生態(tài)系統(tǒng)土壤養(yǎng)分的有效性和流動性具有重要作用[23]。土壤氮循環(huán)是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)元素循環(huán)的關(guān)鍵組成部分，主要包括氮異化還原、氮同化還原、反硝化作用、固氮作用、硝化作用等過程[4]。氮礦化是土壤氮素循環(huán)中把有機(jī)氮轉(zhuǎn)化成能被植物吸收利用的無機(jī)氮的過程[56]。

土壤含水率作為土壤氮素轉(zhuǎn)化過程中至關(guān)重要的影響因素，通過改變土壤的孔隙度及孔隙分布影響氧氣在土壤中的流通，進(jìn)而影響微生物活性及其利用有機(jī)質(zhì)的能力，最終影響土壤生態(tài)系統(tǒng)中的氮素礦化過程[7]。

從本質(zhì)上講，氮循環(huán)是由植物、真菌、細(xì)菌和古菌等共同催化的氮化合物氧化還原反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)[8]，其中土壤微生物作為主要的驅(qū)動者通過一系列相互關(guān)聯(lián)的生化途徑在促進(jìn)氮循環(huán)上發(fā)揮著不可或缺的作用[9]。與氮循環(huán)相關(guān)的功能微生物主要通過相關(guān)功能基因的表達(dá)來調(diào)控各過程中關(guān)鍵酶的合成，進(jìn)而調(diào)控土壤氮循環(huán)過程[10]。nifH 作為編碼固氮酶的結(jié)構(gòu)基因，也是固氮微生物最保守的功能基因，在生物固氮中發(fā)揮著重要的指示作用[11]。nirK和nirS 基因編碼催化反硝化過程最關(guān)鍵的酶——亞硝酸還原酶，是反硝化過程中研究最多也是最重要的功能基因[12]。norB、nosZ 基因分別參與了反硝化過程中NO和NO2的還原[13]。amoA 基因的豐度可以表征催化硝化過程氨單加氧酶的活性。因此，通常采用以上功能基因來評價土壤微生物參與的氮循環(huán)過程[14]。

河南作為典型的濃香型烤煙產(chǎn)區(qū)，其氣候特點表現(xiàn)為旺長期雨熱同步，伸根期降雨偏少，成熟期溫度較高[15]?？緹熒趦?nèi)雨熱條件的變化導(dǎo)致其最適土壤相對含水量的不同，勢必會引起土壤中可吸收氮量的差異，使烤煙從生理到形態(tài)上均表現(xiàn)出較大差異。在全球變暖的背景下，土壤水熱環(huán)境發(fā)生極大變化，而土壤含水量作為影響土壤氮循環(huán)的重要外部因子，會引起微生物活性、豐度和群落結(jié)構(gòu)及相關(guān)功能基因的改變。本研究以河南許昌植煙土壤為研究對象，采用室內(nèi)模擬培養(yǎng)的方法，研究植煙土壤的氮素礦化過程、土壤微生物及氮循環(huán)功能基因?qū)λ肿兓捻憫?yīng)，以期為煙草栽培中最適宜土壤含水率的設(shè)置提供理論依據(jù)，并為預(yù)測環(huán)境條件變化對植煙土壤氮素循環(huán)的影響提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤取自濃香型烤煙代表產(chǎn)區(qū)河南許昌（33°95′N，113°55′E），該區(qū)屬暖溫帶季風(fēng)氣候，年均氣溫16.30 ℃，年均降水量91.34 mm，主要集中在7—9月。該地土壤為黃河沉積物發(fā)育的潮土，質(zhì)地為沙壤土。統(tǒng)一于煙株移栽前采集2—20 cm耕層土壤，按“S”形設(shè)置5個采樣點，將各點土樣混合，于室內(nèi)自然風(fēng)干后去除石礫和動植物殘體等，磨細(xì)過0.01 mm篩。取一部分土壤用于土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)的測定，其余儲存于4 ℃冷藏柜，用于室內(nèi)培養(yǎng)。土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)：全氮1.48 g·kg-1，堿解氮68.76 mg·kg-1，有機(jī)質(zhì)10.13 g·kg-1，硝態(tài)氮14.25 mg·kg-1，銨態(tài)氮11.97 mg·kg-1，pH 7.56，田間持水量203.00 g·kg-1。

1.2 試驗設(shè)計與樣品采集

試驗設(shè)置50%（H-50%）、65%（H-65%）、80%（H-80%）共3個田間持水量水平，于35 ℃恒溫培養(yǎng)35 d，各處理重復(fù)3次。稱取過0.01 mm篩的土樣25.00 g裝入100 mL容量瓶中，加入蒸餾水調(diào)節(jié)至設(shè)定含水量。調(diào)節(jié)方法如下：將土樣在容量瓶底均勻鋪開，計算所需的水量，用注射器均勻加入。瓶口用塑料薄膜密封，薄膜上扎2個小孔，保持通氣。期間每隔3 d通過稱重法補(bǔ)充瓶內(nèi)水分。于培養(yǎng)的第7、14、21、28、35天進(jìn)行破壞性取樣，用于測定土壤中硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量；于第35天采集土樣用于分析土壤微生物群落功能多樣性。

1.3 土壤指標(biāo)測定及計算

土壤pH 按照土水質(zhì)量比1.0∶2.5 混合后用pH 計測定；全氮（total nitrogen，TN）含量采用硫酸-催化劑消解-凱氏定氮法測定[16]；土壤有機(jī)質(zhì)（soil organic matter，SOM）含量采用重鉻酸鉀容量法-外加熱測定；堿解氮含量采用堿解擴(kuò)散法[17]測定；土壤田間持水量采用環(huán)刀法測定；土壤硝態(tài)氮（nitrate nitrogen，NO-3-N）、銨態(tài)氮（ammonianitrogen，NH+4-N）含量均使用試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）測定，并根據(jù)試劑盒使用說明書進(jìn)行操作。計算土壤礦質(zhì)氮含量、土壤硝化速率和土壤礦化速率。

土壤礦質(zhì)氮含量=NO-3 含量+NH+4 含量（1）

土壤硝化速率=（各時段土壤NO-3 含量-初始

土壤NO-3 含量）/培養(yǎng)時間（2）

土壤礦化速率=（各時段土壤NO-3 和NH+4 總含量-初始土壤NO-3 和NH+4 含量）/培養(yǎng)時間（3）

1.4 土壤微生物群落分析

1.4.1 DNA提取和PCR擴(kuò)增 土壤總DNA的提取采用HiPure Soil DNA Kit 試劑盒（D3142；廣州美基生物科技有限公司），并用帶有barcode的特異引物對提取的細(xì)菌和真菌基因組進(jìn)行16SrRNA 區(qū)、ITS2 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。其中細(xì)菌引物為341F （CCTACGGGGGCWCAG） 和806R（GGACTACHVGGGTATCTAAT）[18]；真菌引物為ITS3-KYO2 （GATGAAGACGAGYRAA） 和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）[19]。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后進(jìn)行純化，構(gòu)建測序文庫，將純化產(chǎn)物使用Novaseq PE250測序平臺進(jìn)行上機(jī)測序。

1.4.2 聚類與物種注釋 用Usearch軟件對獲得的基因序列進(jìn)行大規(guī)模篩選，并以97%的相似性將序列聚類成為操作分類單元（operationaltaxonomic units，OTUs），使用QIIME軟件包挑選序列集合中豐度最高的序列作為各OTUs的代表序列，這些代表性序列集合用RDP Classifier 的Na?ve Bayesian assignment算法與數(shù)據(jù)庫比對進(jìn)行物種注釋（設(shè)定置信度的閾值為0.8～1.0），獲得各分類水平上的群落組成[2021]。

1.5 數(shù)據(jù)處理分析

利用Excel 2011 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，用Origin2021 作圖，通過SPSS 17.0 用多重比較法進(jìn)行差異顯著性檢驗（P<0.05）?；谝逊诸惖腛TU，利用QIIME 軟件[22]計算細(xì)菌、真菌的α 多樣性，包括Coverage 指數(shù)、Chao1 指數(shù)、Simpson 指數(shù)和Shannon 指數(shù)。利用R 軟件包（R Studio）[23]對細(xì)菌和真菌群落進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principalcoordinate analysis，PCoA）。使用基于線性判別分析（linear discriminant analysis， LDA）[24]的LEfSe（LDA effect size）找到豐度有差異的微生物類群及標(biāo)志性物種，細(xì)菌LDA 閾值為3.5。利用PICRUSt2 軟件進(jìn)行16S rRNA 基因數(shù)據(jù)功能預(yù)測，參考KEGG（kyoto encyclopedia of genes andgenomes）數(shù)據(jù)庫，得到KO（KEGG orthology）功能的豐度預(yù)測表及KEGG 氮循環(huán)途徑相關(guān)基因豐度。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤含水率對土壤氮素礦化特征的影響

2.1.1 土壤含水率對無機(jī)氮礦化量的影響 從整個NO-3-N變化過程來看（圖1），NO-3-N的礦化主要發(fā)生在培養(yǎng)的前21 d，其含量隨培養(yǎng)時間的延長逐漸增加，在培養(yǎng)后期達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。培養(yǎng)結(jié)束時，H-50%、H-65%和H-80%處理的土壤NO-3-N含量分別為63.39、82.19 和64.29 mg·kg-1，其中H-65%處理的NO-3-N含量顯著高于其他處理。即NO-3-N含量隨土壤含水率的增加而增加，超過一定范圍，隨著土壤含水率的繼續(xù)增大，NO-3-N含量反而下降。由圖1可知，NH+4-N的礦化主要發(fā)生在培養(yǎng)的前14 d，隨著培養(yǎng)時間的延長，NH+4-N含量呈速增、平緩、速降的變化規(guī)律，最終穩(wěn)定在較低水平。在培養(yǎng)的各個時期，H-65%處理的土壤NH+4-N 含量顯著高于其他處理。各處理礦質(zhì)氮含量隨著培養(yǎng)時間的延長呈先迅速增加后緩慢增加的趨勢，其中H-65% 和H-80% 處理的礦質(zhì)氮含量在培養(yǎng)35 d時略有下降；在培養(yǎng)過程中，H-65%處理土壤礦質(zhì)氮含量顯著高于其他處理；在培養(yǎng)結(jié)束時，其土壤礦質(zhì)氮含量最高，為99.31 mg·kg-1（圖1）。

2.1.2 土壤含水率對無機(jī)氮礦化速率的影響

由圖2 可知，隨著時間的推移，各處理土壤的硝化速率和礦化速率均表現(xiàn)為先升高后快速降低、最終緩慢降低的趨勢，在第7天時各處理土壤的硝化速率和礦化速率均達(dá)到峰值，其中H-65%處理的硝化速率和礦化速率最高，分別為4.09 和5.49 mg·kg-1·d-1。總體來看，H-65% 處理土壤的硝化速率、礦化速率最高；其次為H-80% 處理；H-50%處理最低。

2.2 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 微生物物種Venn圖分析 細(xì)菌OTUs分析結(jié)果（圖3A）顯示，H-50%、H-65%、H-80%處理檢測到的特有OTU數(shù)分別為1 502、1 203、984；3個處理檢測到的共有OTUs數(shù)為834；且隨著土壤含水率的升高，細(xì)菌OTU數(shù)逐漸減少。真菌OTUs分析結(jié)果（圖3B）顯示，H-50%、H-65%、H-80%處理檢測到的特有OTUs數(shù)分別為220、184、213，共有OTUs數(shù)為97，即真菌OTUs數(shù)表現(xiàn)為H-50%>H-80%>H-65%。

2.2.2 微生物群落在門水平上的組成 由圖4A可知，相對豐度排名前10的菌門涵蓋了土壤樣品中超過98% 的細(xì)菌類群，其中變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的相對豐度大于3%，為優(yōu)勢菌門，累計占比超過90%。由表1可知，變形菌門在H-80%處理中的相對豐度顯著高于其他處理；厚壁菌門在H-50%和H-65%處理中的相對豐度差異不顯著，但均顯著高于H-80%處理；放線菌門和綠彎菌門在H-50%處理中的相對豐度顯著高于其他處理。隨著土壤含水率的升高，變形菌門和浮霉菌門的相對豐度逐漸升高；而放線菌門、綠彎菌門的相對豐度逐漸降低。

由圖4B可知，不同土壤含水率的樣本中平均相對豐度大于1%的真菌門有3個，分別為子囊菌門（Ascomycota）、綠藻門（Chlorophyta）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）。其中子囊菌門占土壤真菌總OTU數(shù)的90%以上，在H-65%處理中的相對豐度略高于其他處理，但差異不顯著（表1）。

2.2.3 物種差異分析 LEfSe分析是一種基于線性判別分析（LDA）效應(yīng)量，并將其與非參數(shù)的Kruskal-Wallis及Wilcoxon秩和檢驗相結(jié)合，從而篩選關(guān)鍵生物標(biāo)記物（即組間差異顯著物種）的分析方法。由圖5 可知，H-50%、H-65% 和H-80% 處理的土壤樣本中存在差異的細(xì)菌分別有18、2 和17 種。在屬水平，苯基桿菌屬（Phenylobacterium）、硝基菌屬（Nitrolancea）、水恒桿菌屬（Mizugakiibacter） 、鏈霉菌屬（Streptomyces）、牙單胞菌屬（Gemmatimonas）、固定桿菌屬（Conexibacter）為6 種活性生物標(biāo)志物（LDA 值>3.5），且表現(xiàn)出顯著差異。其中，鏈霉菌屬、固定桿菌屬為H-50%處理的標(biāo)志微生物；苯基桿菌屬、硝基菌屬、水恒桿菌屬、牙單胞菌屬為H-80% 處理的標(biāo)志微生物； H-65% 處理未檢測到標(biāo)志微生物。

2.3 土壤微生物群落α 和β 多樣性分析

Illumina MiSeq 測序分析表明，利用各樣本在不同測序深度時的微生物OTUs 指數(shù)構(gòu)建稀釋曲線，隨著測序深度的增加稀釋曲線趨于平緩且測序數(shù)據(jù)達(dá)到飽和（圖6），即測序數(shù)據(jù)量能夠覆蓋本研究中絕大部分土壤微生物群落，可以進(jìn)行下一步分析。

Simpson 指數(shù)和Shannon 指數(shù)用來評價群落的多樣性，Chao1 指數(shù)反映群落的豐富度，Coverage 指數(shù)反映群落覆蓋度。對不同土壤含水率條件下土壤細(xì)菌和真菌群落的α 多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果（圖7）表明，不同處理下土壤細(xì)菌和真菌群落的豐富度和多樣性存在差異。

H-65%、H-80% 處理下細(xì)菌的Coverage 指數(shù)顯著高于H-50%處理，而H-50%處理下細(xì)菌的Chao1指數(shù)、Shannon 指數(shù)顯著高于其他處理。真菌在不同含水率處理間的Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)差異不顯著，而H-80% 處理下真菌的Coverage指數(shù)顯著高于其他處理。

細(xì)菌群落主坐標(biāo)分析結(jié)果（圖8）顯示，PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為84.83% 和10.12%?？梢钥闯?，同一處理下不同樣本間的重復(fù)性良好，且不同處理間群落結(jié)構(gòu)差異較大，說明土壤含水率對土壤微生物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響顯著。真菌群落主坐標(biāo)分析結(jié)果（圖8）顯示，PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為74.69%和8.02%?？梢钥闯?，同一處理下不同樣本間的重復(fù)性較差，且不同處理間真菌群落差異不明顯。

2.4 PICRUSt 功能預(yù)測分析

2.4.1 功能基因代謝通路特征 基于PICRUSt2軟件進(jìn)行菌群功能分析，得到不同處理樣品細(xì)菌的功能預(yù)測信息（圖9）。利用KEGG數(shù)據(jù)庫對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，在一層級下所有樣品共涉及6類生物代謝通路，包括細(xì)胞過程（represents cellularprocess）、生物體系統(tǒng)（organismal systems）、代謝（metabolism）、人類疾?。╤uman diseases）、遺傳信息處理（geneticinformation processing）和環(huán)境信息處理（environmental information）。其中占主導(dǎo)功能的是代謝；其次為遺傳信息處理和環(huán)境信息處理。二級功能層共預(yù)測出35種子功能，其中最主要的有24種。

2.4.2 氮素循環(huán)相關(guān)基因變化 基于16S rRNA測序結(jié)果和PICRUSt2工具獲得的KEGG 65個直系同源基因簇（KO）的具體注釋信息。將注釋得到的所有KO值映射到KEGG代謝通路數(shù)據(jù)庫的“氮代謝通路圖”中，可比對出與氮代謝相關(guān)的功能基因，如圖10所示。參與氮循環(huán)5個階段（Ⅰ硝化作用、Ⅱ同化硝酸鹽還原、Ⅲ異化硝酸鹽還原、Ⅳ固氮作用、Ⅴ反硝化作用）的相關(guān)基因共有23個，展現(xiàn)出豐富的氮代謝功能多樣性。

由圖11可知，硝化過程常用氨單加氧酶的編碼基因amoA、amoB、amoC 及羥胺氧化還原酶的編碼基因hao 作為主要的功能基因均在H-50%處理中的相對豐度較高。與固氮作用相關(guān)的固氮酶基因主要包括nifK、nifD、nifH、anfH，其中nifK、nifD、nifH 基因在不同處理中的相對豐度表現(xiàn)為H-50%>H-65%>H-80%，而anfH 基因在H-65% 處理中的相對豐度最高。一氧化氮還原酶基因norB、亞硝酸還原酶基因nirK、氧化亞氮還原酶基因nosZ 作為反硝化作用過程的關(guān)鍵基因均在H-65% 處理中的相對豐度較高。氧化亞氮還原酶基因nirS 在H-50%處理中的相對豐度較高。

3 討論

本研究表明，在一定范圍內(nèi)，土壤NO-3 -N、NH+4 -N含量隨著土壤含水率的增加而增加；超過一定范圍后，其含量隨著土壤含水率的增大反而下降。H-65% 處理土壤的NO-3-N、NH+4-N 含量均顯著高于其他處理，與周才平等[25]的研究結(jié)果相似。這可能是由于土壤中氧氣含量隨著土壤含水率的升高逐漸降低，抑制了氨化作用微生物的活性。隨著培養(yǎng)時間的延長，NH+4-N含量總體上呈速增、平緩、速降的變化規(guī)律，最終穩(wěn)定在較低水平，可能是由于NH+4-N含量的增加抑制了氨化微生物的活性，而以礦化出的NH+4 -N為氮源的土壤微生物迅速繁殖，將NH+4-N逐漸轉(zhuǎn)化為NO-3-N，導(dǎo)致NH+4-N含量逐漸降低[26]。NO-3-N含量隨著培養(yǎng)時間的延長整體呈現(xiàn)上升趨勢，與韓曉飛等[27]研究結(jié)果一致。

本研究表明，隨著土壤含水率的變化，土壤細(xì)菌群落多樣性及豐富度發(fā)生顯著變化，而真菌群落對水分變化的響應(yīng)并不明顯，與Ren 等[28]、Waldrop等[29]的研究結(jié)果一致。這可能是由于水分條件的改變使土壤碳氮含量及養(yǎng)分有效性發(fā)生變化，細(xì)菌、真菌在不同土壤環(huán)境中具有生理差異性[30]。研究發(fā)現(xiàn)，土壤不同細(xì)菌群落存在適宜其生長的水分條件的生態(tài)位[31]。放線菌門作為對固氮作用、硝化作用貢獻(xiàn)率最大的細(xì)菌門[32]，其相對豐度隨著土壤含水率的升高逐漸降低。Barnard等[33]也發(fā)現(xiàn)，在干旱條件下放線菌門的相對豐度較大，變形菌門的相對豐度則隨含水率的升高逐漸升高。變形菌門大多是兼性或?qū)Ｐ詤捬蹙哂休^強(qiáng)的氧化脅迫耐受能力，說明其更適應(yīng)含水率較高的生長環(huán)境，與本研究結(jié)果一致。土壤真菌群落隨著土壤水分梯度的變化也會發(fā)生變化，本研究表明，擔(dān)子菌門的相對豐度隨土壤水分含量的升高逐漸降低，這與劉會會等[34]的研究結(jié)果一致。子囊菌門作為典型的陸生型真菌，占土壤真菌總OTUs數(shù)的90%以上，適應(yīng)在土壤水分低、通氣條件好的環(huán)境中生存與繁殖[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，子囊菌門的相對豐度隨土壤水分含量的升高呈倒“V”型的變化趨勢，即在H-65%處理最高，因此需要進(jìn)一步研究影響其豐度變化的因素。

土壤水分條件的變化能夠影響氮循環(huán)基因的豐度。本研究顯示，nirK 基因的相對豐度隨著土壤含水率的增加呈倒“V”型的變化趨勢，在H-65%處理最高，可能是因為土壤含水率的升高形成了土壤中過度還原的條件，使反硝化底物濃度降低，從而抑制了反硝化微生物的繁殖與生長[4]。研究表明，nirK 基因的相對豐度與NO-3-N、NH+4 -N含量呈顯著正相關(guān)[3，36]，這與本研究H-65%處理中NO-3-N、NH+4-N 含量顯著高于其他處理的研究結(jié)果一致。nirS 基因的相對豐度隨土壤含水率的升高逐漸降低，可能是由于高含水量的土壤環(huán)境不利于氨化作用和反硝化作用[37]。反硝化過程中通過（nirK+nirS）/nosZ 值可預(yù)測N2O 排放，通過提高nosZ 基因豐度，降低該比值使N2O還原大于產(chǎn)生，進(jìn)而減少N2O 的排放[38]。本研究表明，H-65% 處理顯著提高了nosZ 基因的豐度，且（nirK+nirS）/nosZ 值低于其他處理，可減少N2O 的產(chǎn)生，進(jìn)而減小反硝化過程對環(huán)境的污染。與硝化過程相關(guān)的amoA、amoB、amoC 基因的相對豐度均與NO-3-N、NH+4-N含量呈顯著負(fù)相關(guān)[39]，因此不同含水率的土壤可能通過影響其NO-3-N、NH+4-N含量進(jìn)而影響硝化過程相關(guān)功能基因的表達(dá)。

本研究通過室內(nèi)模擬培養(yǎng)的方法解析了不同土壤含水率對氮素礦化及土壤微生物的影響，但是土壤微生物（細(xì)菌、古菌、真菌及病毒）互作機(jī)制及土壤-微生物-煙草系統(tǒng)中三者是否存在協(xié)同進(jìn)化的交互作用及機(jī)制亟待進(jìn)一步研究，因此在今后的研究中有必要在大田生長條件下對功能基因與土壤性質(zhì)、微生物群落結(jié)構(gòu)間的關(guān)系進(jìn)行深入分析，從而揭示土壤氮循環(huán)過程的分子生物學(xué)機(jī)制以及土壤微生物群落與生態(tài)功能間的關(guān)聯(lián)機(jī)制，為有效調(diào)控優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)所需要土壤氮素供應(yīng)量提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］ 范瑞英，楊小燕，王恩姮，等.黑土區(qū)不同林齡落葉松人工林土壤微生物群落功能多樣性的對比研究[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，35（2）：63-68.

FAN R Y， YANG X Y， WANG E Y， et al .. Comparative studieson functional diversity of soil microbial community of larchplantations with different ages in black soil region [J]. J.Beijing For. Univ.， 2013， 35（2）：63-68.

［2］ 仇少君，彭佩欽，榮湘民，等.淹水培養(yǎng)條件下土壤微生物生物量碳、氮和可溶性有機(jī)碳、氮的動態(tài)[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2006，17（11）：2052-2058.

QIU S J， PENG P Q， RONG X M， et al .. Dynamics of soilmicrobial biomass carbon， nitrogen and soluble organic carbonand nitrogen under submerged cultivation [J]. Chin. J. Appl.Ecol.， 2006， 17（11）： 2052-2058.

［3］ 馬秀艷，蔣磊，宋艷宇，等.溫度和水分變化對凍土區(qū)泥炭地土壤氮循環(huán)功能基因豐度的影響[J].生態(tài)學(xué)報，2021，41（17）：6707-6717.

MA X Y， JIANG L， SONG Y Y， et al .. Effects of temperatureand water changes on gene abundance of nitrogen cyclingfunction in peatland soil in permafrost region [J]. J. Ecol.，2021， 41（17）：6707-6717

［4］ 吳照祥，劉巧麗，李輝虎，等.有機(jī)肥對退化紅壤中細(xì)菌群落功能組成影響的PICRUSt 基因預(yù)測分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，49（16）：60-66.

WU Z X， LIU Q L， LI H H， et al .. PICRUSt gene predictionanalysis of the effect of organic fertilizer on the functionalcomposition of bacterial community in degraded red soil [J].Jiangsu Agric. Sci.， 2021， 49（16）：60-66.

［5］ 谷海紅，李巖，劉宏斌，等.土壤氮素礦化及其對烤煙品質(zhì)的影響研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2008，24（10）：327-333.

GU H H， LI Y， LIU H B， et al .. Research progress on soilnitrogen mineralization and its effect on flue-cured tobaccoquality [J]. Chin. Agric. Sci. Bull.， 2008， 24（10）：327-333.

［6］ ZANG X， WANG Q， LI L， et al .. Seasonal variations innitrogen mineralization under three land use types in agrassland landscape [J]. Acta Oecol.， 2008， 34（3）：322-330.

［7］ KLAUS B， ELIZABETH M， BAGGS M， et al .. Nitrous oxideemissions from soils： how well do we understand the processesand their controls？ [J/OL]. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol.Sci.， 2013， 368（1621）：20130122 [2022-08-10]. https：//doi.org/10.1098/rstb.2013.0122.

［8］ COSKUN D， BRITTO D T， SHI W， et al .. How plant rootexudates shape the nitrogen cycle [J]. Trends Plant Sci.， 2017，22（8）：661-673.

［9］ 林偉，李玉中，李昱佳，等.氮循環(huán)過程的微生物驅(qū)動機(jī)制研究進(jìn)展[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，2020，26（6）：1146-1155.

LIN W， LI Y Z， LI Y J， et al .. Research progress on microbialdriving mechanism of nitrogen cycle process [J]. Plant Nutr.Fert. Sci.， 2020， 26 （6）：1146-1155.

［10］ OUYANG Y， EVANS S E， FRIESEN M L， et al .. Effect ofnitrogen fertilization on the abundance of nitrogen cyclinggenes in agricultural soils： a meta-analysis of field studies [J].Soil Boil. Biochem.， 2018， 127（12）：71-78.

［11］ KIZILOVA A K， TITOVA L V， KRAVCHENKO I K， et al ..Evaluation of the diversity of nitrogen-fixing bacteria in soybeanrhizosphere by nifH gene analysis [J]. Microbiology， 2012， 81（5）：621-629.

［12］ 王海濤，鄭天凌，楊小茹，等.土壤反硝化的分子生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展及其影響因素[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2013，32（10）：1915-1924.

WANG H T， ZHENG T L， YANG X R， et al .. Advances inmolecular ecology of soil senitrification and its influencingfactors [J]. J. Agric. Environ. Sci.， 2013， 32（10）：1915-1924.

［13］ KELLY C N， SCHWANER G W， CUMMING J R， et al ..Metagenomic reconstruction of nitrogen and carbon cyclingpathways in forest soil： influence of different hardwood treespecies [J/OL]. Soil Biol. Biochem.， 2021， 156（5）： 108226[2022-08-10]. https：//doi.org/10.1016/j.soilbio.2021.108226.

［14］ 廖李容，王杰，張超，等.禁牧對半干旱草地土壤氮循環(huán)功能基因豐度和氮儲量的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2019，30（10）：3473-3481.

LIAO L R， WANG J， ZHANG C， et al .. Effects of grazingprohibition on gene abundance and nitrogen storage of soilnitrogen cycle function in semi-arid grassland [J]. Chin. J.Appl. Ecol.， 2019， 30（10）：3473-3481.

［15］ 劉曉迎，左璇，劉雅星，等. 河南濃香型煙葉產(chǎn)區(qū)氣候條件分析[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，46（3）：52-58.

LIU X Y， ZUO X， LIU Y X， et al .. Analysis on climatic conditionsin Henan uzhou flavor tobacco leaf production area [J]. J. Henan Agric. Sci.， 2017， 46（3）：52-58.

［16］ 魯如坤. 土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社，2000：1-638.

［17］ 鮑士旦. 土壤農(nóng)化分析[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社：2000：1-495.

［18］ GUO M J， WU F H， HAO G E， et al .. Bacillus subtilis improvesimmunity and disease resistance in rabbits [J/OL]. Front.Microbiol.， 2017， 8：354 [2022-08-10]. https：//doi.org/.10.26914/c.cnkihy.2019.033734.

［19］ TOJU H， TANABE A S， YAMAMOTO S， et al .. High-coverageITS primers for the DNA-based identification of ascomycetesand basidiomycetes in environmental samples [J/OL]. PLoSOne， 2012， 7（7）：e40863 [2022-08-10]. https：//doi.org/10.1371/journal.pone.0040863.

［20］ EDGAR R C. UPARSE： highly accurate OTU sequences frommicrobial amplicon reads [J]. Nat. Methods， 2013， 10（10）：996-998.

［21］ EDGAR R C. Search and clustering orders of magnitude fasterthan BLAST [J]. Bioinformatics， 2010， 26（19）：2460-2461.

［22］ CAPORASO J G， KUCZYNSKI J， STOMBAUGH J， et al ..QIIME allows analysis of high-throughput communitysequencing data [J]. Nat. Methods， 2010， 7（5）：335-336.

［23］ 徐揚(yáng)，張冠初，丁紅，等.土壤類型對花生根際土壤細(xì)菌群落多樣性和產(chǎn)量的影響[J].生物技術(shù)通報，2022，38（6）：221-234.

XU Y， ZHANG G C， DING H， et al .. Effects of soil types onbacterial community diversity and yield in peanut rhizospheresoil [J]. Biol. Bull.， 2022， 38（6）：221-234.

［24］ SEGATA N， IZARD J， WALDRON L， et al .. Metagenomicbiomarker discovery and explanation [J]. Genome Biol.， 2011，12（6）：1-18.

［25］ 周才平，歐陽華.溫度和濕度對暖溫帶落葉闊葉林土壤氮礦化的影響[J].植物生態(tài)學(xué)報， 2001， 25（2）：204-209.

ZHOU C P， OUYANG H. Effects of temperature and humidity onsoil nitrogen mineralization in warm temperate deciduous broadleavedforest [J]. J. Plant Ecol.， 2001，25（2）：204-209.

［26］ 胡坤. 典型香型煙區(qū)植煙土壤氮素礦化及云南大理烤煙減氮增效效果研究[D]. 鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

HU K. Study on nitrogen mineralization of tobacco plantingsoil in typical aromatic tobacco area and effect of nitrogenreduction and efficiency increase of flue-cured tobacco in Dali，Yunnan [D]. Zhengzhou： Henan Agricultural University， 2017.

［27］ 韓曉飛，鄭文冉，徐暢，等.重慶市植煙區(qū)不同肥力植煙土壤氮素礦化特性研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2010，26（24）：188-192.

HAN X F， ZHENG W R， XU C， et al .. Study on nitrogenmineralization characteristics of different fertility tobaccoplanting soils in Chongqing tobacco planting area [J]. Chin.Agric. Sci. Bull.， 2010， 26（24）：188-192.

［28］ REN C J， CHEN J， LU X， et al .. Responses of soil total microbialbiomass and community compositions to rainfall reductions [J].Soil Boil. Biochem.， 2018， 11（6）：4-10.

［29］ WALDROP M P， FIRESTONE M K. Response of microbialcommunity composition and function to soil climate change [J].Microbiol. Ecol.， 2006， 52（4）：716-724.

［30］ 楊陽，陳克龍，章妮，等.青海湖流域高寒濕地土壤微生物群落對不同降水梯度的響應(yīng)[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2022，28（2）：290-299.

YANG Y， CHEN K L， ZHANG N， et al .. Response of soilmicrobial community of alpine wetland in Qinghai Lake basinto different precipitation gradients [J]. J. Appl. Environ. Biol.，2022， 28（2）：290-299.

［31］ LENNON J T， AANDERUD Z T， LEHMKUHL B K， et al ..Mapping the niche space of soil microorganisms using taxonomyand traits [J]. Ecology， 2012， 93（8）：1867-1879.

［32］ 徐惠風(fēng)，劉興土，白軍紅.長白山溝谷濕地烏拉苔草沼澤濕地土壤微生物動態(tài)及環(huán)境效應(yīng)研究[J].水土保持學(xué)報，2004，18（3）：115-117，122.

XU H F， LIU X T， BAI H J. Study on soil microbial dynamicsand environmental effects of carex wula swamp wetland inChangbai mountain valley wetland [J]. J. Soil Water Conserv.，2004，18（3）：115-117，122.

［33］ BARNARD R L， OSBORNE C A， FIRESTONE M K. Responsesof soil bacterial and fungal communities to extreme desiccation andrewetting [J]. ISME J.， 2013， 7（11）： 2229-2241.

［34］ 劉會會， 喻慶國， 王行， 等. 碧塔海濕地不同水分梯度下土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及功能類群研究[J]. 微生物學(xué)報，2022，62（8）：3007-3023.

LIU H H， YU Q G， WANG X， et al.. Study on community structureand functional groups of soil fungi under different water gradientsin Bitahai wetland [J]. J. Microbiol.， 2022， 62（8）：3007-3023.

［35］ TANG Y S， WANG L， JIA J W， et al .. Response of soilmicrobial community in Jiuduansha wetland to differentsuccessional stages and its implications for soil microbialrespiration and carbon turnover [J]. Soil Biol. Biochem.， 2011，43（3）：638-646.

［36］ 張文學(xué)，王少先，夏文建，等.脲酶抑制劑與硝化抑制劑對稻田土壤硝化、反硝化功能菌的影響[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，2019，25（6）：897-909.

ZHANG W X， WANG S X， XIA W J， et al.. Effects of ureaseinhibitor and nitrification inhibitor on functional nitrifier anddenitrifier in paddy soil [J]. Plant Nutr. Fert. Sci.， 2019， 25（6）：897-909.

［37］ 國秀麗.溫度和水分對土壤碳、氮轉(zhuǎn)化影響的研究[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2003.

GUO X L. The country is beautiful study on the effects oftemperature and water on the transformation of soil carbonand nitrogen [D]. Changchun： Jilin Agricultural University，2003.

［38］ LEVY-BOOTH D J， PRESCOTT C E， GRAYSTON S J.Microbial functional genes involved in nitrogen fixation，nitrification and denitrificati on in forest ecosystems [J]. SoilBiol. Biochem.， 2014， 75（8）：11-25.

［39］ 馬龍， 高偉， 欒好安， 等. 有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式對設(shè)施菜田土壤氮循環(huán)功能基因豐度的影響[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，2021，27（10）：1767-1778.

MA L， GAO W， LUAN H A， et al .. Effects of partial substitutionof chemical fertilizer with manure and/or straw on the abundanceof functional genes related to soil N-cycling [J]. Plant Nutr. Fert.Sci.， 2021， 27（10）：1767-1778.

（責(zé)任編輯：張冬玲）