基于TLR4信號(hào)通路探討宣肺化濕止咳湯干預(yù)CVA豚鼠氣道重塑機(jī)制研究

★ 羅惠娥 范亞國(guó) 何軍 丁兆輝（.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330006；.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌 330006）

咳嗽變異性哮喘（cough variant asthma，CVA）是臨床較為常見(jiàn)的哮喘類(lèi)型，以干咳為主要癥狀，癥狀常在夜間、凌晨或運(yùn)動(dòng)時(shí)加劇，雖然沒(méi)有典型哮喘的呼吸困難癥狀，但仍然存在氣道高反應(yīng)性和慢性炎癥癥狀［1］。目前，我國(guó)CVA的發(fā)生率呈明顯上升趨勢(shì)，引起專(zhuān)家學(xué)者的廣泛關(guān)注和重視［2］。CVA的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，主要改變涉及氣道重塑、氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥等［3］。慢性炎癥損傷氣道上皮細(xì)胞，長(zhǎng)期暴露的迷走神經(jīng)末梢會(huì)使感受器興奮閾值下降，容易被微小的刺激激惹，使小氣道收縮，刺激神經(jīng)末梢咳嗽感受器，使患者發(fā)生咳嗽［4-5］。CVA是由細(xì)胞因子、炎癥因子、炎癥介導(dǎo)、變態(tài)反應(yīng)性炎癥等多種機(jī)制引起。TOLL樣受體（TLR）是從果蠅身上發(fā)現(xiàn)的模式識(shí)別受體，能夠通過(guò)對(duì)病原體的識(shí)別及相關(guān)炎癥因子的調(diào)節(jié)以激活固有免疫及適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，與哮喘的發(fā)生密切相關(guān)。TLR屬于跨膜糖蛋白，TLR4可能介導(dǎo)CVA。作為固有免疫系統(tǒng)中結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性剖析比較透徹的模式識(shí)別受體，TLR4與CVA的發(fā)病有著密切的關(guān)系［6］。氣道上皮細(xì)胞TLR4的表達(dá)參與吸入過(guò)敏原介導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞反應(yīng)。這證明不同細(xì)胞表達(dá)的TLR4對(duì)吸入過(guò)敏原產(chǎn)生的免疫應(yīng)答具有不同程度的調(diào)控作用［7］。Meta分析結(jié)果顯示，TLR4中rs4986791基因變異會(huì)增加哮喘發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，且突變基因rs1927907可能與哮喘的嚴(yán)重程度有關(guān)。胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞（TSLP）由上皮細(xì)胞分泌，在氣道重塑中起關(guān)鍵作用，TLR4的活化可以促進(jìn)TLSP的生成，TLR4抑制劑則可通過(guò)抑制TLSP表達(dá)改善氣道重塑［8］。隨著中醫(yī)的發(fā)展，中醫(yī)在治療各種疾病上具有獨(dú)特的見(jiàn)解。CVA在中醫(yī)學(xué)屬于“久咳”“哮喘”等范疇。本病臨床多見(jiàn)濕熱郁肺證型，其主要病理特征為濕熱郁痹，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)CVA氣道炎癥、氣道重塑可能存在必然的相關(guān)性［9-10］。而宣肺化濕止咳湯以清熱化濕、宣肺止咳為主要功效，對(duì)濕熱郁肺型CVA具有明顯臨床療效［11］，宣肺化濕止咳在治療濕熱郁肺型CVA上是否通過(guò)影響TLR4信號(hào)通路而減輕其氣道炎癥及延緩其氣道重塑。因此本文用豚鼠建立CVA模型，采用宣肺化濕止咳湯和孟魯司特鈉進(jìn)行療效比較，分析宣肺化濕止咳湯對(duì)TLR4信號(hào)通路影響CVA的作用機(jī)制，進(jìn)一步為臨床治療CVA提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只清潔級(jí)豚鼠作為研究對(duì)象，均為雄性，平均年齡（3.84±0.42）周。體重90~110 g，平均體重（100.5±12.2）g。

1.2 主要藥物

宣肺化濕止咳湯配方顆粒主要藥物：炙麻黃10 g，連翹10 g，赤小豆30 g，枇杷葉10 g，蔻仁10 g，桑白皮15 g，桔梗10 g，前胡10 g，厚樸10 g，杏仁10 g，甘草6 g。以上中藥均為顆粒劑（廣東一方制藥有限公司）。孟魯司特鈉片（順爾寧，杭州默沙東制有限公司，批號(hào)17047，10 mg）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組方法 將60只豚鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，觀察呼吸次數(shù)、體重、進(jìn)食水量等基礎(chǔ)生命體征無(wú)明顯差異，按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，包括空白組、模型組、宣肺化濕止咳湯組、孟魯司特鈉組，各15只。

1.3.2 造模方法 本造模方法參考咳嗽變異性哮喘的造模方式［12］，采用經(jīng)典的卵蛋白（OVA）和氫氧化鋁激發(fā)致敏并用OVA激發(fā)的方法復(fù)制CVA模型豚鼠。正常飼養(yǎng)3 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，除空白組外，其余各組均在第1、8天每只豚鼠腹腔注射10%OVA和氫氧化鋁混合溶液1 mL致敏。從第15天起，模型組及各給藥組豚鼠置于密閉有機(jī)玻璃罩內(nèi)，給予含1% OVA溶液的生理鹽水超聲霧化激發(fā)2 min，每天1次，共10 d。激發(fā)時(shí)觀察豚鼠反應(yīng)，如出現(xiàn)咳嗽、豎毛、噴嚏、干嘔、腹肌抽動(dòng)、極度煩躁等現(xiàn)象中2種或2種以上者，或抽搐、虛脫現(xiàn)象之一者，判定為造模成功。

1.3.3 模型制備 將咳嗽變異性哮喘病的造模方法與濕熱證的造模方法相結(jié)合進(jìn)行咳嗽變異性哮喘濕熱證模型制備。

第l天、第8天：每只腹腔注射OVA溶液1 mL/次。第8天OVA致敏后開(kāi)始放入人工氣候箱中，溫度（32.0±0.5）℃，相對(duì)濕度（90±5）%，每天造模時(shí)間為8∶00—12∶00和13∶00—17∶00，連續(xù)1周。

第15天開(kāi)始1% OVA溶液霧化，30 min/（次·只）。第16天開(kāi)始濕熱環(huán)境暴露改為4 h（13∶00—17∶00）。霧化與濕熱環(huán)境暴露交替進(jìn)行，均隔日1次，連續(xù)4周，全程高脂高蛋白飼料喂養(yǎng)。

高脂高蛋白飼料配方：普通鼠類(lèi)飼料65%，豬油15%，雞蛋10%，全脂奶粉5%，蔗糖3%，芝麻油1%，食鹽0.8%，豬膽鹽0.2%。

模型鑒定方法：豚鼠在激發(fā)后出現(xiàn)咳嗽、撓鼻、伸頸、口周發(fā)紺、行動(dòng)遲緩等癥狀，并有濕熱證的表現(xiàn)，如嗜臥、行動(dòng)呆滯、飲水少、便溏臭穢、小便黃、舌質(zhì)紅、苔黃膩等，則為造模成功。

1.4 給藥方法

造模成功后，空白組、模型組予以同等劑量生理鹽水。孟魯司特鈉組按孟魯司特鈉0.01 mg/（g·d），制成混懸液灌胃，4 ℃保存。宣肺化濕止咳湯組取顆粒加蒸餾水分別配制成濃度為0.74、1.48、2.22 g/mL的溶液灌胃。每日1次，連續(xù)10 d，給藥劑量均為0.17 mL/（g·d）。

1.5 取材方法

治療結(jié)束后，先將大鼠禁食（可自由飲水）24 h，稱(chēng)量各組大鼠體質(zhì)量，用10%的水合氯醛按照300 mg/kg麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在頸部及前胸部通過(guò)正中切口暴露氣管及臟、肺，分離氣管，并剪取100 mg氣管，用以做氣管羥脯氨酸測(cè)定。結(jié)扎右主支氣管后，左肺行支氣管肺泡灌洗術(shù)，分2次進(jìn)行，分別灌入0.9% NaCl 3、4 mL，共計(jì)7 mL。每次灌注完畢，輕揉肺葉1~2 min，再回收支氣管肺泡灌洗液（BALF），將2次收集的BALF均勻混合，回收液以1 500 r/min離心5 min，取上清液，-20 ℃貯存待檢測(cè)。

1.6 細(xì)胞的分類(lèi)及計(jì)數(shù)檢測(cè)

末次霧化結(jié)束24 h后，用10%的水合氯醛按照300 mg/kg麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在頸部及前胸部通過(guò)正中切口暴露氣管及臟、肺，分離氣管，并剪取100 mg氣管，用以做氣管羥脯氨酸測(cè)定。每只豚鼠收集BALF 10 mL離心，沉淀物涂片固定。取右肺中葉在浸泡于4%多聚甲醛室溫固定，用以HE染色、Masson染色等。

1.7 氣道重塑相關(guān)指標(biāo)測(cè)量

Masson染色并采用Image- Pro Plus圖像分析軟件測(cè)量氣道膠原沉積的面積，同時(shí)測(cè)氣道壁相關(guān)數(shù)值。

1.8 蛋白免疫印跡法檢測(cè)肺組織TLR4、NF-κB的表達(dá)

取豚鼠肺組織100 mg提取總蛋白后，經(jīng)電泳轉(zhuǎn)膜封閉后，豚鼠PPAR-γ、TLR4、NF-κB、NLRP3 ADPN一抗孵育，采用HRP標(biāo)記的二抗，以ECL發(fā)光液顯色，采用Alphaease FC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.9 觀察指標(biāo)

（1）觀察4組豚鼠肺泡灌洗液中細(xì)胞的分類(lèi)及計(jì)數(shù)。（2）觀察4組豚鼠氣道重塑相關(guān)指標(biāo)，包括支氣管基底膜周長(zhǎng)（Pbm）、內(nèi)壁面積（WAi）以及氣道平滑肌面積（WAm）水平。測(cè)得數(shù)據(jù)采用Pbm進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，反映氣道重塑程度。（3）觀察4組豚鼠肺組織TLR4、NF-κB的表達(dá)水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，方差不齊用Welch法近似方差分析。兩兩比較方差齊用LSD法，方差不齊用Games- Howell法檢驗(yàn)。非正態(tài)分布、方差不齊者組間比較采用非參數(shù)Kruskal-1i檢驗(yàn)，兩兩比較采用All Pairwise檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺泡灌洗液中細(xì)胞的分類(lèi)及計(jì)數(shù)比較

與空白組比較，模型組、魯司特鈉組、宣肺化濕止咳湯組肺泡灌洗液中各細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，宣肺化濕止咳湯組和孟魯司特鈉組各細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯降低（P<0.05）；而宣肺化濕止咳湯組與孟魯司特鈉組各細(xì)胞計(jì)數(shù)比較無(wú)顯著差異（P>0.05）。見(jiàn)表1。

表1 4組豚鼠肺泡灌洗液中細(xì)胞的分類(lèi)及計(jì)數(shù)比較（n=15） ×108/L

2.2 氣道重塑相關(guān)指標(biāo)比較

與空白組比較，模型組、魯司特鈉組、宣肺化濕止咳湯組WAi/Pbm、WAm/Pbm水平明顯增大（P<0.05）；與模型組比較，宣肺化濕止咳湯組和孟魯司特鈉組WAi/Pbm、WAm/Pbm水平均顯著降低，且宣肺化濕止咳湯組低于孟魯司特鈉組（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 4組豚鼠氣道重塑相關(guān)指標(biāo)比較（n=15）

2.3 肺組織TLR4、NF-κB表達(dá)水平比較

與空白組比較，模型組、魯司特鈉組、宣肺化濕止咳湯組TLR4、NF-κB表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，宣肺化濕止咳湯組和孟魯司特鈉組TLR4、NF-κB表達(dá)水平均顯著下降，且宣肺化濕止咳湯組低于孟魯司特鈉組（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 4組豚鼠肺組織TLR4、NF-κB表達(dá)水平比較（n=15）

3 討論

CVA是以咳嗽為唯一或主要癥狀的一種特殊類(lèi)型的哮喘［13］。CVA患者大多數(shù)無(wú)喘息、氣急等特征，但可存在氣道高反應(yīng)性。32%~54%的CVA患者可發(fā)展為典型哮喘，提示CVA可能是支氣管哮喘的早期，與哮喘存在相同的發(fā)病機(jī)制［14］。CVA是我國(guó)慢性咳嗽最常見(jiàn)的病因，其發(fā)病率有所增加［15-16］。隨著對(duì)咳嗽變異性哮喘病理生理的進(jìn)一步研究，國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家發(fā)現(xiàn)CVA患者存在不同程度的氣道重塑?？人宰儺愋韵c典型哮喘具有相同的發(fā)病機(jī)制與病理生理特點(diǎn)。氣道重塑不僅是CVA持續(xù)性氣道高反應(yīng)性、不可逆性氣道阻塞的重要病理基礎(chǔ)，而且是CVA遷延難愈的主要原因［17-18］。研究表明，CVA的發(fā)病機(jī)制多從氣道重塑、氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥、喘息閾值改變等方面論述［19］。其中，以嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的氣道炎性反應(yīng)及相關(guān)形態(tài)重塑是影響CVA發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制［20］。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為濕熱郁肺為CVA發(fā)病的重要病因，濕熱郁肺之證，濕熱在肺，肺氣郁遏，僅靠宣肺恐難以對(duì)此類(lèi)咳嗽起效。該病濕熱郁滯，肺失宣降的病理特征與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中CVA氣道炎癥、氣道重塑可能存在必然的相關(guān)性。在濕熱治療方面，根據(jù)濕熱郁閉肺氣、肺失宣降的病機(jī)，提出宣肺與化濕二法相結(jié)合，可使?jié)駸岢?、氣道暢，肺氣方得宣降?fù)常，而咳嗽自愈。宣肺化濕止咳湯是課題組廣泛應(yīng)用于CVA濕熱郁肺證患者治療的經(jīng)驗(yàn)方，療效顯著。該方由麻黃連翹赤小豆湯加減而成，可達(dá)到宣肺化濕、疏通氣道之效［21］。“濕熱郁肺”與CVA氣道炎癥、氣道重塑存在必然的相關(guān)性，宣肺化濕止咳湯可能是防治CVA有效途徑。因此本文采用豚鼠建立CVA模型，采用宣肺化濕止咳湯進(jìn)行治療，并采用孟魯司特鈉進(jìn)行比較，分析對(duì)CVA的治療效果。在本研究結(jié)果中，采用宣肺化濕止咳湯和孟魯司特鈉對(duì)于肺泡灌洗液中的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞以及細(xì)胞總數(shù)均可降低，提示宣肺化濕止咳湯和孟魯司特鈉均能有效抑制豚鼠CVA模型的氣道炎癥，從而減輕CVA豚鼠模型的病情。氣道重塑是目前臨床認(rèn)為CVA存在的主要變化，不僅是CVA持續(xù)性氣道高反應(yīng)性、不可逆性氣道阻塞的重要病理基礎(chǔ)，而且是CVA遷延難愈的主要原因［22］。在本文研究中發(fā)現(xiàn)，宣肺化濕止咳湯組和孟魯司特鈉組WAi/Pbm、WAm/Pbm水平均顯著降低，且宣肺化濕止咳湯組低于孟魯司特鈉組。結(jié)果提示，宣肺化濕止咳湯有利于改善CVA豚鼠模型的氣道重塑癥狀，抑制氣道重塑的發(fā)生。由于宣肺化濕止咳湯中炙麻黃能發(fā)汗解表、宣肺平喘；連翹能清熱解毒，疏風(fēng)去邪；赤小豆能利水消腫、解毒排膿；枇杷葉能清肺止咳；前胡能解表退熱；甘草理氣和中、調(diào)和諸藥。全方起到宣肺化濕、疏通氣道之效，對(duì)咳嗽變異性哮喘具有良好治療效果。

TLR4與哮喘的發(fā)生有密切關(guān)系，有學(xué)者研究表明，TLR4上的rs4986791基因突變，增加哮喘發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，而rs1927907基因突變則與哮喘的嚴(yán)重程度有關(guān)［23］。PM2.5被人體吸入氣道后，激活TLRs通路，誘導(dǎo)哮喘的發(fā)作。TLR4能促進(jìn)胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞的分泌，從而加重氣道的炎癥反應(yīng)。NF-κB目前也被認(rèn)為與哮喘的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系，NF-κB位于TLRs下游信號(hào)通路，可以被TLR4激活，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生［24］。在觀察4組患者細(xì)胞因子的TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，宣肺化濕止咳湯組和孟魯司特鈉組TLR4、NF-κB均顯著下降，且宣肺化濕止咳湯組低于孟魯司特鈉組。結(jié)果表明，宣肺化濕止咳湯能有效降低TLR4、NF-κB蛋白水平。

綜上所述，宣肺化濕止咳湯可能通過(guò)下調(diào)肺組織中TLR4水平，從而有效調(diào)控咳嗽變異性哮喘的臨床癥狀，改善CVA模型豚鼠的細(xì)胞因子水平，減輕氣道重塑。