基于生物信息學改造天然抗菌肽的研究

■ 宋雪瑩 高圣玥 李 平 宋 巖 趙金波 李 莉 唐玲玲 李夢姝

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 160000）

抗生素的發(fā)現(xiàn)與使用有效解決了病原菌感染給畜牧生產(chǎn)帶來的損失，也曾作為生長促進劑添加到飼料中，解決低日齡畜禽因免疫系統(tǒng)不完善而發(fā)病等問題[1]。但抗生素的長期大量使用，所引發(fā)的問題日益突出。病原菌耐藥性的不斷累積，導致超級細菌的出現(xiàn)，使得對抗生素的使用更為謹慎[2-4]。同時，畜禽體內(nèi)會殘留抗生素，轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)，危害人類健康[5-6]。自2020 年起，我國畜禽飼料中已經(jīng)停止使用促生長類抗生素（中藥類除外）[7]。因此，開發(fā)新型安全、具有抗菌作用、可替代抗生素的飼料添加劑成為研究的熱點。

抗菌肽（AMPs）由生物機體先天免疫系統(tǒng)產(chǎn)生，含6～50 個氨基酸，呈陽離子型，具有抗菌、抗病毒、抗寄生蟲、抗腫瘤細胞等作用[8]。AMPs對病原菌不產(chǎn)生耐藥性，在替代抗生素作用上具有重大潛力。天然AMPs 來源廣泛，植物、細菌、原核生物、昆蟲、哺乳動物均可產(chǎn)生[9-11]，AMPs 通過多種機制殺死細菌，包括膜破壞、干擾細菌代謝和靶向細胞質(zhì)成分[12]。但天然抗菌肽氨基酸序列存在冗余區(qū)域、溶血和細胞毒活高、穩(wěn)定性差等缺點[13]?；谏镄畔W方法，可對天然AMPs進行改造，通過修飾、替換、截短、重頭設(shè)計等方法獲得活性高且穩(wěn)定的新型抗菌肽。

1 生物信息學在線軟件

利用生物信息學在線軟件，可對改造前后AMPs的二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、穩(wěn)定性、細胞毒性等進行科學地模擬和預(yù)測，確保改造后表達的抗菌肽具有較高抗病原體活性、穩(wěn)定性和低毒性，既節(jié)約了科研時間又節(jié)約了成本?，F(xiàn)階段，常用的抗菌肽分子設(shè)計和預(yù)測在線分析工具見表1。將多肽的氨基酸序列或Fasta 格式輸入在線軟件中，選擇相應(yīng)參數(shù)可對其不同性質(zhì)進行分析和預(yù)測。

表1 常用抗菌肽分子設(shè)計和預(yù)測在線分析工具

2 AMPs的改造內(nèi)容

影響抗菌肽活性的主要因素包括肽鏈長度、凈電荷、兩親性和二級結(jié)構(gòu)等?？咕牡母脑彀逆溸m宜的長度、凈電荷數(shù)、親水性和疏水性，結(jié)構(gòu)簡單，對蛋白酶穩(wěn)定等，可以提高AMPs的活性。

2.1 AMPs的肽鏈長度

在一定范圍內(nèi)，抗菌肽肽鏈長度的增加可提高抗菌活性，但過長也會增強對動物機體產(chǎn)生毒副作用[14]。Erbani等[15]篩選CecropinA-Magenin2雜交肽及其截短衍生肽的抗真菌特性，即CMT1、CMT2 和CMT3，分別為10、8、6 個氨基酸殘基，雖具有相同疏水性，但隨著分子大小的降低，活性逐漸降低，其中含有10 個氨基酸殘基的CMT1抗真菌能力較強，毒性較小。

2.2 AMPs的凈電荷

凈電荷指抗菌肽肽鏈中氨基酸所帶正、負電荷的總和。病原菌細胞膜的磷脂酰肌醇呈負電性，抗菌肽在靜電作用下與其結(jié)合，使細胞膜去極化，形成通道或孔，從而導致細胞膜功能障礙和細胞死亡[16]。由于哺乳動物細胞膜呈中性，富含磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿和鞘磷脂等兩性分子，使得抗菌肽不與動物體細胞發(fā)生作用，避免了對機體自身的損傷[17]。因此，增加帶正電荷的氨基酸的數(shù)量或改變它們在肽鏈中的位置會影響AMPs 的二級結(jié)構(gòu)，從而進一步影響其抗菌活性[18]。

為研究凈電荷對膜活性肽生物活性的影響，Katrina 等[19]以抗菌肽P（A12L/A20L）為模板，通過氨基酸替代的方法，設(shè)計含有不同電荷的多肽序列，采用Fmoc 固相法合成多肽；經(jīng)抗癌癥細胞試驗表明，改造后抗癌多肽隨著凈電荷的增加抗菌活性增強，當多肽所帶凈電荷過高時，二級構(gòu)型發(fā)生變化，穩(wěn)定性降低，結(jié)果表明，抗癌多肽凈電荷的最適的范圍為+7～+8。

2.3 AMPs的兩親性

抗菌肽的兩親性包括親水性和疏水性，基于抗菌肽兩親性，與病原體質(zhì)膜間發(fā)揮作用的模型有以下幾種：桶板模型[20]、螺旋孔模型[21]、地毯式模型[22]、聚集模型[23]等4 種模型。桶板模型是AMPs 親水基團插入病原體細胞膜內(nèi)側(cè)，疏水基團在細胞膜外側(cè)，形成桶板結(jié)構(gòu)，破壞膜完整性。螺旋孔模型是AMPs 與病原體細胞膜疏水基接觸，取代極性頭部，形成缺口，導致細胞膜變薄。地毯式模型類似于桶板機理，AMPs 肽鏈中疏水基團與病原體細胞膜中磷脂膜相向，親水基團在質(zhì)膜外，聚集在膜表面，導致細胞膜喪失功能。聚集模型是AMPs 在細菌細胞膜表面，與膜表面脂質(zhì)雙分子層形成復(fù)合物，導致細胞膜彎曲，抗菌肽進入膜內(nèi)部，細菌破裂死亡。對AMPs 兩親性發(fā)揮活性機理的研究發(fā)現(xiàn)，其疏水性越強，抗菌活性越強[24]；但隨著疏水性的增強，肽的毒性增強，表現(xiàn)為溶血性增強[25]。色氨酸（Try）、芳香氨基酸替換可增強肽的疏水性，促進多肽與膜的相互作用。

為進一步證明抗菌肽兩親性對活性的影響，將天然抗菌肽Leucocin A，經(jīng)精氨酸（Arg）和亮氨酸（Leu）替代原始肽中帶負電荷氨基酸和不帶電荷親水氨基酸，優(yōu)化兩親性結(jié)構(gòu)，從而篩選出抗菌活性較好的WRL7，再用亮氨酸（Leu）分別替代甘氨酸（Gly），獲得3 條極性一側(cè)均為正電荷氨基酸，非極性一側(cè)均為疏水性氨基酸的衍生肽，抑菌試驗結(jié)果表明，完整的兩親性結(jié)構(gòu)抑菌效果更明顯[26]。

2.4 AMPs的二級結(jié)構(gòu)

抗菌肽的二級結(jié)構(gòu)包括α-螺旋、β-折疊、環(huán)狀結(jié)構(gòu)和無規(guī)則延伸。在已發(fā)現(xiàn)的天然抗菌肽中，α-螺旋肽種類和數(shù)量最多，且具有廣譜抗菌性。α-螺旋在序列排列上呈現(xiàn)周期性，易于提高肽兩親性來影響活性[27]?？咕男蛄兄邪被峤M成直接影響α-螺旋程度，其中，苯丙氨酸（Phe）不利于螺旋形成，色氨酸（Trp）對螺旋含量的影響不明顯，纈氨酸（Val）的螺旋結(jié)構(gòu)傾向大于Phe和Trp[28]。除此之外，氨基酸殘基之間的接觸也決定肽最終構(gòu)象[29]。

β-折疊較α-螺旋結(jié)構(gòu)具有更強穩(wěn)定性，抗酶解能力更強[30]。環(huán)狀結(jié)構(gòu)可促使多肽親水性和疏水性間的平衡，減少肽與紅細胞膜脂質(zhì)間作用，降低了溶血性。

3 AMPs的改造方法

以天然抗菌肽序列為基礎(chǔ)，通過氨基酸替代，不同肽間雜合，去除無活性氨基酸殘基縮短肽鏈長度等方法，可獲得新型抗菌肽，以提高多肽活性和安全性。

3.1 AMPs氨基酸殘基替代

牛血紅蛋白最早從牛血液中分離獲得，具有抗菌活性，但穩(wěn)定性較差。鄧麗等[31]以抗菌肽數(shù)據(jù)庫內(nèi)牛血紅蛋白β亞基氨基酸的序列為基礎(chǔ)，篩選活性區(qū)域，獲得1 條多肽YKK-18（KKVLDSFSNGMKHLDDLK），將其作為模板，采用氨基酸替換方法，設(shè)計了3條改 造 多 肽LJ-1（RRVLRSFSKGMKWLDRLL）、LJ-2（RRVLRILKHHQGLIRNLL）和DLK-3（KKVLRSFRRLMKRLSRLL），根據(jù)生物信息軟件預(yù)測，均為帶正電荷的親水性多肽，呈α-螺旋結(jié)構(gòu)。經(jīng)最小抑菌濃度試驗，而改造多肽對測試的大腸桿菌、沙門氏菌、綠膿假單胞菌、葡萄球菌、白色念珠菌等均有不同程度的抗菌活性，對革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、沙門氏菌、綠膿假單胞菌）、革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）、真菌（白色念珠菌）表現(xiàn)出優(yōu)于模板肽的活性。同時，理化穩(wěn)定性試驗表明，改造肽LJ-1和LJ-2在高溫、高酸堿性和高離子濃度條件下，仍表現(xiàn)出較好抗菌活性。因此，利用氨基酸替代方法，可獲得活性更好、穩(wěn)定性更強的新型抗菌肽。

以林蛙抗菌肽Chensirin 和家蠅抗菌肽CecMd 的雜交肽CC34（GWLKKIGKKIERVGQHTRDAILPILSLI GGLLGK）的氨基酸序列為模板，采用氨基酸替換的方式對序列進行改造，得到CC34PA（GWLKKIGKKIPRVGQHTRAAILPILSLIGGLLGK）、CC34PL（GWLKKIGKKIPRVGQHTRLAILPILSLIGGLLGK）、CC34K11（GWLKKIGKKIKRVGQHTRDAILPILSLIGGLLGK）、CC34P11（GWLKKIGKKIPRVGQHTRDAILPILSLIGGLLGK）4 種改造肽。經(jīng)生物信息工具分析，改造肽提高了肽鏈的兩親性。抑菌試驗表明，4 種改造肽對革蘭氏陽性菌和陰性菌均有較強抑制作用[32]。

史霖等[33]對人源抗菌肽LL-37 的多個氨基酸進行了替換，獲得衍生抗菌肽GLL-37，測定其抗菌活性和抗蛋白酶解能力，結(jié)果表明GLL-37 較LL-37 抗彈性蛋白酶的水解能力更強，且在高鹽離子濃度下，GLL-37 也較LL-37 具有更強的抗菌活性。劉志新等[34]根據(jù)抗菌肽PMAP-23 的作用機理和氨基酸組成，將PMAP-23 N 端α-螺旋親水面第5 位亮氨酸改為帶有正電荷的精氨酸，重新設(shè)計合成新型抗菌肽PMAP-23LR，體外抑菌試驗結(jié)果顯示，PMAP-23LR對金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門菌、禽巴氏桿菌、產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的抑菌活性增強；穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示，PMAP-23LR具有更強的耐酸堿性和熱穩(wěn)定性。

由此可見，通過氨基酸替換的方式，改變模板肽的兩親性、電荷數(shù)、二級結(jié)構(gòu)，進而提高改造肽的抗菌活性和穩(wěn)定性。

3.2 AMPs雜合

將兩種或兩種以上不同來源的抗菌肽保守序列，通過分子改造，合成一條肽鏈，從而提高多肽廣譜性和活性。根據(jù)天蠶素和死亡素氨基酸序列，設(shè)計了含有天蠶素N 端1～7 個氨基酸殘基和死亡素N-末端4～19 個氨基酸殘基組成的雜交肽CA（1～7）-t（4～19），抑菌試驗結(jié)果表明，雜合肽對常見的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌具有較強的抗菌活性[35]。

以抗菌肽Cec4 為母肽，將其與家蠅Cecropin 肽、蜂毒素、死亡素肽和蛙皮肽成熟肽序列雜合，經(jīng)氨基酸序列比對，理化性質(zhì)分析，三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，設(shè)計抗菌能力更強的6 條雜合肽。抑菌試驗表明，雜合肽Cec4-2-1對大腸桿菌抑菌效果優(yōu)于母肽，6條雜合肽對人紅細胞均無溶血性[36]。另有研究，蜂毒素（Melittin）是呈堿性陽離子的多肽，具有較強的抑菌活性和高溶血性。人體防御素（HNP）不具有溶血活性，是人先天免疫系統(tǒng)抵御病原入侵時產(chǎn)生多肽，在中性粒細胞中被發(fā)現(xiàn)。利用生物信息方法預(yù)測和分析，將蜂毒素C端的15個氨基酸與人體防御素（HNP-1）作為母體肽雜合，設(shè)計雜合肽Me-HNP1，并在畢赤酵母中表達，抑菌試驗表明，雜合肽對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抑菌效果均優(yōu)于母肽，同時降低了溶血性[37]。張宏剛等[38]將蜂毒素（Melittin）與貽貝素B（Mytilin-B）的核心功能序列雜合，利用SOE方法獲得雜合抗菌肽Mel-MytB，抗菌結(jié)果表明，該雜合肽對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腸道沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、枯草芽孢桿菌均表現(xiàn)出抑菌活性。

由此可見，將不同來源抗菌肽的活性區(qū)域雜合，獲得雜合抗菌肽，提高了抑菌活性，降低了溶血性。

3.3 AMPs重新設(shè)計

以抗菌肽數(shù)據(jù)庫為模板，重頭設(shè)計全新抗菌肽，經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對，確認無相似性的改造抗菌肽。目前，重新設(shè)計抗菌肽在人類抗腫瘤細胞研究較多。利用抗菌肽對抗腫瘤細胞靶標機理，可重新設(shè)計抗菌肽。

據(jù)研究，根據(jù)天然宿主防御肽構(gòu)效關(guān)系，以天然LFcin為模板，重新設(shè)計獲得由5個陽離子殘基、2～3個色氨酸（Trp）殘基和1～2 親脂性非天然氨基酸殘基組成抗菌肽LTX-315。該肽對耐藥和藥物敏感的癌細胞都非常有效，而對正常細胞表現(xiàn)出較低的活性，有效避免了對機體正常細胞的毒副作用[39]。

Sylvie 等[40]研究發(fā)現(xiàn)，以陽離子兩親性基序為基礎(chǔ)設(shè)計多肽，通過改變賴氨酸（Lys）和亮氨酸（Leu）的數(shù)量制備了4～10 個殘基的環(huán)肽；引入谷氨酸（Glu）促進了環(huán)狀結(jié)構(gòu)的固相合成。測定對植物病原菌抑菌活性，結(jié)果表明，環(huán)化結(jié)構(gòu)顯著提高了多肽序列的抗菌活性，且具有偶數(shù)個殘基的多肽具有較高的抗菌活性。張衛(wèi)民等[41]研究以天然抗菌肽為模板重新設(shè)計獲得基因工程抗菌肽對腫瘤細胞的作用，結(jié)果表明基因工程抗菌肽較天然抗菌肽對腫瘤細胞的作用強，而對正常細胞無殺傷作用，為利用基因工程抗菌肽治療腫瘤疾病提供了新選擇，同時克服提取天然抗菌肽活性低且成本高的缺點。

4 小結(jié)與展望

抗菌肽在抗菌、抗病毒、抗寄生蟲、抗腫瘤細胞方面，表現(xiàn)出顯著效果，且特殊的抗菌途徑對動物機體不造成損傷，不產(chǎn)生耐藥性。因此，在食品生物防腐劑、畜牧養(yǎng)殖、人體抗腫瘤疾病等領(lǐng)域已開展了研究。隨著生物信息學技術(shù)的不斷發(fā)展，天然抗菌肽改造更準確、更便捷。天然抗菌肽分子改造，具有以下幾點優(yōu)勢：①提高抗菌肽的活性。天然抗菌肽序列存在冗余結(jié)構(gòu)區(qū)域，不但影響活性且易產(chǎn)生毒副作用。通過分子改造方法，可改變其肽鏈長度和空間結(jié)構(gòu)。②有針對性地結(jié)合病原體，有效治療疾病。在人類抗腫瘤疾病的研究中，抗菌肽可作為靶向藥物，直接作用于病原體。③提高表達量，為畜禽生產(chǎn)廣泛應(yīng)用提供途徑。利用基因工程手段，將分子改造后肽的堿基序列克隆到表達菌株中，可大量獲取目的抗菌肽。解決化學合成產(chǎn)量低，成本高的問題。由此可見，基于生物信息學技術(shù)，改造天然抗菌肽將成為發(fā)現(xiàn)更多活性強、毒性低、穩(wěn)定性好新型抗菌肽的有效手段。